Appunti di neurochimica

Esperimento di Paul Ehlrich e la barriera ematoencefalica

Paul Ehlrich fece un esperimento iniettando dei coloranti nel torrente circolatorio e si accorse che il cervello ed il midollo spinale erano gli unici organi a rimanere incolori: infatti, sono protetti dalla barriera ematoencefalica, che non permette il passaggio delle molecole idrofiliche e di elevato peso molecolare. Infatti, iniettando il colorante nel liquido cefalorachidiano si colorano. Però la prova è arrivata solo negli anni '60 col microscopio elettronico.

Struttura e funzioni della barriera ematoencefalica

La barriera ematoencefalica (Blood-Brain Barrier = BBB) è formata dalle cellule endoteliali dei capillari sanguigni, che non sono fenestrate, ma hanno delle tight junction (giunzioni serrate) che impediscono il passaggio di molte molecole. La BBB mostra una faccia ab-luminale che è la parte che guarda il cervello, e una faccia luminale che guarda il centro del vaso, quindi il torrente circolatorio. Accanto alle cellule endoteliali formano una barriera fisica anche delle altre componenti del parenchima cerebrale: gli astrociti e i periciti (cellule contrattili separate dalla membrana basale mediante una matrice extracellulare di collagene).

Funzioni della BBB

• Protegge da sostanze tossiche e virus.
• Rende il SNC parzialmente indipendente dalle fluttuazioni, non prevedibili, della composizione chimica del sangue (entro certi limiti).

In questo modo, il SNC subisce meno gli influssi di qualunque evento, ad esempio un evento stressante che provoca una variazione della concentrazione ormonale sanguigna.

Barriera ematoliquorale e plesso corioideo

Nelle zone limitrofe ai ventricoli esiste una barriera ematoliquorale (BCSF-barrier). Il plesso corioideo è una struttura, presente all'interno dei ventricoli cerebrali, dove viene prodotto il liquido cefalorachidiano o cerebrospinale (CSF). I plessi corioidei sono formati da villi corioidei, ciascuno dei quali è costituito da un asse vascolare, il capillare corioideo, che origina dai rami terminali delle arterie corioidee e da un monostrato di cellule cilindriche, l’epitelio corioideo, che deriva dall’ependima, l’epitelio che riveste l’interno delle pareti ventricolari.

I capillari corioidei della barriera ematoliquorale sono fenestrati e la reale barriera è a livello delle cellule ependimali che delimitano i ventricoli. Dal torrente circolatorio possono filtrare, attraverso le cellule ependimali, i componenti che vanno a formare il liquido cerebrospinale, ma non altre sostanze. Il liquido cerebrospinale è importante perché attutisce le pressioni, permette il ricambio e lava via metaboliti e cataboliti.

Riassorbimento del liquido cefalorachidiano

Il liquido cefalorachidiano che è secreto a livello dei plessi corioidei viene poi riassorbito a livello dei villi aracnoidei delle meningi.

Differenze tra le barriere ematoencefalica ed ematoliquorale

• La BBB separa il sangue dal cervello. È costituita anatomicamente dalla parete endoteliale dei capillari cerebrali e dai piedi o processi perivascolari degli astrociti.
• La BCSF separa il sangue dal liquido cefalorachidiano. È situata a livello dei plessi corioidei dei ventricoli cerebrali e, pertanto, è composta dalla parete dei capillari corioidei e dalle cellule dell’epitelio corioideo.

Nella formazione di entrambe, giocano un ruolo fondamentale le connessioni con gli astrociti: i processi astrocitari ricoprono quasi per il 90% la parete dei capillari e costituiscono delle vere e proprie unità funzionali dette unità neurovascolari. Gli astrociti sono sensibili alle variazioni dell’attività neuronale e trasmettono queste variazioni ai capillari variando il volume dei vasi stessi e quindi modificando la quantità di nutrienti che può essere riversata nel parenchima cerebrale.

Immagini e strutture delle barriere

In questa immagine ottenuta con microscopia a fluorescenza sono visibili gli astrociti marcati con SR101 (verde) che formano una fitta rete, quasi un rivestimento attorno ai vasi sanguigni, marcati con destrano (rosso).

I capillari non hanno la tonaca muscolare. Il loro calibro può essere modificato solo attraverso l’interazione con altre cellule in grado di contrarsi. Ci pensano i periciti! Infatti, nei periciti sono espresse proteine legate alla contrazione, come l’actina e la tropomiosina, che possono intervenire per modificare il diametro dei capillari e conseguentemente incrementare o ridurre il flusso sanguigno.

Organi circumventricolari

Organi circumventricolari sono aree cerebrali in cui la barriera o non esiste o è debole. Questo permette al cervello di monitorare la composizione del torrente circolatorio e di rispondere di conseguenza, magari rilasciando degli ormoni o attivando determinate ghiandole. Fra queste regioni ci sono:

• La ghiandola pineale (ha le dimensioni di un pisello e secerne melatonina)
• La neuroipofisi (che rilascia ossitocina, legato alle cure parentali, al rilascio di ormoni femminili e la vasopressina, che è l’ormone antidiuretico)
• L’area postrema (che contiene il centro del vomito)
• L’organo subfornicale (che regola i liquidi corporei)
• L’organo vascolