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Appunti di neurochimica

Appunti di Neurochimica che sono basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni della prof.ssa Curti dell’università degli Studi di Pavia - Unipv, Facoltà di Scienze matematiche fisiche e naturali, Corso di laurea magistrale in neurobiologia . Scarica il file in formato PDF!

Esame di Neurochimica docente Prof. D. Curti

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degli anni '80 è stato possibile utilizzare dei coloranti fluorescenti che sono

delle fosfoproteine, come la equorina, oppure dei derivati di chelanti del

calcio, ad esempio il BAPTA, un derivato di EDTA ed EGTA, che

normalmente sii mettono nei tamponi quando si vogliono chelare,

rispettivamente, il calcio o il calcio e magnesio, e sono fluorescenti.

Uno dei coloranti che hanno permesso misure sperimentali precise e la

2+

formulazione di interpretazioni sul Ca è il FURA2. Infatti il FURA2 nella

forma acetossimetilestere ha una componente acetossimetile che gli

permette di permeare la membrana ed entrare nella cellula, in quanto

liposolubile.

Una volta che è entrato in cellula come acetossimetilestere viene

 tagliato dalle esterasi e si ritrasforma in FURA2, in cui è fluorescente.

Lega il calcio.

La possibilità di valutare in modo preciso le concentrazioni di calcio

dipendono dal fatto che il FURA libero e il FURA legato al calcio hanno un

massimo di lunghezza d'onda di eccitazione diverso. Quindi A è il FURA

legato al calcio e B è il FURA libero.

Qui abbiamo fluorescenza di eccitazione e

fluorescenza di emissione in rapporto con la

lunghezza d'onda.

Il FURA2 ha due possibilità di eccitazione negli

UV: A 340 e a 380nm.

Quando viene eccitato a 340nm si ha un picco di eccitazione del

 2+

FURA2 A legato al Ca , mentre si ha un minimo per il FURA2 B libero.

Quando eccito a 340nm risponde il FURA2 legato al calcio.

 La fluorescenza di emissione a 500 nm è questo picco, è

 2+

quello legato al Ca .

Quando invece eccito a 380 nm, ho un picco di eccitazione del

FURA2 B libero e un minimo del FURA2 A legato.

A questo punto seleziono o il FURA2 legato al calcio o il FURA2 libero e vado

a vedere l'emissione a 500: vedrò il picco che ho selezionato.

Quindi quando ho queste emissioni eccito a 340 e vedo l'emissione a

 500, eccito subito dopo a 380 e vedo l' emissione a 500.

Il rapporto fra A e B mi dà la variazione di calcio. 2+

Quindi, lo posso vedere in modo dinamico: vedo la quantità di Ca che

 ho di base, dopodiché dò uno stimolo e vedo come varia questo

rapporto.

Questo colorante è detto raziometrico perché con precisione mi può dare le

variazioni fra il calcio legato e quello libero.

Quando la cellula depolarizza Il calcio libero aumenta, quindi entra calcio

attraverso canali voltaggio-dipendenti: avrò un aumento del picco A e una

diminuzione del picco B. Ovviamente posso trasformare questo rapporto in

nanomoli facendo una calibrazione con una delle quantità di calcio note,

facendo una curva di taratura e una calibrazione con delle quantità note di

calcio.

Per questo il FURA2 è uno dei più usati tuttora utilizzato. In seguito sono stati

introdotti anche coloranti che possono essere geneticamente modificati nella

cellula come ad esempio le GFP. I geni di queste proteine possono essere

introdotti nel genoma sia in animali vivi sia in cellule e danno origine a

proteine che possono avere delle sensibilità diverse per il calcio, un'affinità

diversa a seconda che ci interessi un determinato distretto cellulare. Possono

contenere delle sequenze target che li indirizza in un particolare organello

subcellulare, ad esempio RE o membrana plasmatica, e vedere delle

variazioni in microdomini, in porzioni, in compartimenti della cellula del calcio.

Inoltre, con opportuni promotori posso farli esprimere soltanto in alcuni tipi

cellulari (es. in astrociti anziché nei neuroni).

Altri metodi diretti sono quelli usati nella elettrofisiologia, dove vengono

misurate le correnti di calcio con il patch clamp. L'abbiamo già visto che il

potenziale elettrochimico del calcio è più elevato tra tutti quelli dei vari ioni, e

questo porta come conseguenza che tutte le cellule tendono ad accumulare

spontaneamente calcio per la permeabilità della membrana per il calcio

aumenta.

Il calcio nelle cellule può entrare attraverso:

canali voltaggio-dipendenti

• canali recettore-dipendente

• sistemi capacitativi , cioè sistemi che hanno una segnalazione

• retrograda: uno svuotamento degli stores endocellulari porta a un

aumento dell'ingresso di calcio dall'esterno attraverso canali nella

membrana plasmatica. Fanno parte di questo sistema:

I transient receptor potential, TRP , canali per il calcio .

o Canali dipendenti dal pH

o C'è la possibilità, che avviene spesso in condizioni non

o fisiologiche, di inversione del trasportatore sodio-calcio: quando è

entrato tanto sodio nella cellula (-> permanentemente

depolarizzata), si ha un'inversione del trasportatore, per cui il

trasportatore porta sodio fuori.

Poi ci sono organelli endocellulari, che partecipano in modo importante alla

omeostasi del calcio, nelle sue dinamiche. Vedremo in particolare il RE,

mitocondri e diremo qualcosa sull'influenza del calcio sul trasporti nucleo-

citoplasma delle proteine, perché è un argomento abbastanza nuovo e il

trasporto nucleocitoplasmatico è coinvolto in modo importante in molte

patologie neurodegenerative.

I sistemi che estrudono il calcio dalla cellula sono molti:

2+

Ca -ATPasi, con alta affinità per il calcio e bassa capacità.

• Il trasportatore sodio-calcio , che ha bassa affinità per il calcio (entra in

• funzione con alte concentrazioni di calcio nella cellula) e alta capacità

(trasporta tanti ioni calcio).

I canali voltaggio-dipendenti per il calcio sono presenti su tutte le cellule

• eccitabili, nelle cellule endocrine e in coltura sono stati trovati anche

negli astrociti, ma non è sicuro che siano presenti. Si suddividono in

sottotipi che hanno caratteristiche cinetiche differenti, profilo

farmacologico differente e sono localizzati in regioni cellulari, in

compartimenti subcellulari, in cellule, in tessuti differenti. Sono

fortemente modulati dalla depolarizzazione, ma anche dalla

fosforilazione/defosforilazione.

Struttura base di un canale per il calcio.

È composto da diverse subunità: la α1 è la subunità principale, quella che da

sola contiene il sensore per il calcio. Poi ci sono l'α2, γ, δ e β che sono delle

subunità accessorie delle quali si sa un po’ meno, ma sono di importanza

fondamentale perché modulano l'attività del canale.

La subunità α1, come per tutti i canali voltaggio-dipendenti, presenta 4

domini, ognuno con 6STM e il sensore del voltaggio è

la porzione transmembrana 4, mentre la

porzione transmembrana 5 e 6 con il link

formano le pareti del poro e la pallina rossa indica il

residuo di glutammato che è essenziale per

2+

costituire il filtro di selettività per il Ca . Le zone

azzurre costituiscono la parete la parete del poro.

A seconda della cinetica di apertura si possono riconoscere quattro tipi di

2+

canali Ca :

low threshold o bassa soglia , detti anche transient o T perché hanno

• una cinetica di inattivazione molto veloce: possono essere

transientemente attivati anche ad un potenziale di riposo (-60/ -70mV).

high voltage , ad alta soglia di potenziale: non sono attivati

• normalmente prima di raggiungere –30 mV. Sono detti anche long

lasting per la cinetica di inattivazione più lenta, rimangono attivi più a

lungo ed i primi ad essere studiati sono stati quelli di tipo L, che sono

stati scoperti e studiati nel muscolo scheletrico, poi nel muscolo

cardiaco ed infine si è scoperto che sono presenti anche nei neuroni

quindi nei dendriti e in particolare nelle spine dendritiche in particolare.

Sono sensibili a dei farmaci che si chiamano diidropiridine. Quelli che si

trovano a livello cerebrale sono sensibili alle benzotiazepine, da non

confondere con le benzodiazepine che sono tutt'altra cosa.

Le benzotiazepine sono calcio-antagonisti: farmaci utilizzati per chi ha

disturbi cardiocircolatori e per diminuire gli effetti dell'ipertensione.

Però esistono dei canali che non sono inibiti attraverso i calcio-

• antagonisti, così hanno capito che esistevano altri canali che hanno

chiamati N-type. Questi canali hanno una corrente di singolo canale

che è intermedia tra i canali di tipo L (corrente elevata) e i canali

transient (corrente bassa). Sono presenti sia a livello cardiaco che a

livello neuronale.

P/Q ed R. Sono stati scoperti dopo e hanno delle caratteristiche simili

• agli L:

sono long lasting

o sono high voltage

o però non sono inibiti dai calcio-antagonisti, ma da tossine di

o serpente, di animali marini come il conus geograficus e attraverso

delle diverse neurotossine.

quindi con un profilo diverso dal punto di vista farmacologico

per cui si possono distinguere. Sono tutti canali neuronali.

N.B.: I P e Q non sono distinguibili per cui normalmente si

dice P/Q.

I canali T sono coinvolti nel controllare il pattern di scariche ripetitive. Infatti,

questi canali sono coinvolti in alcuni aspetti dell'epilessia, in particolare in un

tipo di epilessia che colpisce i bambini che si chiama Absence seizure, cioè le

assenze. Le assenze sono un tipo di epilessia completamente diverso perché

voi siete abituati ad associare l'epilessia con convulsioni, con espressioni

comportamentali di agitazione, di spasmi, invece, le assenze sono

caratteristiche nei bambini, sono dei momenti di assenza che non vengono

facilmente riconosciuti, perché sembra sovrappensiero, addormentato. Questi

momenti di assenza si possono riconoscere da un sonno normale perché non

può essere risvegliato e può portare a dei problemi di apprendimento. Ci

sono farmaci specifici che sono in grado di interagire con questi canali,

farmaci come tool che riconoscono i canali. Sono distribuiti in vari organi e ci

sono i bloccanti specifici, come il Diltiazem; sono tutti calcio-antagonisti, la

maggior parte utilizzati per l'ipertensione.

2+

I canali ligando dipendenti per il Ca sono detti anche ROCC, receptor operated calcium

channels:

• I più importanti sono i canali NMDA, attraverso cui il calcio può entrare in modo massiccio.

• + +

Ci sono poi i canali AMPA, attraverso i quali prevalentemente passano Na e K però un

2+

particolare tipo di assemblaggio delle subunità di questi canali li rende permeabile al Ca .

• Alcuni tipi di recettori colinergici, oltre a permettere il passaggio di sodio, possono

permettere anche quello del calcio.

• Poi c'è l'entrata di calcio attraverso il sistema capacitativo. Questo sistema è presente sia

nelle cellule eccitabili che in quelle non eccitabili e la sua alterazione o malfunzionamento è

alla base di diverse patologie.

Tra le malattie dovute ad alterazioni del sistema capacitivo c’è la SCID, sindrome da

immunodeficenza dell'uomo: non è attivo il sistema che risponde allo svuotamento degli store

endocellulari richiamanti calcio dall'esterno nei linfociti T. E’ una malattia che è stata

particolarmente studiata ed ha permesso di capire il funzionamento in parte di questo sistema.

Un modello più semplice è l'inibizione del riempimento degli store di calcio che si può ottenere con

2+

la tapsigargina: inibisce il flusso di Ca che riempie gli stores del RE e quindi mima una

distruzione di questo sistema. E’ stato visto in certi tipi di neuroblastoma umano che inibendo

refilling degli store la cellula va incontro a morte apoptotica, quindi ha una importanza

2+

fondamentale: siccome esistono dei sistemi di estrusione del Ca , la cellula va incontro ad una

2+

perdita di Ca che deve reintegrare per mantenere l'equilibrio.

Nelle cellule non eccitabili, quando un agonista si lega ad un recettore di membrana accoppiato a

2+ 2+

proteine G o Gq attiva la fosfolipasi C, la cui attività è Ca -dipendente: quando aumenta il Ca

aumenta l'attività della fosfolipasi C.

la fosfolipasi C idrolizza i fosfoinositidi di membrana dando origine a IP3 (inositolo

 trifosfato), che si lega al suo recettore presente a livello del RE. Questo recettore è un canale

2+ 2+

per il Ca e permette quindi la fuoriuscita di Ca nel citoplasma.

2+

Questa fuoriuscita stimola l'ingresso di Ca attraverso canali di membrana.

 E’ un sistema detto CICR (calcium induced calcium release), che induce il

sistema chiamato SOCE (store operated calcium entry), cioè lo svuotamento

degli store. 2+

Infatti, quando è uscito tanto Ca dal RE e quindi questo si è svuotato, arriva un messaggio che

2+

induce l'ingresso di Ca attraverso dei canali di membrana che poi produrrà il refilling

(riempimento) degli stores. Questo nelle cellule non eccitabili, quindi nelle cellule di tessuti, e negli

astrociti.

Nelle cellule eccitabili, oltre ad essere presente questo tipo di modalità, entrano in gioco i VDCC.

Una depolarizzazione che ne induca l'apertura porta ad un ingresso di calcio nella cellula

 che stimola direttamente un canale presente sul reticolo endoplasmatico, un canale sensibile

alla rianodina (ryanodine sensitive calcium channel), che è un alcaloide.

2+

L'apertura di questo canale permette l'uscita di Ca dal reticolo e induce il CICR, che attiva

 2+

l'ingresso di Ca nella cellula attraverso dei canali sulla membrana. 2+

Quindi la riduzione, lo svuotamento delle riserve di Ca nel reticolo

 2+

endoplasmatico richiama Ca nella cellula.

I canali che rispondono a questo segnale di svuotamento del RE e sono presenti sulla membrana

plasmatica sono detti CRACs (calcium release-activated calcium channels). Hanno una

conduttanza per il calcio che è 100 volte più lenta dei canali voltaggio-dipendenti. Vi sono poi

anche degli altri canali, TRP (Transient Receptor Potential channels), che in parte possono

2+

collaborare al meccanismo di SOCE e sono anche di per sé in grado di fare entrare Ca nella

cellula.

Inizialmente i ricercatori si sono chiesti: come avviene l'accoppiamento tra lo

svuotamento dell'ER (reticolo endoplasmatico) e l'apertura di canali CRACs?

Che cos'è che lega lo svuotamento del reticolo all'apertura dei canali di tipo

CRAC? Poteva essere:

un messaggero diffusibile (dal reticolo veniva rilasciato qualcos'altro

• insieme al calcio che era in grado di interagire con questi canali)

interazioni proteina-proteina: proteine del RE avrebbero potuto

• interagire con delle proteine presenti sulla membrana. Potevano essere

direttamente i canali CRAC o proteine intermedie che legavano il

CRAC.

Da che cosa sono partiti? Recentemente sono stati identificati sia i geni per il

sensore di calcio nel RE sia quelli che codificano per i canali CRAC, in uno

studio del 2007, “molecular choreography store operated calcium channel”. I

ricercatori sono partiti dagli studi sulla SCID e collegavano l'impossibilità di

riempire gli store ai problemi di immunodeficienza.

Vedevano che in questi linfociti la deplezione degli store endocellulari di

 2+

Ca non era in grado di comunicare ai canali CRAC di aprirsi e di

2+

indurre l'ingresso di Ca che avrebbe riempito gli store.

Hanno utilizzato delle linee cellulari di Drosophila perché semplici da

utilizzare, conoscevano i diversi geni e hanno utilizzato degli RNA silenzianti

(?  RNAi??) per cercare di sopprimere il meccanismo capacitativo.

Utilizzando RNA silenzianti contro i diversi geni di queste cellule e

 hanno identificato un gene che hanno chiamato Orai1 che se veniva

silenziato era in grado di provocare il disaccoppiamento tra lo

svuotamento degli store e il refilling

Interrompeva la comunicazione con i canali CRAC.

Per questo sono risaliti a quello che era l'omologo umano del gene Orai1 di

Drosophila. L'omologo umano è stato chiamato CRACm1 e hanno scoperto

che il gene Orai1 omologo CRACm1 codifica per una proteina della

membrana plasmatica di 33kD che non ha omologia con altre proteine

canale. La mutazione genica che porta a SCID è una mutazione puntiforme di

questo gene. Per dimostrare ciò che hanno scoperto, hanno introdotto nei

linfociti T di pazienti SCID il gene wild type, cioè Orai1/CRACm1 senza la

mutazione, e hanno visto che veniva ripristinato lo store operated calcium

entry. La SCID dipendeva da una mutazione dei canali CRAC.

Studi di mutagenesi sito-specifica hanno portato alla conclusione che i canali

CRAC possono esistere come multimeri.

Quindi possono formare dei cluster, dei gruppi, aumentano di

 dimensioni, si espandono.

Questi multimeri possono essere formati da differenti unità di Orai1 e

CRACm1 o da combinazioni di Orai1/CRACm1 con delle isoforme come

Orai2, Orai3 e altre che derivano da splicing alternativi.

Qui sono riportate almeno tre delle isoforme di Orai1 e si

nota che Orai1 e CRAC sono molto simili. Presenta 4

domini transmembrana e sia l’N-terminale che il C

terminale sono citoplasmatici. Queste 3 isoforme differiscono nella lunghezza

della parte N-terminale e nel fatto che la parte C-terminale sia più o meno

facilmente localizzabile nel citoplasma. Orai3 presenta questa zona più

grande. 2+

Col tempo hanno anche scoperto qual era il sensore del Ca nel RE. Infatti,

chi dice all’RE di svuotarsi? Ci deve essere un sensore in grado di

2+

riconoscere le concentrazioni di Ca .

2+

Per cui se diminuisce [Ca ] questa sonda lo deve sentire e segnalare.

Hanno scoperto che questo sensore era una proteina chiamata STIM

(Stromal Interaction Molecule) , di cui esistono due isoforme: STIM1 e

STIM2.

STIM1 e STIM2 hanno piccole differenze anche di affinità

2+

per il Ca . STIM è una proteina RE e presenta una zona

2+

con una sequenza, detta IFN, che riconosce il Ca : è un sensore presente in

2+

tutte le proteine in grado di sentire le concentrazioni di Ca . La porzione C-

terminale è rivolta verso il citosol, quella N-terminale verso il lume del reticolo

endoplasmatico. 2+

In vitro anche STIM forma dimeri e multimeri quando viene rimosso il Ca .

Quindi sia Orai1 che STIM formano multimeri.

 2+

Quando diminuisce il Ca ed è il momento di segnalare a CRAC che è

 2+

necessario aprirsi per permettere un ingresso di Ca , STIM può formare

dimeri e multimeri.

Ora, tra la membrana plasmatica e la membrana del RE, quando sono

giustapposte, c'è un gap di circa 10-25nm.

Se questi formano dei multimeri è possibile che vengano a contatto!

Hanno visto che nelle cellule a riposo abbiamo STIM disperso nella

2+

membrana del reticolo, dove la IFN rileva le concentrazioni di Ca , e CRAC

presente nella membrana. Quando viene promosso lo svuotamento degli

2+

stores (non c'è Ca negli stores) sia STIM che CRAC clusterizzano, cioè si

dispongono vicini, formano gruppi, formano questi dimeri, multimeri nelle

zone di contatto e questa vicinanza fisica promuove l'apertura dei canali

CRAC e l'ingresso di calcio che poi servirà per il refilling degli store.

Quindi sembra che sia un'interazione diretta tra STIM e Orai1, quando

 formano dei complessi multiproteici, a generare questo messaggio.

Anche in questo caso è stato fatto un esperimento utilizzando uno STIM

modificato: è stata introdotta una mutazione nella porzione IFN di STIM, che

2+

normalmente è in grado di riconoscere le [Ca ]. Questa mutazione portava

ad una riduzione dell'affinità di STIM per il calcio.

Anche se il calcio era presente STIM non era in grado di rilevarlo e

 questo mimava una assenza di calcio negli stores.

STIM si ridistribuiva spontaneamente in gruppetti ed innescava

 l'ingresso di calcio attraverso lo store operated calcium entry.

Il fatto che si formino dei cluster, delle zone di giustapposizione tra le

membrane, circoscrive i processi in zone discrete della cellula e questo fa sì

che vengano selezionate, attraverso l'ingresso di calcio, alcune vie di

processamento e non altre. Una diffusione generalizzata porterebbe ad una

attivazione generalizzata di tutti i processi calcio-dipendenti. Invece, così no!

In quelle zone ci sono delle particolari proteine (adenilato ciclasi, NOS...) che

vengono selettivamente attivate dai processi che riguardano quei

microdomini.

Canali TRP

I canali TRP normalmente sono dei canali non selettivi per i cationi.

Quindi attraverso questi canali passano calcio, potassio e sodio.

La proteina che ha dato il nome a questa superfamiglia è stata identificata per

la prima volta in un mutante di Drosophila. Oggi ne sono stati scoperti

tantissimi, ce ne sono almeno 6 sottofamiglie: TRPc (canonical), TRPm,

TRPa... Sono stimolati da stimoli fisici (variazioni di temperatura, pressione) e

anche questi sono integratori dei segnali cellulari con un ruolo importante in

condizioni sia fisiologiche che patologiche.

I più studiati son due canali della famiglia della statina, TRPm7 e TRPm2,che

possono formare eterodimeri. Si sa che questi canali partecipano a

meccanismi che portano alla morte cellulare mediata da stress ossidativo.

Sono importanti in ischemia e per questo sono stati particolarmente

 studiati.

Anche i canali di tipo TRPc sono stati studiati perché sono legati ai sistemi

capacitativi.

I canali di tipo TRP presentano 6STM e sia l'N che il C terminale sono

citosolici. TRPm7 ha una duplice funzione: di canale e enzimatica (di proteina

chinasi).

Questo è un modello di come possono essere attivati nell'ischemia cerebrale.

Durante la fase iniziale di un attacco ischemico si ha un incremento di

glutammato extracellulare che attiva i recettori NMDA.

Quindi si ha un influsso di calcio nella cellula.

Questo stimola selettivamente la proteina PSD95, che è localizzata proprio lì,

una proteina che lega sia il canale che la NOS.

2+

Quindi l'ingresso di Ca attraverso questo canale influisce direttamente

 sulla NOS.

La NOS produce NO, quindi è la proteina che produce più ROS ed è attivata

dal calcio che entra attraverso i canali NMDA.

ROS e NO interagiscono e viene prodotto perossinitrito, che va ad

 attivare i canali TRPm7 la cui apertura porta ad un ingresso amplificato

2+

di Ca .

Si passa da citotossicità a stress ossidativo, processi infiammatori,

 ischemia...

Sembra che i canali TRPc siano particolarmente legati in diversi tipi di cellule

al SOCE in diversi tipi di cellule e, secondo il modello che è stato proposto, in

condizioni di riposo legherebbero i canali CRAC (non tutti i canali CRAC, ma

una parte) e legati sarebbero inattivi. Quando interviene una stimolazione,

rapidamente cambia l'affinità di Orai 1 per TRPc e si staccano.

Staccandosi, TRPc diventa un canale non selettivo.

 Passano calcio, sodio e potassio.

Questo canale però avrebbe affinità per Orai1 legato a STIM.

Quindi si formerebbe un complesso che indurrebbe una entrata di

 calcio selettiva attraverso i canali TRPc.

Regolazione dell’estrusione di Ca2+

2+ 2+

L'estrusione del Ca avviene attraverso le Ca -ATPasi di membrana e

+ 2+

attraverso l'antiporto Na -Ca .

2+ 2+

La Ca -ATPasi estrude uno ione Ca per molecola di ATP. Ha un'affinità

molto elevata per il calcio, 100-200 nM (100 nM in condizioni di riposo, quindi

2+

già in condizioni di riposo la Ca -ATPasi è in grado di estrudere calcio), e ha

una bassa capacità.

2+

L'attività della Ca -ATPasi è modulata dalla calmodulina, una proteina

2+

sensore del Ca che può legarsi ad alcune proteine per attivarle quando

2+

legano Ca . 2+

Quando la concentrazione di Ca aumenta nella cellula, la calmodulina

 2+

legandosi al Ca acquista affinità per proteine diverse e può modularne

l'attività.

In alcuni tipi di proteine la calmodulina è già legata stabilmente alla proteina

2+ 2+

stessa. Quando aumenta la [Ca ] citosolica, il complesso Ca -calmodulina si

2+

lega al sito regolatorio della Ca -ATPasi e può aumentarne la V di 20-30

max

volte. Sono presenti almeno 3 isoforme nel cervello ed è evidente che la

2+

Ca -ATPasi è importante in condizioni di riposo o in condizioni fisiologiche,

2+

quando non ci sono concentrazioni particolarmente elevate di Ca nella

cellula.

Quando aumentano le concentrazioni citosoliche di calcio interviene lo

+ 2+

scambiatore Na -Ca . Ce ne sono almeno 3 isoforme espresse nel cervello:

NCX1 ed NCX3 sono quelle comuni nei neuroni, mentre NCX2 nella glia. Lo

2+ 2+

scambiatore ha affinità per il Ca minore rispetto a quella della Ca -ATPasi,

però ha una capacità di trasporto molto più elevata: può rimuovere 10 volte

2+

più velocemente il calcio citoplasmatico rispetto alla Ca -ATPasi. Questo

2+ +

scambiatore è elettrogenico: scambia 1 Ca con 3 ioni Na .

Questa carica in più permette di controbilanciare lo squilibrio

 2+

elettrochimico perché il gradiente di Ca è più ripido rispetto a quello

+

del Na .

Quindi è necessaria più energia, anche se in modo indiretto,

 perché riesca a scambiare

+ 2+

il Na con il Ca .

2+

Qui c'è un esempio di quello che avviene per la Ca -ATPasi quando la

2+

calmodulina si attiva e si lega al sito regolatorio della Ca -ATPasi stessa,

aumentandone l'attività. +

Attenzione! Se diminuisce il gradiente di Na nella cellula diventa più difficile

2+

per il trasportatore assumere Ca , a meno che non ci sia energia

sufficiente.

E se viene a mancare l'energia succede che la cellula rimane

permanentemente depolarizzata... +

Si hanno delle concentrazioni molto elevate di Na

nella cellula e in questo caso lo scambiatore si può invertire e

2+ +

può trasportare Ca all'interno e Na all'esterno. Infatti non

2+

c'è più la driving force che permette il trasporto di Ca

all'esterno!

Un’eccezione riguardo l’integrazione tra l'attività della membrana e quella

degli altri organelli subcellulari (ER, Golgi, mitocondri e nucleo) è

rappresentata dal globulo rosso. In tutte le cellule, quello che avviene nella

2+

membrana circa gli scambi di Ca si integra con gli altri organelli: l'omeostasi

comprende tutto. I globuli rossi però non hanno né nucleo, né mitocondri.

2+

La segregazione anche transitoria del Ca serve nell'ER per ripiegare in

modo corretto le proteine, nel Golgi per l'assemblaggio della matrice dei

granuli di secrezione, nel nucleo per controllo della trascrizione, attivazione

ed espressione genica e anche per il trasporto delle proteine tra nucleo e

citoplasma, nei mitocondri per l’attivazione del Ciclo di Krebs. Queste sono

alcune delle funzioni che svolge fisiologicamente il calcio in questi organelli.

2+

Nel’ER la presenza di Ca ha funzione di chaperon nel folding delle proteine

2+

e di tamponamento degli aumenti di Ca citosolico, perché i mitocondri e ER

2+

sono i maggiori raccoglitori di Ca dal citosol: i mitocondri in modo più

dinamico, il reticolo endoplasmatico perché mantiene gli stores. Il refilling

2+

degli stores libera il Ca nel citoplasma. Inoltre è importante per l’attivazione

dei processi fisiologici di trasduzione del segnale attraverso il SOCE.

Nell’ER possono essere presenti delle zone specializzate che permettono lo

2+

scambio del Ca , come nel reticolo sarcoplasmatico e nei calciosomi.

Calciosoma = regione del reticolo endoplasmatico dove sono concentrati i

2+

sistemi di rilascio e ricaptazione del Ca .

La ricaptazione, e quindi il refilling e riempimento degli stores, è mediata da

2+ 2+

una Ca -ATPasi diversa rispetto alla Ca -ATPasi presente sulla membrana

plasmatica ed è detta ATPasi SERCA (sarcoplasmic endoplasmic

reticulum calcium ATPasi). Queste ATPasi hanno una stechiometria

2+

diversa. Infatti, mentre la Ca -ATPasi della membrana plasmatica scambiava

2+ 2+

Ca idrolizzando ATP per estrudere uno ione Ca , qui l'idrolisi dell'ATP porta

all'ingresso nell’ER di due ioni calcio.

Sono presenti diverse isoforme. Il loro inibitore specifico è la tapsigargina ed

è stato utilizzato moltissimo per studiare gli effetti di svuotamento del reticolo

e la possibilità di refilling degli stores. La tapsigargina non è l’unico inibitore di

questa ATPasi: c’è anche l'acido ciclopiazonico e altri ancora che permettono

di studiare lo stress dell’ER e i suoi effetti. Questo è importante perché lo

stress dell’ER è una componente di moltissime patologie in cui si ha un

misfolding proteico. Ad esempio nella SLA, quando si ha una mutazione della

SOD1, questa può avere un ripiegamento incorretto e si deposita portando

alla formazione di aggregati che creano uno stress dell’ER. La tapsigargina

mima questa condizione, che si è riscontrata in questa come in altre

patologie. Infatti, un misfolding proteico che porta alla formazione di aggregati

è presente in molte malattie, come Alzheimer e Parkinson.

La tapsigargina si lega in questa zona transmembrana, vicino dove si lega il

calcio:

Tutte le cellule (ed anche i neuroni) esprimono alti livelli di proteine che sono

2+

presenti nell'ER e che sono in grado di legare il Ca . Queste proteine

2+

permettono di immagazzinare grandi quantità di Ca nel reticolo ed hanno

delle caratteristiche particolari: hanno bassa affinità per il calcio, ma alta

capacità. Perché? Perché devono essere in grado di mantenerlo in grandi

quantità, ma devono essere anche in grado di rilasciarlo in modo dinamico

facilmente. Lo legano quando è in grandi concentrazioni e devono

mantenerne tanto. Legandosi a queste proteine, non varia la pressione

osmotica.

Nel reticolo sarcoplasmatico, nel muscolo, è presente la calsequestrina, 2+

invece nelle cellule non muscolari è presente la calreticulina. Nell’ER il Ca

2+

totale ha una concentrazione elevatissima: 50-100mM, ma il Ca libero non è

molto elevato è 0.1-1mM.

Quindi il calcio libero è sempre mantenuto a concentrazioni molto basse

 anche all'interno degli organelli (sempre intorno a 100 nM).

2+

Rilascio di Ca dall’ER attraverso i recettori per IP3

2+

Vediamo meglio come avviene il rilascio di Ca dal reticolo attraverso

recettori dell'IP3.

L'IP3 viene generato dalla idrolisi dei fosfoinositidi e va a interagire con un

recettore canale che si trova sulla membrana dell’ER. Questo recettore per

l'IP3 è formato da 4 subunità. Ciascuna presenta un N-terminale

citoplasmatico, un sito di legame per il calcio e più siti di legame per l'ATP.

Perché il canale si apra IP3 deve legarsi a tutte e 4 le subunità: sono 2+

necessarie 4 molecole di IP3 perché il recettore si apra e lasci uscire il Ca

dall’ER.

Il recettore dell'IP3 è presente in diverse isoforme, di cui

almeno 3 sono state identificate con un 60-80% di

omologia, poi ce ne sono altri derivanti da splicing alternativi.

2+

È modulato dal Ca , dall'ATP, dalla fosforilazione,

dall'acido arachidonico, dall'eparina... Insomma, da

moltissime sostanze. Inoltre, queste diverse isoforme

hanno un'affinità diversa per l'IP3 e sono localizzate anche in zone e in

organelli diversi, in cellule diverse e rispondono anche a diverse

2+

concentrazioni di Ca e ad esigenze diverse della cellula.

In particolare, il recettore IP3-1 ha una regolazione bifasica, a campana.

E sembra che questo tipo di curva sia ideale per supportare oscillazioni di

2+

Ca . La presenza di questo recettore sarà importante in quelle cellule dove è

 molto importante la comunicazione dovuta ad oscillazioni di calcio,

come negli astrociti.

La sensibilità delle altre isoforme è meno chiara. Circa l'IP3-3, le

caratteristiche di attivazione fanno pensare che sia in grado di iniziare un

2+

segnale invece di produrre un'oscillazione del Ca .

2+

Il Ca da solo, senza IP3, non è in grado di aprire il canale recettore, però in

presenza di IP3 aumenta la possibilità di apertura del canale a seconda delle

modalità specifiche. Vedete una curva a

campana di regolazione, sempre in presenza di

2+ 2+

IP3: a basse [Ca ], il Ca non ha un grande

2+ 2+

effetto sul rilascio di Ca dovuto a IP3, ma quando aumenta [Ca ] (intorno a

400nM, una concentrazione di calcio che si raggiunge in una condizioni

fisiologiche) si arriva a un picco.

2+

Una [Ca ]=400nM aumenta la probabilità di apertura del canale!

 2+

Aumentando la concentrazione di Ca per valori superiori al micromolare,

2+

l'effetto del Ca diminuisce: non è più in grado di aumentare la probabilità di

apertura del canale. E’ un sofisticato sistema di autoregolazione: quando

2+ 2+

aumenta troppo la[Ca ] viene inibito il rilascio del Ca dallo store.

Ci sono delle zone specializzate del ER, alcune ricche di proteine che permettono l'ingresso di

calcio (SERCA) e di recettori IP3, altre invece presentano solo recettori per l'IP3 ma sono prive di

proteine calcio leganti e di SERCA (ad esempio nelle cellule cerebellari del Purkinje). È stato

osservato che la sovraespressione dell'IP3 nei fibroblasti porta alla formazione di cisterne che

contengono questi recettori simili a quelle osservate nei neuroni di Purkinje. Ci si è chiesti come

mai esistono queste zone ricche di recettori per l'IP3 e non contenenti le altre proteine che servono a

questo meccanismo.

Si è pensato che queste zone possano servire come depositi di recettori, oppure possano

 servire da tampone, quando sia necessario del calcio citoplasmatico, ma non si è ancora

riusciti a dare una spiegazione a questo fatto.

2+

Canali ionici attivati dal Ca e sensibili alla rianodina

La rianodina impedisce la chiusura del canale. Il canale è un omotetramero.

Questi canali sono stati studiati inizialmente soprattutto nel muscolo

scheletrico, poi nel muscolo cardiaco e infine è stato scoperto che sono

presenti anche a livello cerebrale, nei neuroni.

In particolare, nel muscolo scheletrico la porzione citosolica di questi canali,

che sono proteine integrali presenti nella membrana del reticolo

endoplasmatico, è a contatto diretto con il sensore del voltaggio di canali per

il calcio voltaggio-dipendenti (VDCC).

Tubuli T = invaginazioni della membrana plasmatica delle fibrocellule muscolari nella giunzione

neuromuscolare.

A livello dei tubuli T sono presenti dei canali VDCC e anche dei canali

+

per il Na . Questi canali VDCC sono giustapposti a canali sensibili alla rianodina nella membrana

del reticolo sarcoplasmatico.

Quando la membrana plasmatica è depolarizzata, la depolarizzazione tramite il tubulo T

 2+

attiva i VDCC, senza che necessariamente il Ca entri attraverso questi canali. Siccome

sono giustapposti ai canali sensibili alla rianodina, questo impulso viene trasmesso loro e

2+

porta all'apertura dei canali rianodina sensibili per il Ca !

2+

Tutto questo senza che necessariamente il Ca funga da intermediario. La giustapposizione

trasmette il segnale di depolarizzazione, che viene tradotto dai canali rianodina sensibili in

2+

un'apertura del canale e uscita di Ca .

C'è un legame fisico tra canali voltaggio-dipendenti presenti sulla membrana

e i canali rianodina sensibili presenti sul reticolo endoplasmatico.

la depolarizzazione della membrana trasmette da sola fisicamente il

 segnale ai canali rianodina sensibili, che si aprono senza che

2+

necessariamente il Ca entri attraverso il canale. Questi canali sono

canali di tipo L. 2+ 2+

Nel cuore invece il flusso di Ca extracellulare attraverso il canale per il Ca

è necessario per indurre il canale rianodina sensibile. Infatti, nel cuore non

c'è un legame fisico: Il VDCC non è legato al recettore per la rianodina, quindi

la depolarizzazione non è sufficiente a trasmettere il segnale di apertura al

canale rianodina sensibile! 2+

Quindi è necessario che entri il Ca .

 La depolarizzazione porta ad una apertura del VDCC.

 2+

Entra Ca , che porta all'apertura del canale rianodina

 2+

sensibile, che poi permette l'efflusso di Ca dall’ER.

Nel cervello si pensa che avvenga la stessa cosa: che non sia un'interazione

2+

diretta, ma che sia il Ca stesso a modulare il canale rianodina sensibile

attraverso il calcium induced calcium release.

I mitocondri

Abbiamo detto che mitocondri, ER e nucleo sono i più importanti organelli dove avvengono lo

2+

scambio dinamico e l’immagazzinamento del Ca .

2+ 2+

I Mitocondri possono sia captare il Ca che immagazzinarlo, quindi fare sia da tampone del Ca

2+ 2+

che rilasciarlo. A riposo il contenuto totale di Ca è 0.5-1mM però il Ca libero è 100-200 nM,

quindi non è molto diverso rispetto ai valori che si trovano nel citoplasma. La forza trainante

2+

(Driving Force) per trasportare il Ca all’interno dei mitocondri è il potenziale transmembrana, e

quello mitocondriale è molto negativo. Nei mitocondri isolati si possono trovare dei potenziali

inferiori a -200/-180mV. Si suppone che in vivo questi siano lievemente più contenuti. In ogni

caso, generalmente per “mitocondri energizzati”, cioè i mitocondri che funzionano bene, si

intendono quei mitocondri che hanno V ≤-80mV.

m 2+

Il JC-1 è una carbocianina, un colorante potenziometrico per cariche positive come il Ca che viene

captato dai mitocondri a seconda del loro potenziale e ha una singola eccitazione, nel senso che

viene eccitato a 488nm (come il FITC), ma ha due possibili emissioni: il JC-1 monomerico emette a

527nm, quindi nel verde, mentre quando si accumula in mitocondri energizzati, più i mitocondri

sono energizzati, più il JC-1 si aggrega; gli aggregati emettono a 590 nm, cioè nel rosso. Siccome è

un colorante vitale posso caricare con questo colorante delle cellule vive e così avere un’idea dello

stato energetico dei mitocondri. Lo stato energetico si può calcolare dal rapporto

fluorescenzanel rosso . Così si possono anche osservare delle variazioni di potenziale nei

fluorescenza nel verde

mitocondri e dove avviene questa variazione regionalmente, in seguito a stimoli di varia natura.

Più in generale, la forza trainante o energia potenziale disponibile per riportare gli idrogenioni

all’interno della matrice mitocondriale dopo che sono stati espulsi attraverso la fosforilazione

ossidativa e che quindi serve per produrre energia, ATP, viene detta forza protonmotrice. Essa è

indice dell’energia potenziale disponibile per guidare i protoni nella matrice mitocondriale, e fornire

l’ATP necessario per i processi biologicamente utili. Si esprime in mV e la formula generale a 37°C

è: PMF=ψ−60 pH

Dove:

• Il -60 deriva dalla costante dei gas, dalla temperatura assoluta e dalla costante di Faraday,

che indica il trasporto di elettroni;

• ψ è il potenziale transmembrana;

• pH è la differenza di pH tra la matrice mitocondriale e il citosol;

La componente che incide di più sulla forza protonmotrice è il gradiente elettrochimico, cioè il

potenziale transmembrana ψ.

2+

La possibilità che Ca entri nei mitocondri e che esistano sistemi di captazione e di efflusso fa sì

2+

che ci sia un “Calcium Cycling”, cioè un ciclaggio di Ca , nei mitocondri. Questo è molto

2+ 2+

importante perché il ciclaccio di Ca nei mitocondri va di pari passo con le variazioni di Ca

citosolico, per cui è una continua informazione che viene data sulle necessità energetiche della

cellula. 2+

Le variazioni di Ca , e quindi dell’attività della cellula, che si verificano nel citoplasma vengono

trasmesse attraverso il Calcium Cycling direttamente ai mitocondri, che produrranno più o meno

ATP a seconda delle necessità. 2+

A livello della fosforilazione ossidativa il Ca è in grado , oltre che di attivare le deidrogenasi del

ciclo di Krebs e quindi il metabolismo mitocondriale, anche di agire direttamente sullo stato

fosforilativo dei componenti della catena di trasferimento elettronico mitocondriale. Questo è valido

2+

per i complessi I, II, III e IV citocromo ossidasi ed anche per l’ATP sintetasi. Infatti, il Ca provoca

una defosforilazione di questi complessi.

Quindi è in grado di attivarli, perché i complessi defosforilati sono più attivi.

 Quindi attiva direttamente, attraverso la defosforilazione, anche l’attività

mitocondriale.

Il principale sistema di captazione è una proteina con le caratteristiche e il profilo farmacologico

2+

dell’uniporter, ma nella forma di un canale con bassa affinità per il Ca . Questo aveva suscitato non

2+

pochi problemi ai ricercatori. Perché questo canale aveva bassa affinità per il Ca ? I ricercatori si

2+

erano accorti che in realtà in vitro i mitocondri erano in grado di captare molto Ca , ma questo non

2+

quadrava con il fatto che in realtà l’attività dell’uniporter era bassa. Il Ca viene captato quando la

concentrazione nel microambiente del trasportatore supera 0.5 μM, e questo aveva portato per un

periodo di tempo a pensare che in realtà i mitocondri non fossero cosi importanti nella

2+

partecipazione alle dinamiche del Ca cellulare.

2+

L’uniporter può trasportare non solo Ca , ma anche diversi cationi bivalenti, tranne il magnesio.

Mentre gli altri cationi bivalenti possono essere degli inibitori competitivi perché competono

 2+

con il Ca , il magnesio no.

La V supera 1400nM/(mg di proteina) al minuto, la K apparente è 10M.

M

max

La K è alta!

 M 2+

La concentrazione di Ca deve essere elevata, superiore a 0.5 M se no non può essere

 trasportato.

2+ 2+

Il Ca stesso è il più importante attivatore perché un aumento di Ca può modificare la cinetica del

trasporto e portarla da una curva sigmoide ad una iperbolica, aumentando quindi notevolmente il

2+

trasporto di Ca . Poi vi sono delle sostanze come le poliamine, che sono attive su diversi canali

come NMDA, attivano gli uniporter. Ci sono degli inibitori selettivi che sono derivati dal rutenio,

come il Rosso Rutenio, che ha un colore vinaccia ed è poco liposolubile.

Il Magnesio non è trasportato dall’uniporter ma si lega ad un sito regolatorio ed ha effetto opposto a

2+

quello del Ca : nel range di concentrazione millimolare, che poi è il range che si trova

normalmente nel liquido extracellulare, modifica la cinetica di trasporto da iperbolica a sigmoide.

2+

Decrementa la quantità di Ca che può essere trasportata e alza la K apparente da 10 a

 M

50μM.

Il trasportatore è stato solo recentemente isolato (articolo su Nature del 2011) da un gruppo di

ricercatori che fa capo a Rosario Rizzato, ricercatore italiano, ed è stata chiamata MCU

(Mitochondrial Calcium Uniporter). E’ stato visto che questa proteina pesa circa 40KD, è presente

sulla membrana interna dei mitocondri e risponde alle caratteristiche dell’uniporter che erano state

trovate in vitro prima di isolarla. E’ stato osservato che silenziando attraverso l’utilizzo di RNA

2+

inibitore l’MCU in cellule HeLa viene ridotta marcatamente la captazione di Ca . E’ stato visto che

se viene sovraespressa questa proteina riconosciuta come uniporter raddoppia l’incremento del

2+

trasporto di Ca .

Un mutante in cui vengono sostituiti due residui con carica negativa nella regione che forma la

bocca del poro non ha più attività di canale. 2+

Non è in grado di promuovere l’aumento della captazione di Ca in seguito ad un

 2+

incremento del Ca a livello citoplasmatico.

Quindi una volta che hanno isolato la proteina si sono accertati che questa corrispondesse

effettivamente all’uniporter e quindi avesse tutte le caratteristiche che erano state attribuite nel

tempo all’uniporter.

MCU è stata poi sequenziata in molte specie e anche nell’uomo ed è stato visto che presenta due

segmenti putativamente transmembrana e che ha un’elevata omologia di sequenza in tutte le specie,

cioè è molto conservata: è effettivamente una proteina di estrema importanza.

2+

Mentre la captazione di Ca nei mitocondri avviene rapidamente, il suo efflusso è un processo più

+ 2+ + 2+

lento e avviene tramite un antiporter, uno scambiatore Na /Ca . Lo scambiatore Na /Ca è attivo

2+

soprattutto nelle cellule eccitabili; invece negli altri tipi di cellule partecipa all’esclusione del Ca

2+ + 2+

uno scambiatore Ca /H . Questi scambiatori ovviamente estrudono il Ca dalla matrice

mitocondriale. 2+

Quindi permettono un ritorno ai valori basali di circa 100-200 nM dopo che il Ca è entrato

 nella matrice.

Lo scambiatore è arricchito soprattutto nelle creste mitocondriali e può trasportare anche dei cationi

+ +

monovalenti come Na e Li . E’ stato osservato come la sovraespressione dello scambiatore sia in

2+ 2+

grado di aumentare l’efflusso di Ca e come il silenziamento riduca l’efflusso di Ca .

2+

Perché è necessario che l’efflusso di Ca sia un processo lento?

2+ 2+

Abbiamo detto che il Ca viene captato dai mitocondri quando aumentano le [Ca ] citosoliche, a

due scopi:

1) Quando questi valori sono transienti e rientrano nell’ambito del fisiologico, perché

viene data l’informazione di quello che è necessario dal punto di vista energetico.

2) Quando le concentrazioni aumentano in modo intenso, serve a fare una clearance del

2+

Ca , a fare in modo che non aumenti troppo nel citosol perché può attivare processi distruttivi

nella cellula.

Quindi l’efflusso è necessario che sia un processo lento perché non deve variare le

 2+ 2+

concentrazioni citosoliche di Ca : i mitocondri devono liberarsi del Ca ma in modo

lento per non causare un segnale.

In esperimenti in vitro con mitocondri isolati (quindi non è detto che sia la stessa cosa in vivo) è che

2+

il Ca libero aumenta linearmente nella matrice mitocondriale.

2+

Quindi all’aumentare del Ca citosolico si ha un aumento anche nella matrice.

Nei mitocondri cerebrali di ratto questo avviene fino ad una certa soglia, e questa soglia è presente

per tutti i mitocondri. Nel caso dei mitocondri cerebrali di ratto si è visto che la concentrazione di

2+ 2+

Ca aumenta linearmente fino a 10nM di Ca /(mg di proteina), però non è detto che nei mitocondri

cerebrali di topo sia lo stesso identico valore, come non è detto che lo sia nei mitocondri di altri

2+

organi. Ciò che è importante è che il Ca libero nei mitocondri aumenta linearmente fino ad una

2+

certa soglia, ma al di sopra di quella soglia, anche se aumenta il Ca citosolico, non aumenta più

2+

quello libero nei mitocondri. Questo succede perché oltre una certa soglia il Ca viene

immagazzinato cioè forma dei complessi osmoticamente inattivi con il fosfato.

2+ 2+

Questo dimostra che i mitocondri oltre a captare il Ca possono fare da tampone del Ca

 quando questo aumenta troppo nel citosol

Sono in grado di captarlo, però cercando di difendersi da queste elevate

 2+ 2+

concentrazioni di Ca , perché è chiaro che non può aumentare a dismisura il Ca nella

matrice mitocondriale senza causare danno!

Quindi fino ad una certa soglia aumenta, dopodiché viene reso inattivo con la

formazione di questi complessi osmoticamente inattivi.

2+ 43-

Quindi il surplus di Ca forma ortofosfati (cioè legano il PO ), che

possono essere più o meno solubili. In vitro sono molto poco solubili, si

suppone che in vivo la possibilità di solubilizzare questi complessi da parte dei

mitocondri sia più attiva, più veloce. 2+

I mitocondri non sono solo un sensore delle variazioni di Ca , che cambiano attività in base

 2+

ad esse, ma sono anche in grado di svolgere una funzione di tampone e store del Ca stesso.

I mitocondri accumulano fosfato a spese del gradiente di pH.

2+

Il Ca viene accumulato tramite la driving force e il gradiente di pH permette l’accumulo di

 fosfati. È stato possibile valutare sperimentalmente la variazione di pH nei

 2+

mitocondri che corrisponde ad una captazione di Ca .

2+ 2+

Quindi hanno valutato quanto Ca veniva captato e la variazione di pH nel periodo che il Ca

+ 2+ 2+

veniva captato e hanno visto che quando il rapporto H /Ca = ½=0.5 si formava Ca monoidrogeno

2+

fosfato CaHPO , quando invece il rapporto H/Ca=1 si aveva la formazione di Ca ortofosfato

4

Ca (PO ) , che è meno solubile del CaHPO Poi hanno valutato che sperimentalmente nei

3 4 2 4 .

mitocondri cerebrali il rapporto era circa 0.8.

Probabilmente in condizioni fisiologiche nella matrice mitocondriale questi ortofosfati sono

 presenti in parte come CaHPO e in parte come Ca (PO ) .

4 3 4 2

Ca (PO ) (OH),

Si può formare anche idrossiapatite che è presente nelle ossa. però sembra che

5 4 3

per quanto riguarda i mammiferi e gli organismi superiori non avvenga in condizioni fisiologiche

ma solo in condizioni patologiche che portano ad un danno severo. 2+

Negli anni ‘60-‘70 è stato dimostrato che 3 deidrogenasi mitocondriali sono regolate dal Ca :

• La piruvato deidrogenasi è regolata dai processi di fosforilazione e defosforilazione, e il

2+

Ca è in grado di attivare la fosfatasi e quindi defosforilare la piruvato deidrogenasi,

attivandola.

• 2+

L’α-chetoglutarato e isocitrato deidrogenasi invece sono regolate allostericamente dal Ca .

2+

Questo aveva portato a pensare che queste variazioni di Ca citosolico trasmesse ai mitocondri

potessero attivare la produzione di ATP. In seguito è stato dimostrato misurando i livelli di ATP con

sonde fluorescenti indirizzate verso i mitocondri e contenenti luciferasi. Qui si vedono i transienti di

2+

Ca (sempre nelle cellule HeLa). Queste

cellule vengono stimolate con istamina

perché è in grado di stimolare il rilascio

2+

di Ca dall’ER . A questo livello si ha la

stimolazione: nel primo grafico si ha il

2+

Ca nell’ER e si vede che inizia a

diminuire in seguito alla stimolazione con

istamina: soltanto con un breve ritardo si

ha un aumento del Ca2+ citosolico (in corrispondenza

della diminuzione nel RE). Nel grafico sotto invece c’è il

2+ 2+

Ca mitocondriale, che aumenta all’aumento di Ca

citosolico.

In corrispondenza della stimolazione con istamina (e

2+

quindi dell’aumento di Ca ) si ha un incremento dei

livelli nei mitocondri (più ampio) e nel citoplasma.

2+

Quindi alle variazioni di Ca corrisponde

effettivamente una variazione nelle disponibilità energetiche della produzione di ATP!

2+ 2+

Il Ca che esce dal’ER arriva nel citosol. Chiaramente nei microdomini vicino all’ER il Ca

aumenterà molto più rapidamente. Quella che c’è in figura è una registrazione generale, ci vuole del

2+

tempo comunque perché il Ca diffonda. Comunque l’istamina viene data, si effettua la

registrazione, ma poi l’istamina ritorna giù, non viene data continuamente.

Quello che hanno dimostrato è che non è mai la presenza di uno stimolo continuo che da

l’informazione dal punto di vista fisiologico, ma uno stimolo intenso può dare un’oscillazione

con frequenza maggiore. Se le oscillazioni sono più vicine chiaramente si avrà una risposta

maggiore. Uno stimolo continuo non è mai fisiologico.

Per un certo periodo di tempo si è pensato che i mitocondri non fossero cosi importanti nelle

2+ 2+

dinamiche del Ca cellulare perché in condizioni fisiologiche l’affinità per il Ca dell’uniporter era

2+

troppo bassa (se era necessario avere delle concentrazioni di Ca superiore allo 0.5 M, significa

che in condizioni fisiologiche c’erano dei problemi), allora hanno osservato che in effetti non è cosi:

2+

il Ca si deve muovere, si distribuisce, ma non è questo il segnale, il segnale è a livello di

2+

microdomini di Ca che vengono chiamati hot spots !

2+

Quando l’ER rilascia Ca , lo rilascia in microdomini, non lo rilascia dappertutto!

 2+

Il Ca a livello di questi microdomini può raggiungere concentrazioni elevatissime.

 Quindi i mitocondri, che sono vicini e giustapposti a questi microdomini,

rispondono subito. 2+

Altri microdomini con concentrazioni elevate di Ca li troviamo vicino ai canali voltaggio

2+

dipendenti. Prima che il Ca che entra attraverso i canali voltaggio dipendenti e faccia aumentare la

concentrazione nel citosol ci vuole tempo, però nelle regioni vicine al canale ci sono dei

2+

microdomini con concentrazioni elevatissime di Ca e lì avviene direttamente la risposta: lì ha

2+

importanza che intervengano i mitocondri se sono presenti, non bisogna aspettare che il Ca

diffonda in tutta la cellula prima di avere un effetto, sarebbe un processo lunghissimo!

Li hanno chiamati hot spots e proprio Rosario Rizzuto ha pubblicato nel ‘98 questa immagine 3D di

mitocondri e RE in cellule HeLa in coltura, si usano molto le

HeLa perché sono facilissime da coltivare. In questo caso i

mitocondri sono marcati in rosso e l’ER in verde. E’

un’immagine confocale. Ha visto che ci sono delle zone bianche

che sono zone di sovrapposizione, ovvero zone in cui l’ER è

giustapposto ai mitocondri, c’è un legame stretto tra ER e mitocondri e sono queste zone gli hot

spots, microdomini in cui immediatamente i mitocondri possono rispondere.

I punti di contatto dove si hanno gli hot spots, cioè questi microdomini caldi, sono chiamati MAM

– “Mitochondrial associated ER membrane” e sono le regioni di giustapposizione fra mitocondri

ed ER, ma ci sono anche delle proteine che promuovo quello che viene detto Tethering: un

ancoraggio in queste zone fra mitocondri e reticolo. In queste MAM sono presenti diversi tipi di

proteine, le chaperon che intervengono per curare le proteine misfoldate e ci sono recettori canali

2+

importanti per il trasporto del Ca : sono recettori IP3 che sono proprio localizzati in queste zone a

livello delle MAM. In particolare una delle tre isoforme, l’IP3-3, è compartimentalizzato alle

MAM. E’ stato anche possibile isolare le MAM dai mitocondri ed è per questo che sono state

studiate molte proteine che fanno parte del corredo di queste zone.

Molecular Machinery nei mitocondri - Membrana esterna

Partiamo dalla membrana esterna mitocondriale, che è permeabile a ioni e a piccole molecole.

Questa permeabilità è data soprattutto da VDAC, “Voltage dependent anion channel”, una porina.

2+

Ci sono almeno 3 isoforme di VDAC che hanno affinità diversa per il Ca , con caratteristiche

lievemente diverse e che normalmente hanno anche delle localizzazioni lievemente diverse.

VDAC è clustered (raggruppato) nelle MAM e sembra essere un fattore che limita la capacità di

2+ 2+

captare il Ca , quindi anche VDAC è importante nella captazione del Ca .

Posizione putativa: VDAC è sulla membrana esterna in corrispondenza di MCU sulla membrana

2+

interna e poi c’è anche una proteina anch’essa coinvolta nella captazione del Ca . 2+

E’ stato visto che una sovraespressione di VDAC causa un incremento nel picco di Ca

raggiunto dopo la stimolazione e riduce il ritardo tra picco citosolico e picco mitocondriale. 2+

Se c’è una sovraespressione di VDAC, può entrare molto più Ca

 più rapidamente nei mitocondri.

In microscopia elettronica è stato possibile osservare la presenza di proteine sia sulla membrana

esterna sia sulle membrane dell’ER che su quelle mitocondriali, in corrispondenza delle MAM.

In corrispondenza dei siti di giustapposizione che tengono insieme i due organelli e che

 possono essere rimosse tramite proteolisi.

Quando sono rimosse per proteolisi gli organelli si separano.

Le MAM corrispondono al 5-20% della superficie mitocondriale.

Proprietà e identità di queste proteine.

Ci sono proteine chaperon e proteine che controllano la fusione e la fissione dei mitocondri. Tra gli

chaperon c’è GRP75 “Glucose Regulated Protein 75”, abbondante nella matrice mitocondriale

dove svolge la sua funzione. È in una posizione strategica tra VDAC e IP3. Infatti, IP3 si lega al suo

2+

recettore e promuove il rilascio di Ca . Questo rilascio dovrebbe attivare i mitocondri e proprio lì

c’è GRP75, che tiene vicino il recettore IP3 e VDAC in modo che ci sia un passaggio favorito di

2+

Ca nei mitocondri.

Poi c’è Sigma1, un recettore localizzato nelle MAM. In condizioni di normalità fisiologica, Sigma1

è legato ad un altro chaperon, BIP o GRP78. Quando

2+

diminuisce il Ca nell’ER, BIP si stacca da Sigma e

Sigma si lega al recettore per IP3 stabilizzandolo. Infatti, il

recettore per IP3 andrebbe incontro a degradazione da parte

del proteasoma, invece Sigma lo stabilizza e permette un

2+

influsso maggiore di Ca nei mitocondri. Questo è uno

degli effetti di Sigma1, ma comunque attraverso la

stabilizzazione del recettore per IP3 sembra che

porti ad un ipermetabolismo (un aumento del

metabolismo) e che favorisca quindi la proliferazione

o la crescita neuritica e che serva anche come

neuroprotettivo. Infatti è stato dimostrato che agonisti del recettore Sigma sono neuroprotettivi.

2+

Calnessina e Calreticulina sono proteine Ca -leganti con alta capacità e bassa affinità che

2+

costituiscono un pool di Ca facilmente disponibile per il rilascio mediato da IP3R. La calreticulina

2+ 2+

regola i flussi di Ca attraverso la membrana ER, modulando direttamente il segnale di Ca

mediato da IP3R, e regolando l’attività delle SERCA, mentre la calnessina ha una funzione tampone

nell’ER. Sono proteine che controllano fusione e fissione dei mitocondri.

DRP 1 e FIS 1 causano la frammentazione dei mitocondri e la ridistribuzione a livello perinucleare.

La fissione dei mitocondri provoca una rottura nel network, impedendo la diffusione dei ROS e

quindi il fatto che altre zone dei mitocondri vengano turbate o danneggiate dalla presenza dei ROS

2+

stessi; la stessa cosa vale per il Ca : questa frammentazione impedisce che venga trasmessa dalle

2+

regioni mitocondriali ad esempio una elevatissima concentrazione di Ca . In alcuni casi invece può

2+

servire una fusione, cosicché Ca venga distribuito in tante regioni della cellula.

Le GTPasi Miro-1 e Miro-2 controllano la motilità dei mitocondri e lo fanno perché contengono

2+

delle sequenze EF-hand che sono dei sensori per il Ca , promuovono il movimento a riposo e

2+

inducono frammentazione quando la concentrazione di Ca è troppo elevata.

Le mitofusine invece promuovono la fusione dei mitocondri. La mitofusina 2 presente nelle MAM

e sia su ER che sui mitocondri forma sia complessi con altre mitofusine 2, sia complessi eterotipici

con la mitofusina 1, rafforza le interazioni tra ER e mitocondri e poiché provoca una fusione dei

2+

mitocondri potenzia il trasferimento del Ca da zone mitocondriali ad altre più remote .

Molecular Machinery nei mitocondri – Membrana interna

La membrana interna contiene l’uniporter MCU, che ha proprietà di alta selettività ionica e

2+

permette di accumulare il Ca secondo il suo gradiente elettrochimico (che è stabilito dalla catena

respiratoria), e una proteina, detta MICU1 (“ mitochondrial calcium uptake 1 ” ) , che ha la funzione

2+

di un sensore. MICU1 presenta due zone EF-hand (i sensori per il Ca ) ed un dominio

2+

transmembrana ed è necessaria per l’accoppiamento metabolico tra transienti di Ca citosolici e

l’attivazione delle deidrogenasi mitocondriali.

Infatti quando è stata isolata questa proteina, prima dell’uniporter, si pensava che fosse lei

l’uniporter. Tuttavia non aveva il profilo farmacologico e la cinetica dell’uniporter e gli studi hanno

2+

messo in evidenza come sia più che altro una modulatrice del segnale del Ca , riesca ad accoppiare

2+

i transienti del Ca citosolici che arrivano attraverso VDAC all’uniporter e quindi alla matrice

mitocondriale.

Qui c’è tutto il sistema integrato:

La motilità, la morfologia e la distribuzione intracellulare dei mitocondri sono influenzati dal

2+

Ca .

In questo esperimento sempre su cellule HeLa possiamo vedere il network mitocondriale in cellule

in cui viene espresso un colorante fluorescente che ha come target

mitocondri DsRed. E’ stata condotta una scansione sull’asse z al

tempo in più tempi, poi è stata fatta una ricostruzione 3D del network

mitocondriale, sono state sovrapposte le immagini e il risultato è

quello dell’immagine che segue: A dieci minuti i

 mitocondri si sono

mossi e in alcuni

punti c’è stata una

fusione!

Dove sono presenti tutti e tre i colori (ciano) vuol dire che i mitocondri non si sono mossi. Dove è

espresso il giallo ( che è la somma di rosso e verde) vuol dire che si sono mossi solo nell’arco dei 5

minuti e poi sono rimasti fermi.

E’ tutto in moto, non c’è niente di statico!

 2+

Quando il Ca viene rilasciato dall’ER, i mitocondri, che sono giustapposti, ricevono

2+

immediatamente questa ondata di Ca , che blocca la motilità mitocondriale.

Li blocca dove sono necessari.

 2+

Si può dire che il rilascio del Ca dall’ER induce il “trapping”: li intrappola nelle vicinanze

 del’ER attivato. 2+

La stessa cosa avviene a livello dei canali per il Ca sulla membrana plasmatica: i mitocondri che

2+ 2+

sono vicini alla membrana plasmatica, quando il Ca entra, captano il Ca e si bloccano lì fino a

quando non ritornano normali le condizioni.

Vengono intrappolati dove c’è bisogno di loro.

 2+

Grazie a un lavoro del 2006 si è dimostrato negli astrociti che effettivamente l’ingresso di Ca

attraverso la membrana plasmatica provoca il reclutamento e l’intrappolamento dei mitocondri a

quel livello e che in questo fenomeno sicuramente sono coinvolti i microtubuli. I microtubuli, come

il resto del citoscheletro, fungono da ancoraggio per i mitocondri e li trasportano cellula.

Quindi è facile che la motilità dei mitocondri dipenda anche dallo slittamento dei mitocondri

 sui microtubuli.

Tuttavia, non si conosce ancora il meccanismo preciso con cui questo avviene: bisognerebbe vedere

2+

l’effetto diretto che la variazione della [ Ca ] nei mitocondri può avere sui microtubuli.

2+

Un sovraccarico di Ca nei mitocondri è un evento critico nell’instaurarsi di una crisi bioenergetica

cellulare associata a morte, sia per necrosi che per apoptosi. Infatti, i mitocondri sono un

2+

checkpoint del pathway intrinseco dell’apoptosi, ed il Ca ha un ruolo cruciale negli eventi che

portano alla transizione proapoptotica dei mitocondri. Il rilascio di fattori che attivano le caspasi,

come il citocromo c e SMAC/Diablo (second mitochondria derived activator of caspase), è il

segnale che causa l’assemblaggio dell’apoptosoma ed il commitment della cellula alla morte

apoptotica. Nel rilascio di questi fattori hanno importanza la frammentazione e lo swelling

(rigonfiamento) mitocondriali indotti dall’apertura di mPTP (mitochondrial permeability

transition pore), un poro aspecifico ad alta conduttanza ionica.

2+

Il Ca è il più importante elemento che favorisce l’apertura di mPTP .

 2+

Il ruolo dei segnali di Ca è supportato dalla dimostrazione che proteine antiapoptotiche, come Bcl-

2+

2, riducono i segnali cellulari di Ca , mentre proteine proapoptotiche esercitano l’effetto opposto.

2+

Proteine Ca -leganti 2+

I mitocondri e l’ER sono sistemi di regolazione dinamica del Ca . Accanto a questi sistemi,

2+

esistono le proteine Ca -leganti, che limitano spazialmente e quantitativamente le variazioni di

2+

Ca . 2+

Il Ca non si può muovere tranquillamente nel citosol perché incontra inesorabilmente

 queste, alle quali si lega.

2+

Queste proteine legano il Ca selettivamente e non sono saturate in condizioni di steady state.

Questo avviene perché devono avere la capacità di intervenire quando variano le concentrazioni di

2+

Ca . 2+ 2+

A causa della presenza di queste proteine Ca leganti, un aumento di Ca da 100 a 500nM non

richiede il trasferimento di 400nM al citosol ma almeno di 100 volte tanto.

Non è una sottrazione matematica che avviene, prima di far variare da 100 a 500 nM il Ca il

 2+

Ca si deve legare a queste proteine. 2+

C’è fase in cui non aumenta la [Ca ]: quando ha saturato le proteine, allora aumenta.

 Quindi prima che un fenomeno si distribuisca a tutta la cellula ci vuole molto

tempo e questo avviene soltanto se si ha una stimolazione molto forte. È difficile

che questo avvenga normalmente perché sono più i microdomini che hanno

importanza. 2+

Ad oggi sono state descritte più di 300 proteine Ca leganti e sono quasi tutte caratterizzate dalle

2+

sequenze EF-hand. Ci sono anche proteine Ca leganti prive di questi territori, come le

2+

annessine,che legano il Ca insieme a lipidi in forma di fosfatidilserina.

L’EF-hand è un motivo helix-loop-helix: due eliche sono poste ad angolo retto nei domini EF-hand

2+

e il Ca interagisce con l’ossigeno dei due gruppi carbossilici di glutammato e aspartato e questo

2+

permette ai domini EF-hand di essere dei sensori per il Ca . 2+

La calmodulina presenta due subunità globulari. Può legare quattro ioni Ca , è ubiquitaria,

altamente conservata e può essere sia libera nel citoplasma sia legata in seguito ad un aumento del

2+

Ca , che si lega alla subunità regolatoria dell’enzima. Può anche far parte della subunità regolativa

di molte proteine e quindi esservi legata direttamente, rendendole in grado di sentire direttamente le

2+ 2+

variazioni di Ca . Il legame con il Ca promuove un cambiamento conformazionale della

calmodulina che espone dei gruppi idrofobici, che sono delle sequenze adesive che avvolgono la

proteina target e permettono interazioni proteina-proteina. 2+

Altre proteine molto importanti sono la Calcineurina, una fosfatasi-Ca -calmodulina dipendente,

2+

che ha 4 motivi EF-hand, è simile alla calmodulina ed è molto importante nel metabolismo del Ca

a livello neuronale.

Le calpaine che sono cisteina-proteinasi citosoliche che partecipano al rimodellamento del

citoscheletro e della membrana, alla rimozione di recettori. Agiscono come eterodimeri. Ne sono

2+

stati descritti tre tipi che differiscono nella concentrazione di Ca che le attiva. Hanno anch’esse

quattro motivi EF-hand.

Poi, molto importanti a livello neuronale, sono Parvalbumina e Calbindina-D28K. Sono proteine

presenti nei neuroni. Nei motoneuroni sono a basse concentrazioni o quasi assenti e la lo

2+

presenza/assenza è importante nel modellare la durata e l’intensità dei transienti di Ca . La

2+

parvalbumina ha una elevata affinità per il Ca e tre motivi helix-loop-helix, di cui due sono in

2+ 2+

grado di legare il Ca . La calbindina-D28K ha 6 motivi EF-hand, 4 dei quali legano il Ca con alta

affinità. 2+

Bassi livelli di proteine Ca -leganti costituiscono un fattore di rischio per la neurodegenerazione,

2+

mentre un corredo elevato di proteine in grado di tamponare il Ca ha un effetto neuroprotettivo sia

in vitro che in vivo. Questa correlazione è stata vista in un articolo in cui si studiava la SLA. Il

2+

tempo di recupero dopo uno stimolo (e quindi un incremento dei livelli di Ca ) è rappresentato

2+

dalla costante τ e dipende dalla quantità di proteine Ca -leganti endogene presenti nella cellula,

dalla quantità di tampone esogeno che si aggiunge e dalla velocità di trasporto.

2+

Ritenendo che la velocità di trasporto del Ca , γ, attraverso la membrana cellulare sia la stessa, è

2+

stata calcolata la quantità di proteine Ca -leganti endogene, basandosi sulla quantità di tampone

contenente FURA2, aggiunto nella pipetta di patch. 2+

Più FURA2 si deve aggiungere, meno proteine Ca leganti sono presenti nella cellula.

 2+ 2+

Più è elevato il corredo endogeno di proteine Ca -leganti, più rapidamente il Ca tornerà

 alla situazione di base.

Attraverso questo sistema è stato visto che i neuroni di Purkinje sono molto ricche di queste

2+

proteine Ca -leganti, mentre i motoneuroni spinali e facciali, hanno dei corredi esigui di proteine

2+

Ca -leganti e quindi sono più vulnerabili; invece, i neuroni oculomotori, che sono protetti nella

2+

SLA, hanno un corredo di proteine Ca -leganti molto elevato rispetto a quello dei neuroni spinali.

2+ 2+

Si pensa che in cellule che hanno un elevato corredo di proteine Ca -leganti, quando il Ca

 2+

entra attraverso i canali voltaggio dipendenti si abbiano dei transienti di Ca , cioè delle

2+

variazioni delle concentrazioni di Ca citosolico, che sono transienti. Nei neuroni

2+

oculomotori, il Ca ha un picco abbastanza basso e diminuisce più lentamente. Il fatto che

2+ 2+

ci siano tutte queste proteine Ca -leganti blocca l’incremento della concentrazione di Ca ,

2+

quindi si ha un transiente basso di Ca , invece nelle cellule in cui si ha un corredo basso di

2+

proteine Ca -leganti, si ha un transiente elevato e rapidissimo.

Si suppone che in queste cellule i mitocondri abbiano un’importanza maggiore come

 2+ 2+

tamponi del Ca perché devono sopperire all’assenza di proteine Ca -leganti.

2+

Infatti, i mitocondri possono captare tantissimo Ca rapidamente, quindi si ha un breve transiente e

2+

poi il Ca viene subito captato. Questo ha portato a pensare che in patologie in cui si ha una

disfunzione mitocondriale, come la SLA o l’ischemia, è possibile che i mitocondri non siano più in

2+

grado di svolgere efficacemente questa funzione tampone per il Ca e che si possa andare incontro

ad un danno neuronale che dipende proprio dall’impossibilità dei mitocondri di far fronte a questa

esigenza.

Ultimamente sono state scoperte delle altre proteine calcio leganti che si chiamano NCS

(“Neuronal Calcium Sensor”) e CaBP (“Calcium Binding Protein”). Hanno elevata affinità per

il calcio e sono coinvolte nelle regolazione di funzioni legate a recettori, canali ionici, traffico di

membrana, crescita neuritica e sopravvivenza cellulare.

E’ stato visto che la famiglia di proteine NCS è codificata da 14 geni e ci sono molte isoforme

derivanti da splicing alternativo. Queste proteine hanno in genere quattro domini EF-hand, ma solo

due o tre sono attivi. Tra le NCS sono state studiate VILIP, KCH, NCS-1, che sono distribuite nel

cervello e nella retina.

Le NCS hanno una particolarità: il legame miristilico. L’acido miristico è un acido grasso a 14

atomi di carbonio che può legarsi a un residuo di glicina vicino all’NTD di una proteina,

favorendone l’ancoraggio alle membrane. Proteine che non sono integrali di membrana sono

ancorate ad essa attraverso questi tipi di legami, che possono avvenire con acido mannitico o acido

miristico. Possono essere legami reversibili. La maggior parte delle proteine NCS sono miristilate e

2+

questo permette loro di associarsi alle membrane, dando luogo a quello che viene definito “Ca -

myristoyl switch”. Non è sempre così, ma per molte proteine una variazione delle concentrazioni di

2+

Ca porta all’esposizione di questo residuo di acido miristico.

2+

In presenza di elevate [Ca ] queste proteine si legano alle membrane.

 2+

Nella forma della proteina non legata al Ca , il gruppo

miristilico è sequestrato all’interno di una tasca idrofobica.

La proteina è solubile.

 2+

Quando invece aumenta la concentrazione di calcio e la proteina si lega al Ca , espone il gruppo

miristilico.

Si ancora alla membrana.

L’organismo umano è molto ricco di acido miristico perché questi legami sono estremamente

importanti. 2+

Qui ci sono delle proteine in condizioni normali e in seguito all’ingresso di Ca nella cellula. Ci

sono diversi tipi di NCS, come NCS-1 (in blu scuro), che sono già normalmente ancorate alla

2+

membrana attraverso il legame miristilico, altre, come la rossa, che dopo l’entrata di Ca

espongono il gruppo miristilico e possono ancorarsi alla membrana o al Golgi o ad altri organelli

2+

subcellulari. Le prime sono proteine che possono rispondere rapidamente alle variazioni di Ca ,

2+

mentre le seconde richiedono incrementi di [Ca ] più globali e long-lasting per attivarsi.

La mappa presenta la calmodulina e alcuni dei target della calmodulina (come calcineurina, IP3,

2+

canale per il calcio). Il Ca entra e causa la messa in moto di tutta una serie di processi. Non agisce

solo la calmodulina: molte delle altre proteine

2+

attivate o inibite dal Ca , non lo sono solo attraverso la

calmodulina ma anche attraverso altri sistemi, come proteine

calcio leganti (CaBP) o attraverso NCS. Entra in gioco

anche l’IP3. Infatti, anche NCS-1 è in grado di modulare

IP3.

Quindi Il risultato, l’azione sulla funzione dipende

sempre dalla somma di tante interazioni che danno il risultato finale.

Fosforilazione e defosforilazione

Uno dei più importanti meccanismi di trasmissione del segnale e di plasticità

cellulare è il processo di fosforilazione e defosforilazione.

Fosforilazione = Trasferimento del fosfato in γ dall'ATP a un residuo

amminoacidico bersaglio, tramite enzimi detti chinasi, con

formazione di un legame covalente.

I residui fosforilati contengono un gruppo idrossilico, cui viene legato il

fosfato; questo permette di classificare le chinasi in tre gruppi a seconda del

residuo bersaglio:

Serina/Treonina Chinasi (95% delle Chinasi)

• Treonina Chinasi (4%)

• Tirosina Chinasi (<1%)

La fosforilazione implica un cambiamento di cariche e di interazioni.

Avviene a una modifica conformazionale che altera le caratteristiche e

 l'attività della proteina fosforilata.

Per garantire specificità nel meccanismo di fosforilazione esistono delle

sequenze consenso, nel contorno dei residui fosforilabili, specifiche per una

particolare chinasi: prima della fosforilazione la chinasi deve riconoscere la

sua specifica sequenza consenso.

Molte chinasi in condizioni stazionarie si trovano nello stato inattivato;

l'attivazione segue uno stimolo di varia natura che può coinvolgere recettori

extracellulari e secondi messaggeri o, in alternativa, primi messaggeri (EGF,

NGF, etc...) che si legano a recettori tirosinchinasici (TKR) in grado di

autofosforilarsi e di trasmettere il segnale (-> attivazione diretta). Sono

coinvolti due meccanismi:

1) segnali extracellulari o primi messaggeri, che regolano la chinasi

indirettamente agendo su recettori che alterano le concentrazioni

intracellulari di secondi messaggeri (es. recettori accoppiati alle

proteine G) oppure recettori-canale come GABAA, NMDA, AMPA, etc.

2) primi messaggeri che regolano direttamente le proteine chinasi e/o

fosfatasi agendo su recettori di membrana con attività protein

chinasica intrinseca nei domini citoplasmatici (es. citochine, fattori

neurotrofici). L’attività enzimatica intrinseca è stimolata dal binding con

il ligando e porta alla fosforilazione di specifiche proteine substrato ed

alla generazione di specifiche risposte biologiche

Protein Chinasi A (PKA)

La PKA è una chinasi cAMP-dipendente, ubiquitaria, formata da 4 subunità,

due catalitiche e due regolatorie; i due domini regolatori contengono una

sequenza amminoacidica che lega il dominio catalitico, inibendolo

(pseudosubstrato).

A riposo, quando [cAMP] è bassa, le 4 subunità formano un tetramero

i

inattivo. Quando invece [cAMP] aumenta, 2 molecole di cAMP si legano a

i

ognuna delle subunità regolatorie, diminuendone l'affinità per la subunità

catalitica, che si libera e diviene attiva.

Le proteine bersaglio della PKA comprendono:

la glicogeno fosforilasi chinasi : quando è fosforilata, fosforila a sua volta la

• glicogeno fosforilasi, portando alla glicogenolisi.

la glicogeno sintasi: la glicogeno sintasi fosforilata viene inibita, portando a

• inibizione della glicogenosintesi.

La fosforilazione degli enzimi del metabolismo del glicogeno da parte di

 pkA promuove la glicogenolisi.

La PKA ha la possibilità di traslocare nel nucleo, dove fosforila CREB (cAMP

Response Element Binding protein), il quale interagisce con la sequenza

genica CRE attivando la trascrizione di geni specifici.

Le varie proteine del citoplasma sono organizzate in complessi e ancorate a

specifiche impalcature citoscheletriche che rendono la trasmissione

dell'informazione efficiente e nel contempo specifica e selettiva per un

determinato pathway. Nel caso di PKA, essa è compartimentalizzata nella

cellula tramite il legame con le AKAPs (A-Kinase Anchor Proteins) , che

sono in grado di interagire con la subunità regolatoria di PKA, ancorandola al

citoscheletro. Le AKAPs possono legare in un complesso, oltre a PKA, anche

le fosfatasi e le fosfodiesterasi, che rispettivamente catalizzano la rimozione

del gruppo fosfato e la degradazione di cAMP in AMP.

Si viene a formare quindi un complesso proteico in grado di rispondere

 con grande precisione agli stimoli in arrivo.

Protein Chinasi G (PKG)

PKG è un omodimero formato da una subunità catalitica e da una subunità

regolatoria che, in condizioni normali, ne inibisce l'attività. Si tratta di chinasi

cGMP-dipendenti. Infatti, il cGMP attiva la PKG, liberando il dominio catalitico

dallo pseudosubstrato; l'attivazione è favorita dalla presenza di monossido di

azoto (NO), in quanto attiva la guanilato ciclasi che produce cGMP. È stato

osservato che PKG (e quindi anche NO) ha un ruolo nel long term

potentiation (LTP), che comprende fenomeni di apprendimento e

memorizzazione.

L'attivazione delle G protein legate a cGMP può regolare la divisione cellulare

e la sintesi di acidi nucleici.

Inoltre PKG2, ancorata alla membrana plasmatica tramite un residuo

meristilico, sembra avere un ruolo nell'ipereccitabilità neurale che interviene

nei meccanismi del dolore.

2+

Protein Chinasi Ca -calmodulina dipendente (CaMKII)

Come le altre chinasi, questa presenta un dominio regolatorio e uno catalitico; viene attivata dal

2+

legame con CaM-Ca , che permette alla proteina di autofosforilare il proprio residuo Thr 286 ,

prolungandone l'attività nel tempo. L’autofosforilazione permette alla CaMK di protrarre più a

2+

lungo la sua attività e quindi l’effetto del segnale che la attiva (transiente di Ca intracellulare).

Nei neuroni, questa proprietà è importante nell’induzione della plasticità sinaptica. Il blocco della

CaMKII blocca anche l’induzione del potenziamento a lungo termine (LTP).

Vi sono inoltre altri due siti di autofosforilazione, Thr 305-306, che invece, se fosforilati,

promuovono l'inattivazione della CaMKII. Questa proteina ha anche un ruolo nella regolazione

+ +

della Na /K ATPasi .

PKC 2+

È una famiglia di circa 10 isoenzimi, attivati da fattori diversi, quali il Ca , il

DAG, la fosfatidilcolina e la fosfatidilserina.

La PKC è costituita da un'unica catena di 80kDa che contiene entrambe le

subunità, catalitica e regolatoria. È localizzata nel citoplasma, ma nella forma

attiva viene traslocata nella membrana dalle proteine RACKs (membrane-

bound Receptor for Activated C-Kinase proteins), dove agisce fosforilando

proteine transmembrana, fra cui canali ionici.

Mitogen Activated (o Microtubules Associated) Protein Kinase

(MAPK)

Le MAP chinasi sono Thr/Ser Chinasi con effetti pleiotropici; fosforilano infatti

numerose proteine citosoliche, chinasi e non: fosfolipasi, proteine

citoscheletriche e fattori di trascrizione. Sono attivate da neurotrofine (NGF,

EGF, etc...) e presiedono a fenomeni di apprendimento e memorizzazione

(LTP) e di proliferazione e differenziamento cellulare.

Si possono dividere in tre famiglie:

1) Extracellular signal Regulated Kinases (ERK1-2): regolano preferenzialmente la crescita

cellulare e la differenziazione; sono attivate da neurotrofine come NGF, BDNF, EGF, insulina.

Le neurotrofine si legano ai loro recettori ne promuovono la dimerizzazione e

l’autofosforilazione in tirosina. Infatti, i recettori hanno attività tirosin-chinasi intrinseca. La

fosforilazione porta all’attivazione di una cascata fosforilativa.

Stress Activated Protein Kinases (SAPK) : nel cervello sono attivate da

2) citochine e dall’attività sinaptica. Sono implicate in fenomeni di risposta

allo stress, infiammazione e apoptosi

p38 α, β, γ, δ: anch’esse implicate nella risposta infiammatoria, stress e

3) apoptosi.

Il riconoscimento specifico tra MAPK e bersaglio si attua attraverso una doppia interazione.

1) Tutte le MAPKs riconoscono il sito di fosforilazione, costituito da serina o treonina seguite

da una prolina.

2) La piena specificità è poi assicurata dall’interazione tra un sito dell’enzima diverso da quello

catalitico ed un dominio specifico di riconoscimento presente sulla proteina substrato.

La rimozione dei gruppi fosfato porta allo spegnimento del segnale. I gruppi fosfato vengono

rimossi sia dalle MAPK sia dalle proteine substrato tramite specifiche fosfatasi. La defosforilazione

ad opera delle fosfatasi è fondamentale nel controllo dell’intensità e della durata della risposta

cellulare.

Le ERK - Attivazione EGF-EGFR

L'attivazione delle MAPKs prevede fosforilazioni successive di chinasi

innescate da una G protein monomerica: questa attiva una MAPKKKK che

fosforila una MAPKKK, che fosforila una MAPKK, che fosforila MAPK, la

quale fosforila le proteine bersaglio citosoliche o trasloca nel nucleo dove

fosforila fattori di trascrizione.

Le small G protein monomeriche (20-40kDa) sono in grado di ciclare tra

uno stato attivo (GTP) e uno inattivo (GDP): GEF (Guanin Nucleotide

Exchange Factor) catalizza lo scambio del GDP con GTP, mentre GAP

(GTPase Activating Protein) catalizza l'idrolisi di GTP.

Esistono 5 famiglie di small monomeric G protein: Ras, Rho, Rab, Ran and

Arf.

Le neurotrofine attivano dei recettori, che successivamente attivano le MAPK; in

prevalenza sono recettori tirosinchinasici, che dimerizzano in seguito a legame

con le neurotrofine e si autofosforilano a vicenda: la porzione citosolica del

recettore cambia conformazione e diventa affine per proteine citoplasmatiche

(adattatori) che vi si legano attivandosi e iniziando la cascata che porta

all'attivazione delle MAPK:

NGF attiva il recettore

il recettore dimerizza e si autofosforila

 il recettore è in grado di legare SHC (prima proteina adattatrice)

 SHC lega GRB2 (Growth factor-Receptor Bound protein-2,

seconda proteina adattatrice)

GRB2 lega SOS1 (fattore di scambio per i nucleotidi guanilici)

 GRB2-SOS1 trasloca in membrana, dove scambia GDP

con GTP sulla G protein Ras, attivandola.

Ras attiva Raf (una MAPKKK)

 Raf attiva MEK (una MAPKK)

 MEK attiva ERK (una MAPK), si stacca da MEK (a cui era

attaccata) e trasloca nel nucleo, dove fosforila fattori di trascrizione,

co-attivatori e proteine associate ad immediate early genes (c-fos).

Inoltre l'autofosforilazione del recettore attiva anche la fosfoinositol chinasi,

che attiva Akt, un fattore antiapoptotico che promuove la sopravvivenza

cellulare.

ERK agisce per la maggior parte traslocando nel nucleo, attivando geni per il

differenziamento e la proliferazione cellulare; in questo contesto mutazioni di Ras

sono state riscontrate nel 30% dei casi di tumori neurali, in cui è presente una

persistente attivazione di ERK.

È stato osservato sperimentalmente nel topo che durante l'apprendimento si ha

un aumento dell'attività di ERK a livello dell'ippocampo; si suppone che

+

un'importante proteina bersaglio di ERK sia un canale K voltaggio-dipendente

localizzato sui dendriti dei neuroni piramidali, la cui fosforilazione risulta

nell'inattivazione del canale, favorendo la depolarizzazione.

Ci sono quattro tipi di recettori per EGF (growing factor che può attivare la

cascata delle MAPK), denominati HER1, HER2, HER3 e HER4. La loro

interazione con EGF provoca l'autofosforilazione e l'attivazione delle MAPK e

della fosfoinositol chinasi. Gli EGFR presentano in tutto 5 siti di fosforilazione, 3 di

autofosforilazione e 2 siti bersaglio per chinasi specifiche, che ne inducono

l'endocitosi e la degradazione.

Attivazione NT-EGFR

Un altra via di attivazione delle MAPK, che non si origina da EGFR, è quella che implica i recettori

per i NT (Dopamina, NA, Ach, Serotonina) e l'attivazione di proteine G eterotrimeriche che, oltre

agli effetti sull'adenilato ciclasi e sui fosfoinositidi di membrana, attivano le MAPK. Questo

fenomeno è normalmente associato ad un processo di transattivazione che comporta l’attivazione

di recettori per fattori di crescita ad attività tirosin-chinasica.

L’interrelazione tra la via dei recettori per i fattori di crescita (RTK, receptor tyrosine kinase) e

quella dei recettori GPCR per attivare la cascata fosforilativa di ERK/MAPK è un esempio di cross

talk tra sistemi di segnale.

La transattivazione è un pathway a due stadi, che in questo caso sono:

1) attivazione di GPCR (G protein coupled receptor) : le subunità βγ liberate da α, attivano la

tirosina chinasi citosolica Src, che promuove l’attività di una metalloproteinasi, che taglia il

precursore di HB-EGF(Heparin-Binding EGF), un EGF che è legato alla matrice extracellulare.

2) nel secondo stadio, HB-EGF transattiva gli EGFRs in modo convenzionale.

Quindi:

NT attiva i recettori metabotropici 7-STM

Attivazione della G protein con liberazione di G *

 βγ

Attivazione di c-SRC (Tyr-Chinasi citosolica)

 2+

C-SRC promuove l’attivazione di una metalloproteasi Zn -

dipendente di membrana, che taglia il precursore di HB-EGF.

HB-EGF esce dalla matrice ed interagisce con EGFR

 Autofosforilazione di EGFR.

 Il recettore è in grado di legare SHC

 Attivazione della cascata di fosforilazione delle MAPK

(come sopra)

MEK attiva ERK (MAPK)

Attivazione PK-MAPK

Le MAPK possono essere attivate anche da chinasi, come la PKA, che fosforila

c-SRC attivandola e favorendo così l'attivazione delle metalloproteasi etc...

Questa regolazione interviene a diversi stadi della sequenza di attivazione delle

MAPK, permettendone una fine regolazione.

Anche la PKC, attivata dal DAG (G protein eterotrimeriche), è in grado di

fosforilare direttamente Raf (MAPKKK).

Si è visto come l'attivazione delle MAPK non dipenda da un'unica via di

segnalazione, ma implichi una rete di pathway che prendono avvio da input

molto diversi ma che si interconnettono (cross-talk) e convergono su

proteine chiave, con specifiche localizzazioni subcellulari, che integrano i

segnali in entrata. I pathway in questione e le loro interconnessioni non sono

statici, ma variano al variare delle condizioni fisiologiche e dal tipo cellulare in

questione.

L'effetto dell'attivazione di ERK dipende, oltre dalla specificità delle sequenze

consenso e dalla sua localizzazione all'interno della cellula, dal periodo di

attivazione: è stato osservato in cellule PC12 che l'attivazione di ERK da parte di

NGF porta a differenziamento cellulare, mentre una sua attivazione da parte di

EGF (che si lega agli stessi recettori TKR) porta a proliferazione cellulare. Questa

differenza è dovuta al fatto che NGF attiva per lungo tempo e in modo sostenuto

ERK, mentre EGF induce un'attivazione rapida e transiente

I mitogeni (=neurotrofine) sono in grado di provocare un accumulo di ERK a livello

nucleare, che permane anche per diverse ore dalla stimolazione, favorendo la

proliferazione cellulare; si è visto che in presenza di mutazioni di ERK,che

rendono queste ultime incapaci di migrare nel nucleo, la replicazione del DNA

innescata dai fattori di crescita è bloccata.

SAPK

Sono MAPK attivate in seguito a stress cellulare, stimolate da citochine e fattori di

crescita. A questa famiglia appartiene JNK (c-Jun N-terminal Kinase) , la cui

attivazione necessita della fosforilazione di due siti da parte di due differenti

chinasi (MAPKK); JNK fosforila, attivandolo, c-Jun , un fattore di trascrizione che

regola l'espressione genica (c-Jun fa parte di un complesso di trascrizione

chiamato AP1, che regola l’espressione di molti geni, come di citochine pro-

infiammatorie. Secondo wikipedia è un proto-oncogene).

JNK fosforila anche proteine coinvolte nell'apoptosi, come Bcl-2 e p53;

nell'ischemia una mutazione di JNK risulta essere neuroprotettiva, aumentando la

resistenza a danno neuronale e citotossico; nei tumori l’attivazione di JNK ha

effetto inibitorio, favorendo l'apoptosi delle cellule tumorali.

p38

Le p38 sono molto simili a JNK in quanto sono attivate dallo stress cellulare e la loro attivazione

induce l’espressione di proteine coinvolte nei processi infiammatori. L’effetto anti-infiammatorio

dei glucocorticoidi sarebbe mediato dalla capacità di indurre l’espressione della fosfatasi MKP-1,

che defosforila p38.

L’attivazione sia di JNK che di p38 porta ad un aumento dell’attività delle caspasi.

MAPKP (MAPK fosfatasi)

Le fosfatasi sono in genere unite a chinasi e fosfodiesterasi in complessi proteici

vicini tra loro, in modo da permettere una risposta agli stimoli molto più dinamica

e precisa.

Ser/Thr fosfatasi

In confronto alla grande quantità di chinasi esistenti (518 geni codificanti), le

fosfatasi sono relativamente poche (solo 15 geni), ma regolano l'attività di più di

100.000 fosfoproteine.

Si dividono in:

fosfatasi 1 (PP1), che ha quattro isoforme (α,β,γ1,γ2)

• PP2A e 2B(calcineurina), PP2C

• PP4,5,6,7.

Sono inibite dall’acido ocadaico (PP1, PP2A, PP4,5,6), FK506 e calcisporina A

(calcineurina), un inibitore aspecifico del poro di transizione della membrana

mitocondriale.

La maggiore parte delle fosfoproteine è defosforilata da PP1 o PP2B; come si è

già visto, la modulazione delle fosfatasi avviene tramite una specifica

localizzazione subcellulare grazie al legame con proteine specifiche, le PPBPs

(Phosphatases-Binding Proteins). In alternativa l'inibizione avviene attraverso

substrati o inibitori (DAP, Inhibitor 1), che possono essere attivati dalle chinasi.

Quando uno stimolo attiva la via di segnalazione delle chinasi, le fosfatasi

sono modulate di conseguenza.

Anche le fosfatasi sono coinvolte in fenomeni di apprendimento e

memorizzazione (LTP): una diminuzione dei livelli di calcineurina durante il

training migliora l'apprendimento, aumentando la concentrazione di MAPK

fosforilata (attiva); una riduzione di PP1 durante e dopo il training migliora

apprendimento spaziale e la memorizzazione. Al contrario quando le fosfatasi

sono troppo attive vengono a causarsi delle disfunzioni nei fenomeni di

apprendimento. Un'attivazione blanda delle fosfatasi è in grado di scolpire l'attività

delle chinasi e quindi di regolare a un livello sofisticato i fenomeni di

apprendimento e memorizzazione, legati agli stessi recettori (NMDAR, AMPAR)

che portano a danno di tipo ischemico, se eccessivamente stimolati

(eccitotossicità); per avere un effetto determinante nell'LTP ma non citotossico è

necessario un fine bilanciamento tra i fenomeni chinasici (attivanti) e fosfatasici

(inattivanti).

IL GABA

Il γ-amminobutirrato (GABA) è considerato il principale neurotrasmettitore

inibitorio. I primi studi sul GABA come neurotrasmettitore sono stati fatti

intorno agli anni '50-'60 soprattutto sui crostacei e sugli insetti, in cui si ha una

trasmissione sia glutamatergica, sia GABAergica. In seguito è stato scoperto

(intorno al 1950) da due gruppi che lavoravano in modo indipendente

(Eugene Roberts e Sam Frankel, Jorge Awapara e collaboratori) che il GABA

è presente nel cervello dei vertebrati. Dopo questo scoperta ci sono voluti

però circa vent'anni prima che effettivamente si arrivasse senza ombra di

dubbio alla conclusione che il GABA era un neurotrasmettitore nel sistema

nervoso centrale dei vertebrati. La stessa cosa è successa per il glutammato.

Infatti sia il glutammato, sia il GABA sono delle molecole estremamente

abbondanti nel sistema nervoso centrale, e in particolare il GABA anche a

livello periferico, in organi che apparentemente non hanno niente a che

vedere con il sistema nervoso centrale: nei testicoli, nell'ovaio, nel pancreas,

nello stomaco, nell'intestino: è presente proprio ubiquitariamente.

C'è una teoria evoluzionistica secondo la quale il GABA è stato uno dei primi

neurotrasmettitori, insieme all'acetilcolina, ad essere utilizzato nella

filogenesi, e aveva, come ha tutt’ora (una certa quota di GABA è presente a

livello citoplasmatico), un effetto tropico.

Sembra inoltre che nell'embrione e durante lo sviluppo il GABA possa avere

anche un effetto eccitatorio: il GABA e le sinapsi GABAergiche

comparirebbero prima di quelle glutamatergiche, per cui inizialmente il GABA

avrebbe un effetto eccitatorio. Studi molto recenti, che sono controversi (però

prende sempre più piede questo pensiero), indicano che il GABA potrebbe

ritornare ad avere un effetto eccitatorio in determinate condizioni patologiche,

e manterrebbe un effetto eccitatorio in alcuni distretti, ad esempio nelle

cellule epiteliali delle vie aeree.

Il GABA non attraversa facilmente la BBB: è una molecola piccola, ma molto

idrofilica.

Deve essere sintetizzato in loco.

Soltanto in condizioni in cui si ha un danneggiamento nella barriera

ematoencefalica, la somministrazione di GABA può aumentare i livelli

cerebrali di GABA.

L'omeostasi del GABA è importante e implicata in molte malattie

neurologiche, ad esempio nella schizofrenia e anche in molte malattie

neurodegenerative, come ad esempio l'epilessia, la malattia di Parkinson, la

malattia di Alzheimer, la corea di Huntington. Il GABA è inoltre implicato nei

fenomeni di ansia, nel sonno, e nei fenomeni di apprendimento. Vedremo

come tanti farmaci che agiscono in queste condizioni agiscano attraverso il

sistema GABAergico.

Quando, intorno al 1950, il GABA è stato effettivamente considerato un

neurotrasmettitore, era perché le evidenze sperimentali avevano portato alla

conclusione che esso rispettava tutti i criteri da cui una molecola viene

definita un neurotrasmettitore:

aveva un meccanismo e un enzima di sintesi nel neurone, a livello

• presinaptico;

poteva essere racchiuso in vescicole a livello presinaptico; veniva

• rilasciato in seguito a depolarizzazione in modo calcio-dipendente;

poteva essere riconosciuto un sistema di rimozione del GABA dalla

• tasca sinaptica;

erano presenti delle molecole (recettori) in grado di riconoscere il GABA

• in modo specifico:

sia recettori a livello presinaptico (non è strettamente necessario

o per un neurotrasmettitore avere autorecettori o eterorecettori a

livello presinaptico)

sia recettori specifici a livello postsinaptico.

o

Il GABA è sicuramente concentrato in larga parte nei neuroni GABAergici;

tuttavia, come si è detto, è presente anche a livello di organi e sistemi

periferici.

I neuroni GABAergici sono per la maggior parte degli interneuroni, e anche

questi neuroni formano, per così dire, un sincizio, una rete di inibizione

GABAergica che può facilmente integrare il segnale inibitorio in diverse

regioni del sistema nervoso centrale.

Molti neuroni GABAergici contengono anche peptidi diversi (neuropeptidi),

come VIP (Vasoactive Intestinal Peptide), parvalbumina, calbindina.

La concentrazione del GABA nel liquido interstiziale è ≤1µM e viene

mantenuta attorno a questi livelli per la presenza di trasportatori che captano

il GABA sia a livello gliale, sia a livello neuronale.

Enzima chiave per la sintesi di GABA: glutammato decarbossilasi (GAD,

Glutamic Acid Decarboxylase). E’ stato considerato per moltissimo tempo un

marker specifico delle sinapsi GABAergiche, ma ultimamente si è trovato che

la GAD a livelli molto bassi è presente anche in alcuni tipi di astrociti,

soprattutto a livello cerebellare.

Dato che il GABA può essere captato non soltanto dai neuroni GABAergici,

ma anche dalla glia e da altri tipi di neuroni su cui sono presenti i recettori

GABAergici, gli enzimi di degradazione del GABA sono presenti anche lì.

Qual è la derivazione del GABA? Deriva dal glutammato, che a sua volta

deriva dal glucosio.

GAD ha come substrato il glutammato, e per decarbossilazione

 ossidativa del glutammato si ottiene il GABA.

Quindi il principale neurotrasmettitore inibitorio deriva

direttamente dal principale neurotrasmettitore eccitatorio!

Nei neuroni glutamatergici c’è un ciclo glutammato/glutammina: il

glutammato quando viene rilasciato viene ricaptato dagli astrociti, in cui è

presente la glutammina sintetasi , e viene così trasformato in glutammina ,

che a questo punto viene rilasciata e può essere ricaptata dai neuroni: questa

glutammina nei neuroni glutamatergici è trasformata in glutammato attraverso

la glutamminasi , e va così a reintegrare il pool di glutammato.

Nei neuroni GABAergici il ciclo è GABA/glutammato/glutammina : la

glutammina viene ricaptata e trasformata in glutammato, ma poi il

glutammato, per la presenza di GAD, enzima di sintesi del GABA, viene

trasformato in GABA.

Il ciclo metabolico di sintesi e di degradazione del GABA si chiama GABA

shunt .

L'α-chetoglutarato è un intermedio del ciclo di Krebs che normalmente dà

luogo, attraverso le reazioni dell'α-chetoglutarato deidrogenasi e della

succinato deidrogenasi, al succinato.

Nei neuroni GABAergici l'α-chetoglutarato viene deviato («shunted»)

 verso lo shunt del GABA.

L'α-chetoglutarato viene trasformato in glutammato dalla GABA-T.

 Il glutammato attraverso la glutammato deidrogenasi diventa

GABA.

Quando non serve più, il GABA viene degradato a

semialdeide succinica dalla GABA-α-chetoglutarico

transamminasi (GABA transamminasi, GABA-T).

La semialdeide succinica viene poi trasformata dalla

semialdeide succinica deidrogenasi in succinato e rientra nel

ciclo di Krebs.

Quindi dal glutammato si forma, attraverso la GAD, il GABA, che

viene degradato attraverso l'enzima GABA transamminasi a

semialdeide succinica; nel contempo una molecola di α-chetoglutarato

che deriva dal ciclo di Krebs viene trasformata in glutammato attraverso

questa stessa transaminazione.

La GABA-T catalizza, attraverso la transaminazione, la

formazione di semialdeide succinica per degradazione del GABA e

la formazione di glutammato a partire da α-chetoglutarato.

Quindi per ogni molecola di GABA (formatasi dal

glutammato) che viene degradata viene ripristinata una molecola

di glutammato.

La semialdeide succinica viene poi trasformata dalla semialdeide succinico

deidrogenasi in succinato e rientra nel ciclo di Krebs: in questo modo non

vengono depauperati gli intermedi del ciclo di Krebs.

Tuttavia questo shunt del GABA porta ad una perdita energetica! Infatti, se

l'α-chetoglutarato invece di essere deviato («shunted») verso lo shunt del

GABA proseguisse nel ciclo di Krebs formerebbe succinil-CoA attraverso l'α-

chetoglutarato deidrogenasi.

Si avrebbe la produzione di una molecola di GTP! Poi attraverso la

 succinato deidrogenasi si formerebbe il succinato.

Quindi per ogni molecola di α-chetoglutarato che entra nello shunt

del GABA si perde un GTP, una possibilità energetica!

Si è visto che l'inibizione della GAD, e quindi della produzione di GABA,

attraverso degli inibitori specifici (come l’allilglicina) porta a convulsioni, che

infatti sono caratterizzate da uno squilibrio del sistema GABAergico (anche

l’epilessia).

Invece il sodio valproato (farmaco antiepilettico) blocca la GABA

transamminasi (enzima di degradazione del GABA).

Disponibili più molecole di GABA.

 Allevia i fenomeni convulsivi.

Ci sono almeno due principali isoforme di GAD nel cervello, codificate da due

geni diversi e con distribuzione diversa:

GAD67 (67kDa): presente a livello citoplasmatico nei neuroni

• GABAergici, e sintetizza un pool di GABA che non è vescicolare. A cosa

serve? Teorie:

Si è pensato che GABA venisse utilizzato come fattore trofico per

o la sinaptogenesi, e che fosse importante soprattutto durante lo

sviluppo.

In seguito si è pensato GABA potesse essere un fattore

o neuroprotettivo nella sinapsi e anche una fonte energetica, in

quanto poteva sostituire oppure «appoggiare» il «replenishment»

l'apporto di più intermedi nel ciclo di Krebs.

Siccome si è scoperto che le GAD agiscono soprattutto come

o dimeri, si pensa anche alla possibilità che esistano omodimeri (ad

esempio GAD67-GAD67), ma possano esistere anche degli

eterodimeri (GAD65-GAD67), che potrebbero formarsi

preferenzialmente oppure avere importanza in determinate

condizioni fisiologiche o patologiche.

GAD65 (65kDa): localizzata in modo specifico nei terminali sinaptici, è

• associata con le vescicole sinaptiche: sintetizza quel pool di GABA che

viene rilasciato, attraverso le vescicole, dalle sinapsi GABAergiche.

Forma stretti complessi con il trasportatore vescicolare di GABA

(VGAT, Vesicular GABA Transporter), un antiporter che antiporta GABA

+

e H : infatti, GABA viene immagazzinato in vescicola contro gradiente

+

di concentrazione. Dato che un’ATPasi concentra H in vescicola, VGAT

+

trasporta GABA sfruttando il gradiente di H .

VGAT e GAD65 sono strettamente uniti: questo fa pensare

che VGAT favorisca il trasporto all'interno delle vescicole del

GABA formato attraverso la GAD65, anziché il GABA formato da

GAD67.

VGAT è stato clonato: se ne conosce il gene, che nel ratto e nell'uomo

codifica per una proteina di circa 525 amminoacidi, ed ha 10 domini

putativamente transmembrana. Sia il CTD che l’NTD sono citoplasmatici.

Sembra che lo stesso trasportatore o una molecola molto simile sia coinvolta

anche nella vescicolazione della glicina, che come sappiamo è l'altro

importante neurotrasmettitore inibitorio del sistema nervoso centrale,

soprattutto a livello del midollo spinale.

Regolazione di GAD

La regolazione delle GAD avviene a tanti livelli e l’espressione dei geni

GAD65 e GAD67 e la sintesi delle rispettive proteine sono regolate in modo

diverso. Ci sono diverse isoforme di GAD67 durante lo sviluppo, mentre non

sono riportate delle varianti per GAD65. Questo ha un senso se pensiamo

che sicuramente GAD67 viene prima di GAD65, perché GAD65 è associata

alla presenza di sinapsi funzionanti. GAD67 infatti è espressa precocemente

durante lo sviluppo, mentre GAD65 compare molto più tardi.

Le GAD sono soggette a palmitoilazione, rottura proteolitica e fosforilazione.

N.B.: palmitoilazione e depalmitoilazione permettono l'ancoraggio di proteine a vari tipi di

membrane.

In particolare, GAD65 è sintetizzata come proteina citosolica, ma poi sono presenti due residui di

cisteina (Cys30 e Cys45) che possono subire dei cicli di palmitoilazione e depalmitoilazione che

permetterebbero il trasporto di GAD65 dall'apparato del Golgi o dal reticolo endoplasmatico alle

zone presinaptiche dei neuroni.

Permette anche una regolazione dei livelli di enzima che sono presenti in un determinato

 momento nella sinapsi.

Ci sarà quindi sicuramente (anche se non è conosciuta bene) una regolazione che dipende

dall'attività neuronale.

La rottura proteolitica di GAD è stato visto che è in gran parte determinata dall'attivazione di una

proteasi, che è la calpaina. La calpaina genera delle forme troncate sia di GAD65, sia di GAD67.

Tuttavia le forme troncate di GAD65 hanno un'attività catalitica che è dalle 2 alle 3 volte più elevata

rispetto alla forma full-length, mentre le forme troncate di GAD67 perdono attività.

Anche l'effetto della fosforilazione è diverso sulle due isoforme di GAD: infatti GAD65 è attivata

dalla fosforilazione mediata da PKC, mentre GAD67 è inibita dalla fosforilazione mediata da PKA.

Le forme troncate di GAD65 si formano soprattutto in condizioni patologiche, cioè quando non c'è

da parte di GAD65 un'attività sufficientemente elevata per mantenere l'omeostasi GABAergica.

È stato infatti provato che GAD65 si può associare ai mitocondri.

Forse c’è un ruolo energetico!

L'attività della GABA transamminasi è localizzata a livello dei mitocondri,

dove ci sono il ciclo di Krebs e lo shunt del GABA.

GAD65 potrebbe anche allontanarsi da VGAT e dalle vescicole

 sinaptiche e associarsi, ancorarsi in qualche modo ai mitocondri.

A questo livello, il GABA prodotto dalla GAD65 diventerebbe un

substrato di GABA-T, e quindi verrebbe convertito in semialdeide

succinica e poi in succinato, entrerebbe così nel ciclo di Krebs e

favorirebbe pertanto la produzione di ATP in condizioni in cui la cellula

necessità di più energia.

L'associazione della GAD65 ai mitocondri potrebbe servire o localmente, per

fornire l'energia necessaria per il «refilling» delle vescicole contenenti GABA,

in condizioni in cui c'è un esaurimento (quindi, si suppone, condizioni di

stress o non fisiologiche), oppure, anche in sinapsi non GABAergiche, in altri

neuroni, o nella glia, per aumentare la produzione di ATP. Questa è un'ipotesi

confortata da diversi ritrovati sperimentali, ma che comunque deve essere

rivisitata.

Quindi GAD è molto strettamente regolata a livello post-traduzionale e a

livello genico, ed è anche ovviamente regolata dal microambiente, ed in

particolare dal pH. Il pH acido attiva la GAD. Inoltre, la GAD è particolarmente

attiva in anaerobiosi. In aerobiosi ovviamente aumenta anche il pH, perché

non essendoci O si avrà inizialmente glicolisi anaerobica con produzione di

2

acido lattico, o comunque si avrà un’inalterata produzione di CO e di

2

conseguenza si avrà un aumento dell'acidità. Infatti nei tessuti post-mortem i

livelli di GABA sono sempre elevati.

GABA come gliotrasmettitore

Abbiamo visto che ci sono dei gliotrasmettitori, e che la glia, attraverso il

rilascio di particolari molecole (glutammato, l'ATP, l'adenosina, la D-serina...)

può modulare l'attivazione sinaptica, potenziando o deprimendo il processo di

informazione.

Uno di questi gliotrasmettitori è il GABA. Infatti, GABA-T è altamente

espressa negli astrociti e a livello del cervelletto è stata osservata

immunoreattività per GAD, quindi è presente l'enzima di sintesi del GABA;

GAD è presente anche nei pedicelli, nei processi astrocitari nella corteccia

cerebellare umana.

Quindi potrebbe proprio servire a un rilascio localizzato di GABA.

È stato però anche visto che l'attività della GAD è sicuramente molto bassa

negli astrociti: quindi la GAD65 può essere ancora considerata un marker di

sinapsi GABAergiche.

Lo studio del GABA come gliotrasmettitore negli astrociti ha portato anche

all'identificazione di un pathway diverso, valido però sicuramente anche nei

neuroni, per la produzione di GABA: la derivazione da una poliammina, la

putrescina.

La putrescina attraverso un'acetilazione, che prevede l'intervento di ACoA,

produrrebbe una monoacetilputrescina.

A questo punto un'ossidazione attraverso una monoamminoossidasi

 (presente a livello della membrana esterna dei mitocondri) produrrebbe

N-acetil-γ-amminobutirraldeide (NAGABald).

Una seconda ossidazione darebbe poi origine a N-acetil-

GABA. A questo punto una deacetilazione darebbe origine al

GABA.

N.B.: Tutti gli enzimi che catalizzano questi step sono

presenti sia a livello gliale, sia a livello neuronale.

Il rilascio di GABA dagli astrociti avverrebbe per inversione dell'attività del

trasportatore.

I trasportatori del GABA sono dipendenti sia dalla temperatura, sia dalla

+ -

concentrazione ionica, soprattutto di ioni Na e Cl .

La ricaptazione termina (dando praticamente lo «switch-off») l'effetto del

GABA: il GABA viene eliminato (per la maggior parte) dalla tasca sinaptica.

Esistono diversi tipi, almeno tre diverse forme di trasportatori per il GABA:

GAT1 (GABA Transporter type 1)

• GAT2 (GABA Transporter type 2)

• GAT3 (GABA Transporter type 3)

Poi un tipo specifico di trasportatore che è presente a livello gliale. Anche se

c'è una forte omologia di sequenza, il trasportatore a livello gliale, BGT1, è

riconoscibile e identificabile soprattutto attraverso il suo profilo farmacologico:

è sensibile a una sostanza che si chiama betaina, che invece non è in grado

di interagire con i trasportatori neuronali.

Può essere «facilmente» riconosciuto l'apporto nella ricaptazione di

 GABA del trasportatore gliale rispetto all'apporto degli altri trasportatori.

Tutti questi trasportatori sono glicoproteine di circa 80kDa e hanno

12segmenti putativamente transmembrana; hanno le estremità -NH e

2

-COOH entrambe intracellulari. Il rapporto tra [GABA] /[GABA] ≈200.

in out

Quindi il GABA per essere trasportato all'interno delle cellule necessita

 di energia. +

È per questo che il trasportatore è Na -dipendente, e la sua attività

 -

dipende anche dalle concentrazioni di Cl : in caso di elevata attività si

ha una diminuzione del gradiente di sodio.

In caso di depolarizzazione si ha una diminuzione del gradiente di

sodio, e di conseguenza è possibile l'inversione dell'attività del

trasportatore.

Questo è importante perché quando l'attività neuronale è molto elevata è

necessario che venga rilasciato più GABA, sia dai neuroni, sia dalla glia. La

glia può quindi modulare in senso negativo, (portare a una diminuzione

dell'eccitazione), aumentando i livelli di GABA extracellulare.

Molto più della metà di tutte le sinapsi inibitorie è GABAergico, il GABA è il

principale neurotrasmettitore inibitorio. Probabilmente il 25% o il 30% delle

sinapsi è GABAergico.

La trasmissione GABAergica può avvenire attraverso recettori sia ionotropici

sia metabotropici legati alle proteine G.

Può essere molto veloce oppure più lenta: la trasmissione molto veloce

 avviene attraverso i canali ionici e i recettori che mediano la

trasmissione veloce sono i cosiddetti recettori GABA A, in cui il canale

-

ionico è un canale per il Cl . I recettori legati alle proteine G sono invece

recettori che mediano la trasmissione GABAergica più lenta.

Il recettore GABA A

GABA A media un incremento di conduttanza che porta ad

iperpolarizzazione della membrana neuronale attraverso l’ingresso di

-

Cl e di conseguenza ad un incremento della soglia (threshold) di

eccitabilità del neurone, risultando quindi in un effetto inibitorio sulla

depolarizzazione o sulla trasmissione che media la depolarizzazione

neuronale. I recettori GABA A, dopo pochissimo tempo che sono a contatto

con GABA o con una molecola che ne mima l'effetto, desensitizzano, cioè

diventano irresponsivi alle concentrazioni di GABA.

Per i recettori-canale ionico questo è un processo che avviene

fisiologicamente: il canale cambia stato, cioè passa da una forma attivata ad

una forma inattivata (chiusa). L'inattivazione, la desensitizzazione del

recettore può avvenire attraverso diversi meccanismi (tra cui la fosforilazione,

la downregulation, l'endocitosi di recettori, ecc.). Il processo di

desensitizzazione dei recettori GABA A non è stato ancora del tutto chiarito.

Il recettore GABA A è formato dall'assemblaggio di più subunità, e queste subunità sono composte

da sette famiglie: α, β, γ, δ, ε, θ, π . Ad ognuna di queste famiglie appartengono delle isoforme . Di

quelle scoperte finora, le isoforme più numerose sono per la subunità α. Sono state poi riconosciute

almeno 3 subunità β e 3 subunità γ (delle quali però γ2 è la più rappresentata), e non si conoscono

invece per ora delle isoforme delle altre subunità. Tutte le forme di assemblaggio del recettore

GABA portano alla formazione di un canale del cloro attivo. Il recettore GABA A è un pentamero.

Sebbene i recettori GABA A siano veramente molto eterogenei, la maggiore quantità di recettori

GABA A in tutto il sistema nervoso centrale è presente nella forma α β γ . Perché il recettore sia

2 2 1

molto efficace, attivo è necessario che due molecole di GABA si leghino al recettore: e queste

molecole di GABA si legano all'interfaccia fra una subunità α e una subunità β.

Questo spiega perché la composizione di cui sopra è quella più rappresentata praticamente

 in tutto il sistema nervoso centrale.

Caratteristiche:

• Ogni subunità è composta da 4STM.

• Il segmento transmembrana 2 è quello che forma la parete del poro.

• Dal dominio 1 si diparte un ampio loop N-terminale extracellulare, che ha sicuramente

importanza nel legame con il ligando GABA.

• È molto importante l'ansa citoplasmatica tra i domini 3 e 4, che è la porzione più variabile

nel recettore (mentre i domini transmembrana e la porzione extracellulare sono molto

conservati), a livello della quale avvengono i fenomeni di fosforilazione e defosforilazione e

l'ancoraggio e l'associazione con proteine scaffold modulatrici.

Questo spiega la variabilità: a seconda della localizzazione del recettore, dei diversi

tipi di cellule in cui esso è presente e dell'assemblaggio di subunità diverse il recettore

può interagire con proteine diverse ed avere comportamenti differenti, sia nei confronti

di molecole farmacologiche, sia nei confronti del GABA stesso.

La composizione in subunità è veramente importante, perché esistono delle

composizioni definite che sono presenti a livello della tasca sinaptica dei recettori

sinaptici ed esistono invece dei tipi di assemblaggio diversi, peculiari, che sono

presenti a formare i recettori extrasinaptici.

“Extrasinaptici” significa che questi recettori non sono presenti a livello della tasca sinaptica, ma

sono localizzati in zone periferiche della sinapsi o sugli assoni.

Quindi questi recettori non ricevono direttamente le elevate concentrazioni di GABA che

 vengono rilasciate e sono presenti a livello della tasca sinaptica, ma delle concentrazioni

(mM) che derivano dal cosiddetto spill-over, cioè rappresentano quella quantità di GABA

che riesce a sfuggire alla ricaptazione a livello sinaptico: questa concentrazione di GABA è

micromolare o inferiore.

Questi recettori sono sensibili a questo tipo di concentrazione di GABA e la composizione in

 subunità di questi recettori prevede in quasi tutti (ma non in tutti) la presenza della subunità

δ e la presenza soprattutto delle isoforme α5, α4 e α6, laddove nei recettori sinaptici sono

presenti soprattutto α1, α2 e α3.

La subunità γ, e in particolare la sua isoforma γ2, è presente soprattutto a livello dei recettori

sinaptici, anche se γ1 può essere presente anche a livello extrasinaptico.

Ricostruzione tridimensionale della presenza delle cinque diverse

subunità nella membrana (una è stata tolta al fine di rendere più

semplice l'osservazione).

Nel loop extracellulare ci sono delle sequenze ripetitive: si ripete molto spesso un Cys-loop di due

cisteine separate da 13 amminoacidi.

Il recettore GABA A è un recettore molto complesso e attraverso questo recettore farmaci diversi

possono esprimere la loro azione legandosi a dei siti allosterici (quindi ai quali non si lega il

GABA) specifici e l'uno diverso dall'altro.

All'interfaccia tra la subunità α e la subunità β c’è un sito a cui si lega il GABA, ma non è il solo:

GABA si lega anche a un sito dove si legano anche agonisti e antagonisti del GABA.

Ci sono dei siti allosterici (->quindi siti diverso da quello dove si lega il GABA) al quale, se si lega

un farmaco, questo provoca una modificazione conformazionale

che è in grado di modificare il sito di legame del GABA, quindi

favorendo l'azione del GABA oppure inibendola.

Ovviamente però questi siti non sono lì ad aspettare il farmaco

che diamo! Sono dei siti ai quali si legano delle molecole

endogene:in alcuni casi si sa perfettamente quali sono, in altri casi

non si sa ancora con sicurezza quali siano.

Il sito a cui si legano le benzodiazepine è situato tra la subunità α e la subunità γ. Questo significa

che nei recettori in cui non sono presenti entrambe queste subunità, le benzodiazepine non si

possono legare: non esiste il sito delle benzodiazepine. Nella maggior parte dei recettori

extrasinaptici non esiste il sito delle benzodiazepine, perché l'assemblaggio non prevede, nella

maggior parte di questi recettori, la presenza della subunità γ.

Conseguentemente i recettori extrasinaptici non sono sensibili alle benzodiazepine, e

 neanche al ligando endogeno, che non si sa bene quale sia.

Le benzodiazepine sono quei farmaci (Valium) che possono avere un effetto sedativo (cioè possono

provocare il sonno), anticonvulsivante (possono essere utilizzate anche nell'epilessia e ansiolitico.

-

Legandosi sul sito presente sul recettore del GABA incrementano la conduttanza al Cl : aumentano

-.

la frequenza di apertura del canale del Cl

Quindi favoriscono la conduzione GABAergica.

E’ presente anche un sito al quale si legano i barbiturici: anche i barbiturici sono delle molecole che

hanno (molto più delle benzodiazepine) un forte potere sedativo/ipnotico (portano il sonno). Ormai i

barbiturici sono utilizzati in pochi casi, ad esempio quando non è possibile utilizzare altri farmaci

nell'epilessia. Che cos'hanno di particolare i barbiturici? Quando si legano al loro sito sul recettore

-

del GABA prolungano il tempo di apertura del canale del Cl , però lo possono fare anche in assenza

di GABA: è per questo che sono molto più pericolosi delle benzodiazepine.

Esistono poi degli altri siti:

• un sito al quale si è visto che si legano i neurosteroidi

• uno al quale si legano molti anestetici che sono usati per le anestesie generali

• uno al quale si può legare una sostanza di derivazione vegetale che si chiama picrotossina e

che viene utilizzata per indurre convulsioni (quindi per costruire dei modelli animali sui

quali studiare le convulsioni)

• uno al quale si può legare bicucullina (anch’essa provoca convulsioni).

Questo è l'effetto di una benzodiazepina: a parità di

concentrazione di GABA (ad esempio presente a livello

extracellulare), la presenza e l'effetto delle benzodiazepine sul

recettore del GABA sposta la curva di interazione e di effetto del

GABA sui suoi recettori.

Fa sì che a parità di [GABA], in presenza di

 benzodiazepine si ha un effetto inibitorio molto più pronunciato.

Questo è uno studio di mutagenesi sito-specifica in

cui sono stati definiti gli amminoacidi che importanti nella

determinazione del sito di legame delle benzodiazepine e del

GABA a livello dei rispettivi siti allosterico e attivo: in

particolare sono importanti residui di glutammato, istidina e

altri. Modificandoli attraverso mutagenesi sito-specifica, questi amminoacidi

cambiano le proprietà del recettore.

La presenza di un particolare tipo di subunità nell'assemblaggio del recettore

può essere importante nel determinare la risposta fisiologica del recettore

stesso.

In regioni cerebrali diverse ci sono subunità diverse e questo è

 importante sia a livello fisiologico che a livello farmacologico.

Ad esempio il GABA interagendo con l’assemblaggio α1β2γ2 ha un'azione

anticonvulsivante, nel midollo spinale l'assemblaggio α2β3γ2 promuove

miorilassamento, la presenza di α5β3γ2 (ma soprattutto di α5 a livello

extrasinaptico, in particolare nella regione CA1 dell'ippocampo) ha

importanza nell'apprendimento e nella memorizzazione: l’assemblaggio non è

a caso, ma ha una sua funzione nella regione cerebrale in cui è

rappresentato.

Un certo tipo di assemblaggio è presente in una certa regione perché

 serve in quella regione, perché i neuroni hanno una determinata

funzione in quella regione.

Però questa presenza di subunità è anche molto variabile anche in una

stessa regione e in uno stesso tipo di neurone e può variare a seconda del

microambiente.

Questi recettori sono sensibili ai farmaci ma anche a ormoni e a

 neurotrasmettitori che sono presenti nell'ambiente, quindi queste

subunità possono assemblarsi per formare dei canali al GABA in modo

diverso nello stesso tipo di neurone a seconda ad esempio che il

neurone sia «bombardato» o meno da un certo tipo di ormone in una

determinata situazione: questo avviene ad esempio per i neurosteroidi.

Inibizione fasica e inibizione tonica

I recettori sinaptici di GABA mediano la normale trasmissione GABAergica,

quindi il rilascio transiente di GABA.

Quindi mediano un'inibizione fasica, perché transitoria.

I recettori extrasinaptici mediano invece un'inibizione tonica, cioè sono

mediatori di un tono inibitorio. Per essere mediatori di un tono inibitorio,

questi recettori devono avere delle caratteristiche particolari:

dovranno avere una composizione in subunità tale che permetta

• un'affinità elevata per il GABA, più elevata di quella dei recettori

sinaptici, perché sono esposti a delle concentrazioni molto inferiori di

GABA.

Avranno necessità di desensitizzare molto più lentamente, perché non

• si tratta di una corrente fasica, ma di un tono inibitorio: quindi dovranno

desensitizzare molto lentamente.

Sono stati purificati, clonati e testati recettori ricombinanti con diversi tipi di

assemblaggio, e si è visto che la subunità δ aumenta l'affinità per il GABA del

recettore e inibisce la desensitizzazione: ed infatti la subunità δ è presente in

quasi tutti i recettori extrasinaptici.

È stato visto che è possibile isolare l'attività elettrofisiologica di questi

recettori dai recettori sinaptici in colture cellulari o eventualmente anche in

fettine di tessuto, attraverso l'utilizzo di un antagonista del GABA a livello dei

recettori sinaptici che non interagisce con quelli extrasinaptici: la gabazina,

che inibisce i recettori sinaptici e quindi mette in evidenza le correnti che sono

mediate dai recettori extrasinaptici.

I recettori extrasinaptici non sono sensibili alle benzodiazepine, ma sono

particolarmente sensibili a un farmaco che agisce mimando l'effetto del

GABA, che si chiama gaboxadolo, e che è anche questo un sonnifero, che

però non interagisce tramite il sito di binding delle benzodiazepine.

Qui sono rappresentati recettori

sinaptici ed extrasinaptici; i diversi tipi

di assemblaggio sono codificati in

colori diverso.

Siccome i recettori extrasinaptici

possono non essere tutti in funzione

nello stesso momento, o comunque

possono apportare un contributo

diverso a seconda delle condizioni

cellulari del momento (-> presenza in

circolo degli ormoni che interagiscano principalmente con uno o con l'altro),

quello che viene fuori è un mix degli uni e degli altri.

Questo potrebbe anche mascherare l'effetto di una particolare molecola su un

certo tipo di recettori, come osservato sperimentalmente su tre diversi tipi

neuronali: neuroni del giro dentato dell'ippocampo, neuroni piramidali della

regione CA1 e neuroni dello strato molecolare dell'ippocampo. Questi neuroni

hanno una percentuale diversa di forme di assemblaggio dei vari tipi di

recettori: mentre quelli segnati in verde, giallo e nero più o meno sono uguali

in tutti i tipi neuronali, α βγ (blu) presenta una differenza molto evidente nei

5

diversi neuroni, e così anche αβδ (rosso).

È stato aggiunto dell'etanolo nella fettina di tessuto. Questo è in grado di

interagire con certi tipi di recettori del GABA (nell’istogramma sono a

confronto controllo ed etanolo):

Nelle cellule granulari dell'ippocampo si vede che la presenza di

• etanolo aumenta molto l'inibizione tonica dovuta al GABA.

Nella regione CA1 dell'ippocampo c'è invece una differenza marginale.

• Nelle cellule dello strato molecolare dell'ippocampo di nuovo la

• presenza di etanolo è in grado di aumentare di molto l'inibizione tonica

del GABA. Quindi nelle cellule piramidali dell'ippocampo l'effetto

dell'etanolo viene mascherato: non si può esprimere in modo

sufficiente, dato che la composizione dei recettori non lo permette.

Le 7 famiglie di subunità diverse sono codificate su geni che stanno su

cromosomi diversi (cromosoma 4, cromosoma 15, cromosoma x...). Il gene

che codifica la subunità δ è sul cromosoma 1. I geni per l’isoforma più

comune, α β γ , sono tutti sullo stesso cromosoma, che nell’uomo è il

2 2 1

cromosoma 5.

Possono essere indotti simultaneamente.

 trascrizione di questa forma recettoriale può essere coordinata.

La

La modulazione dell’attività di GABA A, oltre che attraverso l’espressione

delle diverse subunità che partecipano all’assemblaggio, può dipendere dai

livelli di fosforilazione. Questi recettori presentano a livello dei loop

citoplasmatici dei siti di fosforilazione per la pkA, pkC e per tirosin-chinasi

specifiche. Queste fosforilazioni tendono ad inibire l’attività del recettore e a

favorire la sua endocitosi e quindi la rimozione del recettore dalle membrane

sinaptiche.

I neurosteroidi

Le fluttuazioni che si possono avere fisiologicamente nei livelli di alcuni

ormoni (es. neurosteroidi) possono determinare una fluttuazione anche nella

composizione in subunità dei recettori GABAergici. Questa variazione è

chiaramente un meccanismo omeostatico, cioè un tentativo di adattamento

delle cellule, attraverso la modulazione nell’assemblaggio di questi recettori,

di riportare la situazione all’equilibrio.

I neurosteroidi durante le loro fluttuazioni agiscono anche sull’eccitabilità

neuronale: possono modulare il fatto che i neuroni siano “più svegli” o “meno

svegli”.

L’esposizione di breve durata ad alte [neurosteroidi] (es. progesterone,

 come durante il ciclo ovarico o in seguito ad episodi di stress acuto)

risulta in un decremento dell’espressione della subunità γ2 ed un

incremento dell’espressione della subunità δ.

dal punto di vista funzionale porta ad una diminuita

Questo

eccitabilità neuronale.

Minore suscettibilità alle convulsioni (ad esempio porta ad

un effetto ansiolitico nel topo).

Però se la concentrazione elevata persiste nel tempo porta ad un decremento

dell’espressione sia di γ2 che di δ.

Maggiore eccitabilità neuronale.

 modificazioni del tipo di subunità che compongono il

Quindi

recettore sono in grado di alterare l’eccitabilità neuronale!

Questo è un meccanismo omeostatico. I neurosteroidi potenziano l’attività

GABAergica, che è legata a fenomeni di sedazione e ansiolitici perché

l’iperpolarizzazione rende più difficile l’eccitazione neuronale.

Un’elevata concentrazione di neurosteroidi potrebbe portare a

 sedazione, mentre una variazione nelle subunità del recettore tende a

riportare la situazione in condizioni di equilibrio o per lo meno a rendere

transiente questo effetto degli ormoni.

In condizioni patologiche si possono avere alterate concentrazioni di ormoni

steroidei e questo fattore è associato anche a diverse patologie

neurodegenerative.

In cellule diverse questi recettori possono avere un corredo di proteine

ausiliarie differenti, possono cioè interagire in modo stretto e formare dei

complessi (discorso valido per tutti i recettori). Le proteine ausiliarie possono

essere diverse a seconda della localizzazione del recettore e del tipo di

cellule in cui recettore si trova. Questo contribuisce sia alla regolazione sia

alla selettività dei recettori in ambienti diversi.

Parecchie proteine sono in grado di intervenire in momenti diversi nella vita

del recettore GABAergico a partire dal suo assemblaggio (sintesi a livello del

RE, trasporto al Golgi e poi trasporto alla membrana cellulare).

Tanto per cominciare, i recettori devono essere mantenuti stabilmente a

livello della membrana cellulare e per questo non basta che siano proteine

integrali: devono anche essere mantenuti ancorati a proteine scaffold, che

saranno ancorate con delle proteine del citoscheletro. Per i recettori GABA

una proteina scaffold è la geferina , che clusterizza i recettori a livello delle

sinapsi. Un altra proteina che clusterizza i recettori GABA extrasinaptici nelle

zone extrasinaptiche è la radoxina .

I recettori, dall’ER e dal Golgi, dove vengono assemblati, sono trasportati alle

zone extrasinaptiche e da qui per diffusione laterale possono arrivare alla

zona sinaptica o rimanere nella zona extrasinaptica. Quale sia il meccanismo

per cui i recettori che hanno assemblaggio tipico dei recettori extrasinaptici

prendano una di queste due vie non si sa.

La geferina mantiene in gruppi i recettori a livello della densità postsinaptica

ed è una proteina in grado di legare ai siti di binding alcune subunità che

compongono i recettori sinaptici. La geferina in alcuni tipi di cellule prende

contatto diretto o indiretto con γ2, in altri tipi cellulari prende contatto con α2.

A sua volta la geferina ha siti dei siti binding per proteine adattatrici che si

legano ai microtubuli o all’actina.

I recettori vengono ancorati al citoscheletro.

Per i recettori extrasinaptici la proteina che li mantiene ancorati al

citoscheletro è la radoxina.

La quantità di queste proteine e l’efficienza degli adattatori al citoscheletro

hanno influenza sul numero di recettori GABAergici che sono presenti sia a

livello sinaptico che a livello extrasinaptico.

Questo può regolare sia l’attività della corrente tonica sia, calcolando il

 numero di recettori, influenzare l’attività inibitoria GABAergica fasica.

I recettori GABA legati in zona sinaptica alla

geferina possono essere internalizzati.

L’internalizzazione è un fenomeno che porta ad un

turnover dei recettori sulla membrana ed è in

grado anche di modulare l’attività di questi recettori

in seguito agli stimoli ai quali la sinapsi è esposta.

Se c’è molto GABA, i recettori

GABAergici sono fortemente stimolati in modo

cronico.

Per regolare l’attività GABAergica si

tenderà a diminuire il numero di recettori e avere

un numero maggiore di recettori endocitati.

Se invece non c’è abbastanza attività GABAergica ci

sarà, di contro, per un processo omeostatico, un

aumento dei recettori sulla membrana.

Dopo che i recettori sono stati internalizzati in endosomi, possono andare

incontro ad un processo degradativo.

O sono portati ai lisosomi e degradati o possono essere riciclati sulla

 membrana.

Il processo di internalizzazione avviene in vescicole la cui formazione

dipende dalla presenza di clatrina. L’endocitosi dei recettori GABAergici in

queste vescicole contenenti clatrina è favorita dalla proteina AP2, che

interagisce attraverso una sua subunità con la porzione CTD del recettore

GABAergico.

Se il recettore lega HAP (Huntintin associated protein, proteina associata

all’huntintina), questo legame favorisce il riciclo del recettore sulla membrana

invece di portarlo al processo degradativo.

A livello dell’assemblaggio nel reticolo, vi sono proteine importanti sia per i

recettori GABAergici che per altri recettori come le chaperonine, calnessina e

Bip, che sono attive nel correggere e riconoscere proteine che non hanno

ripiegamento corretto.

in grado di favorire il corretto ripiegamento e assemblaggio del

 pentamero del recettore del GABA. Le subunità che non assemblate o

non sono ripiegate in modo corretto vengono ubiquitinate e quindi

degradate dal proteasoma a questo livello.

Il legame del pentamero neoformato con una proteina chiamata PLIC

protegge il recettore dall’indirizzamento verso il proteasoma e favorisce il suo

passaggio al Golgi, dove interagisce con una proteina chiamata BIG (un

fattore di scambio dei nucleotidi guanilici) ma anche con altre proteine tra cui

un enzima,GODZ, che porta alla palmitoilazione del recettore, che serve per

ancorare temporaneamente il recettore alla membrana.

Palmitoilazione e depalmitoilazione servono per far progredire il

 recettore nel suo cammino attraverso la membrana e attraverso le

diverse membrane.

Ci sono tante altre proteine che legandosi al recettore favoriscono il suo

inserimento nella membrana cellulare, dove intervengono poi le proteine

scaffold.

N.B.: Abbiamo visto che il GABA provoca l’apertura del canale GABA A e

-

quindi l’entrata di Cl ; un agonista del GABA produce lo stesso effetto.

La presenza non transiente, ma costante, e quindi anche il trattamento

cronico con un agonista GABAergico, alla lunga, in una patologia,

produce una diminuzione dei recettori GABA A (down regulation). Il

processo inverso avviene se abbiamo un’antagonista. Se io blocco il

recettore ma stabilmente, tenderà ad aumentare il numero di recettori

per riuscire a ristabilire la funzione.

Esiste anche un’altra classe di recettori ionotropici, i GABA C, che però sono

solo a livello della retina e sono un sottotipo dei GABA A.

Recettori GABA B

Sono recettori metabotropici accoppiati a proteine G e sono attivati da una

sostanza detta baclofen (β4clorofenilGABA).

Sono presenti anche a livello periferico, in quanto il GABA è abbastanza

ubiquitario lo ritroviamo anche nel muscolo e nel fegato.

Nel cervello questi recettori sono localizzati a livello pre- e post-sinaptico e

sono presenti sia nelle sinapsi inibitorie sia nelle sinapsi eccitatorie (presenti

sia a livello pre e post-sinaptico anche in neuroni glutamatergici).

Bowery e Hudson hanno visto l’utilizzo di una sostanza che bloccava l’effetto

del GABA utilizzando come parametro la misurazione del rilascio di

noradrenalina marcata, in nervi periferici. Loro si aspettavano che utilizzando

un’antagonista GABAergico non ci fosse più inibizione del rilascio di

noradrenalina, invece hanno trovato che non aboliva completamente il

rilascio di noradrenalina anzi non aveva un grande effetto.

A livello del SNC (studiato su fettine) hanno visto che se loro stimolavano il

rilascio di noradrenalina, l’utilizzo di bicucullina (antagonista dei recettori del

GABA) non era in grado di bloccare l’inibizione del rilascio che era dovuto al

GABA.

Ma il GABA è in grado di inibire il rilascio di noradrenalina!

Un antagonista del GABA avrebbe dovuto abolire l’inibizione dovuta al

 GABA del il rilascio di noradrenalina ma questo non accadeva.

Hanno ipotizzato la presenza di 2 diversi tipi di recettori per il GABA:

• quelli sensibili alla bicucullina: recettori GABA A

• quelli non sensibili alla bicucullina: recettori GABA B

Venne scoperto il primo agonista selettivo per questi recettori: il baclofen, che

non ha affinità per i recettori GABA A ma attiva i recettori GABA B (viene

utilizzato anche oggi come antispastico). Un antagonista specifico derivato

del baclofen è il Phaclofen.

La somministrazione in animali di laboratorio di antagonisti per i recettori

GABA B non ha un effetto molto evidente, non causa quegli effetti tipici

dell’inibizione dei recettori GABA A: questi animali non hanno delle

convulsioni. Infatti, la gran parte dei recettori GABA A è legata all’inibizione

tonica, che favorisce una corrente inibitoria costante; per cui quando questa

viene inibita si hanno delle convulsioni generalizzate. Ma i recettori GABA B

sono più legati a correnti di tipo fasico.

I GABA A sinaptici sono fasici, i GABA A extrasinaptici sono quelli che

mediano la corrente inibitoria tonica (perché hanno una diversa disposizione

di subunità).

I GABA B hanno una struttura con 7 domini di transmembrana. Ci sono due

geni che codificano per 2 subunità diverse che sono chiamate GABA B1 e

GABA B2.

La forma attiva del recettore è un eterodimero obbligato. Inoltre c’è una

variante di splicing nella subunità GABA B1per cui si hanno due isoforme:

GABA B1a e GABA B1b, che differiscono per la presenza nella subunità

GABA B1a di due domini di interazione proteina-proteina detti sushi, che

hanno particolare sequenza amminoacidica che favorisce la locazione dei

recettori in particolari punti del neurone: per i recettori in cui presente la

subunità GABA B1a + GABA B2 è preferenziale la traslocazione alle

presinapsi, in particolare alle eccitatorie, ed ancora più in particolare nelle

zone assoniche. Invece a livello postsinaptico sono presenti entrambi le

isoforme, in particolare quando è presente l’isoforma GABA B1b i recettori si

localizzano a livello delle spine dendritiche.

GABA B1 e GABA B2 possiedono entrambe una zona con amminoacidi

idrofobici e un dominio extracellulare. La GABA B1 presenta un sito di binding

per il GABA e per gli agonisti al sito ortosterico (= sito dove si lega il ligando

endogeno, cioè GABA). Nella parte terminale, nel del dominio endocellulare

C-terminale, presenta anche una sequenza di KRR di ritenzione all’ER.

Questa subunità da sola non sarebbe in grado di raggiungere la

 superficie cellulare perché questo sito di ritenzione la bloccherebbe

all’ER!

Invece la subunità GABA B2 non è in grado di legare il GABA, ma contiene

siti di legame allosterici e, a livello delle anse citoplasmatiche, può interagire

con le proteine G (cosa che invece la GABA B1 non può fare) ed è in grado di

legare, mascherandolo, il sito KRR di ritenzione al RE della subunità GABA

B1. Conseguentemente il dimero è in grado di legare GABA, interagire con

 le proteine G e di essere trasportato in membrana plasmatica.

Un sito allosterico è un sito di binding a cui si possono legare dei composti

che tramite questo legame possono modificare il sito ortosterico e favorire

l’effetto del ligando endogeno aumentandone l’attività (o diminuendola?).

La subunità GABA B2 presenta siti allosterici che possono aumentare l’effetto

del GABA attraverso l’azione di particolari modulatori.

I recettori GABA B possono essere presenti a livello presinaptico:

• come autocettori, quando sono presenti sulle terminazioni

GABAergiche e inibiscono il rilascio GABA.

• In neuroni non GABAergici sono eterorecettori ed inibiscono il rilascio

di quel neurotrasmettitore specifico, questo avviene o attraverso

inibizione dell’adenilato ciclasi (->viene modulata l’attività del GABA

attraverso fosforilazione e defosforilazione coinvolgendo

concentrazione dell’cAMP coinvolgendo l’attività della PKA) o

2+

attraverso un’inibizione di canali per il Ca voltaggio-dipendenti (-

>diminuisce ingresso calcio e quindi rilascio del neurotrasmettitore)

A livello postsinaptico:

• Inibiscono l’eccitabilità neuronale attivando canali GIRK, portando

+

quindi ad un aumento del K e determinando l’iperpolarizzazione.

la sinapsi più difficilmente depolarizzabile (Interazione

Rendono

indiretta con gli effettori attraverso le proteine G). +

È stato visto che l’interazione con i canali per il K avviene nella

maggior parte dei casi tramite le proteine G, in particolare tramite le

subunità βγ delle proteine G che si legano al canale. Questo effetto

è inibito dalla tossina per la pertosse che blocca le proteine G. +

Tuttavia si è visto che in alcuni casi per molti tipi di canali per il K è

possibile un’interazione indiretta.

Schema di attivazione del canale GABA B:

L’attivazione della G protein legata a GABA B porta alla dissociazione di α, β

+

e γ. β e γ possono portare ad un’attivazione di K oppure inattivazione dei

2+

canali per il Ca voltaggio-dipendenti, mentre la subunità α regola in senso

inibitorio l’adenilato ciclasi.

Molti recettori per diversi neurotrasmettitori sono target di GABA B, in

particolare è stato studiato come target il recettore NMDA. Anche in questo

caso è importante la presenza di proteine ausiliarie, proteine che sono in

grado di ancorare i recettori GABA B alle proteine del citoscheletro (in questo

caso di mantenerle in determinate condizioni, di formare dei gruppi di

recettori e di formare dei complessi con delle proteine che sono importanti in

quel tipo cellulare, in quell’area della cellula per rendere più efficiente un

particolare tipo di inibizione).

Ad esempio ci può essere un cluster di proteine che attraverso uno scaffold

lega il recettore GABA, i canali, l’adenilato ciclasi e il recettore NMDA oppure

la proteina chinasi A.

Ad esempio una proteina scaffold può legare il recettore GABA A, l’adenilato

ciclasi e avere un sito di interazione proteina-proteina con la PKA. Si formano

dei complessi attraverso i quali si rende più efficiente e selettiva una

particolare azione.

GLUTAMMATO

Molto abbondante nel SNC ed è l’amminoacido più abbondante. Solo il 20%

del glutammato entra nel pool neurotrasmettitoriale.

Una percentuale elevatissima di neuroni eccitatori e di tutti i neuroni presenti

a livello cerebrale è glutamatergica.

A seconda dello stato di attivazione cerebrale il 50-80% dell’energia è

consumata per ripolarizzare le membrane che sono state depolarizzate dal

rilascio di glutammato (neurotrasmettitore eccitatorio).

Come il GABA anche il glutammato è una molecola molto idrofila, non è in

grado di passare la BBB e di conseguenza la sintesi avviene in loco.

Lo scheletro carbonioso del glutammato deriva dal glucosio attraverso il ciclo

di Krebs, attraverso in particolare l’α-chetoglutarato, mentre il gruppo

amminico deriva da amminoacidi che sono in grado di passare la BBB, in

particolare da amminoacidi ramificati: preferenzialmente da leucina, valina e

isoleucina. Ma captazione di glucosio è molto più alta di quella degli

amminoacidi,

il gruppo amminico deve essere riciclato.

 Viene mantenuto il gruppo carbonioso e riciclato il gruppo

amminico.

Il metabolismo del glutammato ha importanza nel metabolismo cellulare al di

là di un fatto neurotrasmettitoriale. Il glutammato può essere reversibilmente

trasformato. Quindi l’α-chetoglutarato ,che deriva dal ciclo di Krebs, dal

glucosio può essere trasformato attraverso transaminazione (reversibile) in

glutammato, che a sua volta il glutammato può essere trasformato in α-

chetoglutarato.

Poi attraverso la reazione della glutammato deidrogenasi viene rimosso NH 2

e il glutammato viene trasformato in α-chetoglutarato ma la reazione non è

reversibile.

Il glutammato può dare origine al glutatione, il principale antiossidante non

enzimatico a livello cerebrale, ed una γ-glutamil-cisteinil-glicina, un tripeptide

contenente glutammato.

Il glutammato attraverso la glutammato decarbossilasi dà origine al GABA.

Il glutammato può diventare substrato del GLUT cioè del trasportatore che

immagazzina il glutammato come neurotrasmettitore nelle vescicole

sinaptiche.

Il glutammato può essere trasformato in glutammina nella glia attraverso

l’enzima glutammina sintetasi e ancora a livello dei neuroni la glutammina

può essere trasformato in glutammato attraverso l’enzima glutamminasi.

Il 45% del turnover del glutammato passa attraverso glutammato-glutammina.

Il ciclo glutammato-glutammina

Il glutammato viene rilasciato dai neuroni e captato dagli astrociti, che

attraverso la glutammina sintetasi trasformano il glutammato in

glutammina. La glutammina viene poi rilasciata dalla glia e viene

ricaptata dal neuroni e metabolizzata dalla glutamminasi a glutammato.

Il glutammato è presente ubiquitariamente, la capacità di agire nel pool

neurotrasmettitoriale oppure nella sintesi del glutatione o nella sintesi delle

proteine dipende strettamente dalla sua compartimentalizzazione nel

citoplasma, nelle vescicole sinaptiche. La compartimentalizzazione dipende

da tanti fattori, ma soprattutto dai trasportatori. I trasportatori in grado di

immagazzinare il glutammato nelle vescicole sinaptiche prendono il nome di

GLUT e ne sono stati decritti almeno tre:

• GLUT1,GLUT2 presenti nei neuroni e anche nella glia

• GLUT3 in neuroni non glutamatergici

Il glutammato all’interno delle vescicole sinaptiche raggiunge concentrazioni

elevate (100mM) mentre a livello citoplasmatico può essere presente a

concentrazioni di 10mM; a livello extracellulare può essere transitoriamente

presente a concentrazioni più elevate quando viene rilasciato, ma poi deve

essere mantenuto a concentrazioni al di sotto di 5μM per non avere effetti

eccitotossici.

Infatti, dopo essere stato rilasciato dai neuroni glutamatergici, viene ricaptato,

cioè internalizzato, da trasportatori gliali e neuronali specifici chiamati EAAT.

Questi sono stati scoperti prima che nell’uomo nel ratto e nel topo. Nel topo

venivano chiamati GLT1 e GLAST (trasportatori gliali. In particolare

GLT1corrisponde a EAAT2) e nel ratto EAAC.

• EAAT1 e EAAT2 sono gliali.

• EAAT3, EAAT4 ed EAAT5 sono neuronali.

L’importanza dei trasportatori

I trasportatori tamponano il glutammato rilasciato. Infatti, il glutammato, una

volta che è stato rilasciato nella sinapsi, interagisce con i suoi recettori sia a

livello pre- che postsinaptico. Due tipi di tamponamento:

• una gran parte delle molecole di glutammato si lega a questi

trasportatori e non è in grado di interagire con il recettore

quindi in parte l’effetto è tamponato dalla presenza di questi

recettori.

• Poi in un secondo tempo tutto il glutammato viene ricaptato, soprattutto

da parte di EAAT2.

Questi trasportatori mediano l’ingresso di glutammato (e aspartato)

+ + + +

cotrasportandoo 3Na e H ed antiportando anche K . L’entrata di Na è

+

favorita nella cellula, mentre uno ione K viene trasportato verso l’esterno

della cellula.

Parte del glutammato viene allontanato per diffusione, anche in questo caso

si ha un fenomeno di spillover. I recettori che sono presenti a livello

extrasinaptico possono intervenire quando aumenta lo spillover e possono

intervenire anche nella regolazione della trasmissione eccitatoria.

Il glutammato è coinvolto nella maggior parte dei processi che avvengono a

livello cellulare. È stato studiato nella percezione delle sensazioni del dolore.

Alterazioni della funzione glutamatergica sembrano essere alla base di

patologie croniche.

I recettori per il glutammato possono essere ionotropici o metabotropici

I recettori per il glutammato possono essere ionotropici o metabotropici e

differiscono per il profilo farmacologico,l’energia molecolare e

l’elettrofisiologia.

Ci sono almeno 6 famiglie e in ogni famiglia si ha

circa l’80% di identità fra i vari membri.

I recettori ionotropici sono:

• NMDA

: possono essere composti da diversi tipi di subunità, la subunità

più comune che partecipa all’assemblaggio di tutti i recettori è la

subunità NR1.

• AMPA : sono dei tetrameri formati dall’assemblaggio di 4 subunità:

GluR1, GluR2, GluR3,GluR4. Non necessariamente tutte queste

subunità sono presenti nello stesso recettore. Si possono avere dalla

combinazione di queste subunità diversi tipi recettoriali ma tutti quanti

sensibili all’AMPA.

• Recettori kainato : sono sensibili a questa sostanza che è di per se una

tossina, è una sostanza che se somministrata provoca lesione a livello

cerebrale dove sono presenti neuroni glutamatergici e le subunità che

possono comporre il recettore kainato sono GluR5,GluR6,GluR7,KA1 e

KA2

Il glutammato è in grado di interagire con tutti questi tipi recettoriali, tuttavia

attraverso l’utilizzo di diversi composti farmacologici è stato possibile vedere

che esiste una distinzione far i vari tipi recettoriali. Ad esempio il N-

metildiaspartato è in grado di interagire solo con una frazione di recettori per

il glutammato e non interagisce con gli altri, di conseguenza questi recettori

hanno un sito di binding diverso rispetto agli altri e sui quali selettivamente

posso agire dei farmaci.

I recettori metabotropici sono composti da tre classi diverse: classe1,

classe2,classe3 composti ciascuno da subunità diverse e con effetti diversi

sui secondi messaggeri.

RECETTORE AMPA

Questi recettori normalmente sono dei canali attraverso cui passano cationi.

Sono selettivi per i cationi ma non per il tipo di catione, possono passare

sodio, potassio e in alcuni casi calcio. Generano la maggior parte dei

potenziali postsinaptici eccitatori veloci.

Quando il glutammato lega i recettori AMPA è attraverso questi recettori

 che si genera la depolarizzazione della membrana postsinaptica.

La presenza della subunità GluR2 nell’assemblaggio del recettore rende il

2+

recettore impermeabile al Ca . Dove non è presente GluR2 + +

nell’assemblaggio il recettore potrebbe essere permeabile al Na , al K e

2+

Ca , come avviene nella glia di Bergman, nel cervelletto. Si sa che ci sono

2+

dei canali voltaggio-dipendenti per il Ca nelle cellule gliali che si studiano in

2+

colture ma non è chiaro se esiste una permeabilità al Ca nelle cellule del

cervello in situ.

Il recettore AMPA è un tetramero, la subunità GlurR2 è molto simile alle altre

subunità, vi è un omologia di sequenza di più dell’80% nell’ambito della

stessa famiglia di subunità.

Vi sono putativamente per ogni subunità 4STM. In realtà il domino TMII, che

costituisce la parete del poro, non attraversa completamente la membrana

ma si ripiega su se stesso e questo permette al recettore di avere un NTD

extracellulare e un CTD endocellulare. Se il TMII attraversasse

completamente la membrana i due terminali dovrebbero essere extracellulari.

All’NTD c’è un grosso dominio extracellulare. Un altro

dominio extracellulare di grandi dimensioni si trova tra TMIII

e TMIV e costituisce parte della porzione del recettore che

lega il ligando. Vicino alla porzione TMIV nella regione

extracellulare c’è una regione flip-flop in cui si può avere

splicing alternativo e si possono formare delle isoforme

diverse (si tratta di una regione di 38 amminoacidi). La

differenza di isoforma tra la flip e la flop modula la

desensitizzazione e risensitizzazione del recettore quindi

la velocità con cui avviene questo procedimento. La

forma flip è soprattutto presente a livello embrionale e a fasi

iniziali dello sviluppo.

È presente a livello citoplasmatico, a livello del C-terminale, una zona in cui il

recettore viene fosforilato oppure si lega a domini PDZ .

I domini PDZ sono domini in grado di interagire con proteine scaffold, con

proteine presenti nella densità postsinaptica (zona post-sinaptica in cui sono

raggruppati i recettori). Un’importante proteina scaffold è PDS95.

Le proteine che contengono queste zone di interazione PDZ possono

essere diverse. Infatti la subunità Glur2 è in grado di legare una proteina, la

PICK1, che contiene dei domini PDZ ed è in grado di ancorarla alla densità

postsinaptica, però lega anche PKC-α e di formare con essa un complesso.

Anche altre subunità contengono i domini PDZ, però legano proteine diverse.

Quindi, anche se la struttura base è la stessa, le diverse subunità possono

essere ancorate a proteine diverse attraverso lo stesso meccanismo cioè il

legame PDZ.

Nella zona 2transmembrana è presente un sito di editing dell’RNA che può

interferire con la permeabilità al calcio della subunità GluR2.

Ma qual è la differenza tra GLUR 2 e GLUR1,3,4? GLUR2 subisce un errore di editing! In tutte le

altre subunità c’è una glutammina (Q), ma nella GLUR2

viene sostituita da un’arginina (R). La presenza 2+

dell’arginina porta ad una bassissima permeabilità al Ca .

I recettori in cui non è presente nell’assemblaggio

 2+

la subunità GLUR2 sono permeabili al Ca ,

mentre quelli in cui è presente la subunità GLUR2

2+

non sono permeabili al Ca .

Infatti, in studi di mutagenesi in cui si sostituiva

quell’arginina con la glutammina il canale tornava

2+

permeabile al Ca .

L’NTD è molto grande e ha un’importanza cruciale. E’

legato al dominio di binding (LBD) e forma una struttura bilobata . TMD è la parte

transmembrana. Il C-terminale va a interagire con proteine adattatrici, subunità ausiliarie regolatorie

che sono in grado di tenere legato il recettore al citoscheletro e sono in grado di farlo interagire in

modo preferenziale con altre proteine.

Nella figura E sono riportate le proteine ausiliarie che sono state anche recentemente associate al

recettore AMPA: Stargazina/TARP (TARP significa proteine associate al recettore AMPA),

cornichon 2 e 3; ultimamente sono state scoperte altre proteine che non si sa ancora bene come

agiscano. Circa il 30% dei recettori AMPA è modulato dalla famiglia delle stargazine. La

stargazina viene indicata come subunità γ2; le altre proteine che partecipano come ausiliarie nella

costituzione dei recettori AMPA sono γ3 γ4 γ5 γ7 γ8. La cosa importante è che queste proteine sono

in grado di modificare le proprietà di gating del recettore, le proprietà di corrente del recettore, le

proprietà farmacologiche (modificando il legame con gli antagonisti del recettore) e regolano anche

il trafficking del recettore, cioè il fatto che il recettore traffichi tra la membrana cellulare e l’interno

della cellula.

La presenza di queste proteine ausiliarie è determinante e la loro scoperta è avvenuta perché si è

visto che gli studi di corrente su recettori ricombinanti espressi in vitro non coincidevano con quelli

di recettori espressi in vivo o in situ.

Le cornichon 2 e 3 sono ampiamente distribuite nei neuroni e nella glia ma non sono presenti nel

cervelletto, dove invece dominano le proteine Stargazina/TARP. Sembrano influenzare le correnti

attraverso il recettore AMPA perché stabilizzano lo stato aperto del recettore.

Influenzano il processo di deattivazione/attivazione del recettore e potenziano le correnti

 AMPA.

Vediamo delle proteine TARP:

• γ1: fa parte della stessa famiglia della subunità γ che è presente come subunità regolatoria

nei canali per i VDCC; poi c’è una somiglianza strutturale anche con la famiglia delle

claudine che sono proteine presenti nelle tight-junction;

• Due classi di proteine γ:

γ2,3,4,8

o γ5,7

o

Sono associate ai recettori AMPA. La Stargazina ha questa struttura: attraversa per quattro

volte la membrana cellulare e ha un ampio loop extracellulare. Invece a livello della

porzione CTD intracellulare sono presenti dei motivi PDZ che permettono l’interazione con

altre proteine.

Le sinapsi glutamatergiche eccitatorie sono dette asimmetriche perché nella zona postsinaptica è

presente quella che viene definita densità postsinaptica (PSD), dove sono clusterizzate centinaia di

proteine tra le quali anche i recettori AMPA. Questa PSD è formata dall’assemblaggio di più

cluster di proteine e l’assemblaggio è dovuto alla presenza di sequenze consenso, sequenze di

interazione proteina-proteina sulle diverse proteine: è come se ci fossero dei velcro che si possono

appiccicare e staccare. Tra queste sequenze che permettono l’assemblaggio di complessi ci sono i

domini PDZ.

L’acronimo PDZ deriva dal fatto che per la prima volta sono stati descritti in proteine che si

chiamavano Postsinaptic density 95 (PSD95), che è la proteina forse più rappresentata nelle densità

postsinaptiche. Un’altra che si chiama discs large e zona occludens-1 tight junction protein. Questi

domini sono strisce di 85 aminoacidi che legano una sequenza consenso in cui sono presenti, in

questo caso, delle serine, o una serina e una treonina oppure una valina, una leucina o un’isoleucina,

vicini al CTD. Ci sono altri domini di interazione, come i domini SH2 e SH3, che permettono a

delle proteine chinasi di riconoscere dei domini specifici nella porzione citoplasmatica del recettore,

vicino ai siti di fosforilazione; poi ce ne sono tanti altri. Questi domini permettono l’assemblaggio

specifico fra loro di proteine.

Nel caso del recettore AMPA si è visto che il dominio citoplasmatico della proteina Stargazina, con

la quale si associa, è importante nel permettere l’espressione del recettore AMPA sulla superficie

della membrana perché lo tiene ancorato a elementi della PSD.

Una mutazione del loop extracellulare sfavorisce

l’interazione della stargazina con il recettore.

quindi deve essere un dominio che in qualche modo è

 legato all’associazione le due proteine.

Quando la sinapsi viene attivata, vengono attivati i recettori

2+ 2+

AMPA e NMDA, il Ca entra attraverso questi recettori e l’aumento di Ca porta a tutta una serie

di defosforilazioni e fosforilazioni.

Attivazioni di proteine chinasi che sono in grado di incrementare la presenza dei recettori

 AMPA a livello sinaptico.

Recettori NMDA + + 2+

Anche i recettori NMDA sono dei tetrameri, sono dei canali ionici permeabili al Na , K e al Ca ,

però l’attività conseguente all’attivazione dei recettori NMDA è in massima parte determinata

2+

dall’influsso di Ca .

Generano potenziali postsinaptici eccitatori, hanno una funzione importante

nella modulazione dell’attività sinaptica, sono legati a fenomeno di LTP e

LTD, sono legati alla possibilità di indurre in determinate condizioni danni

cellulari.

I recettori NDMA mediano una trasmissione sinaptica eccitatoria più lenta

rispetto ai recettori AMPA.

Sono molto simili ai recettori AMPA, la subunità NR1 è mostrata in figura.

Hanno varianti di splicing sia a livello del CTD che dell’NTD.

Ci sono più isoforme delle subunità: la forma più comune del recettore è un

tetramero costituito da due subunità NR1 e due subunità NR2. NR1 ha 8 varianti di splicing ed è

ubiquitaria; NR2 ha almeno 4 isoforme variamente espresse nelle diverse regioni cerebrali.

Ultimamente sono state descritte anche delle subunità NR3: queste subunità sono state meno

studiate, hanno caratteristiche un po’ diverse. NR3B è espressa primariamente nei motoneuroni.

Il recettore NMDA non può essere attivato dalla sola presenza di glutamato, è necessario un

coagonista!

Nella maggior parte dei casi il coagonista è la glicina.

Entrambi, glutammato e glicina, devono legarsi al recettore perché si apra il canale ionico e

 2+

quindi si abbia un influsso in Ca .

In alcuni tipi di neuroni è coagonista la D-serina.

Il glutammato si lega alle subunità NR2 nel tetramero mentre la glicina si lega a siti omologhi nelle

subunità NR1 oppure, dove è presente, alle subunità NR3.

Si è visto che alcuni tipi recettoriali dove non è presente la subunità NR2 ma è presente la NR1

sono sensibili solo alla glicina e non al glutammato: è un ristretto sottotipo, che non si sa bene se

venga assemblato in seguito a condizioni particolari, su cui il glutammato non ha effetto perché non

è presente il suo sito di interazione.

La NR2 è presente più o meno in tutto il cervello, ma le diverse isoforme hanno una localizzazione

molto precisa, il che fa supporre che nelle diverse regioni cerebrali siano localizzati recettori con

proprietà leggermente diverse.

Il recettore NMDA è molto complesso, però ritornano degli aspetti già descritti per il recettore del

GABA A: c’è un sito di binding ortosterico per il ligando endogeno e ci sono siti allosterici, che in

vario modo modulano il canale a livello delle zone nel recettore che formano il poro. I siti

fondamentali con cui sono in grado di interagire vari farmaci sono il sito per il glutammato (il sito

ortosterico per il ligando endogeno), il sito per la glicina, il canale ionico e l’NTD extracellulare del

recettore. Riconosciamo:

• siti di glicosilazione (generalizziamo: in tutti i recettori ci sono a livello extracellulare che

possono modulare il recettore);

• un sito redox dove sono presenti delle cisteine . Queste cisteine possono ossidarsi o possono

essere in forma ridotta a seconda dell’ambiente extracellulare: sono ridotte in condizioni di

normalità cellulare mentre possono ossidarsi in condizioni di danno cellulare. Se la

riduzione e l’ossidazione sono transienti, possono costituire un segnale o una modalità di

modulare transientemente il recettore: le cisteine ossidate regolano per esempio in senso

negativo il recettore, tendono a bloccarlo (questo è abbastanza logico perché in condizioni di

elevata attività cellulare in cu si può arrivare a un danno cellulare è meglio che un recettore

venga bloccato perché entra meno calcio nella cellula), invece cisteine ridotte hanno un

effetto positivo sulla modulazione del recettore quindi tendono a favorirne l’apertura;

• siti per il glutammato , al quale si legano anche agonisti come NMDA (N-metil-D-aspartato),

che dà il nome al recettore;

• sito per gli antagonisti

• sito sensibile agli idrogenioni

• sito della glicina

• sito sensibile alle poliamine

A livello del poro ci sono:

• siti sensibili allo zinco, che regola negativamente il recettore . In molti neuroni

2+

glutamatergici lo Zn può essere rilasciato insieme al glutamato e quindi può agire sui

recettori postsinaptici. 2+

se viene rilasciato molto Zn e quindi molto glutammato c’è una tendenza ad

adattarsi, ad inibire l’attività del recettore.

• sito PDP per la fenciclidina : è una droga comunemente chiamate angel dust (polvere degli

angeli) ed è un allucinogeno. A questo sito si lega anche la ketamina: è una sostanza usata in

anestesia che però ha degli effetti collaterali allucinogeni: fino a una settimana dopo

l’anestesia si possono avere incubi, allucinazioni. Per questo è stato ridotto un po’ il suo

utilizzo anche se ha degli effetti anche positivi.

Questo vuol dire che a livello del recettore NMDA vi è un sito la cui

stimolazione può portare a degli effetti allucinogeni.

• A livello endocellulare sono presenti i siti di fosforilazione e di interazione con altre proteine

di ancoraggio, proteine che legano il recettore alla PSD.

• Importante è il sito di blocco del magnesio . In condizioni di riposo (≈ -60mV) il recettore

2+

NMDA non è attivo perché la [Mg ] è in grado di bloccare il poro. Quando la membrana

out 2+

depolarizza viene rimosso il blocco da Mg e il recettore si attiva.

Questo spiega perché le correnti NMDA che provocano i potenziali postsinaptici eccitatori

sono più lente rispetto a quelle degli AMPA: perché è necessario che prima siano attivati i

recettori AMPA o un altro tipo recettoriale per il glutammato che inducano la

depolarizzazione, alla quale parteciperanno anche i canali voltaggio dipendenti.

Solo quando la membrana cellulare raggiungerà un certo grado di

depolarizzazione che è in grado di rimuovere il blocco da magnesio allora il recettore

NMDA si attiverà.

Infatti sono state descritte anche delle sinapsi che vengono chiamate “sinapsi silenti” in cui non si

possono registrare delle correnti NMDA perché non sono presenti in quel momento i recettori

AMPA.

La regolazione dell’attività dei recettori NMDA, oltre ai sistemi di fosforilazione, avviene

attraverso il numero di recettori e il luogo dove sono posti i recettori nella membrana sinaptica:

esistono sia recettori sinaptici (presenti a livello della PSD) sia dei recettori extrasinaptici. In

particolare fra questi ci sono dei recettori che vengono chiamati metasinaptici che sono in zona

perisinaptica (in una zona intorno ai 100 nm dalla PSD) e poi ci sono dei recettori che sono presenti


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DETTAGLI
Esame: Neurochimica
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in neurobiologia
SSD:
Università: Pavia - Unipv
A.A.: 2013-2014

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher helektron89 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Neurochimica e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Pavia - Unipv o del prof Curti Daniela.

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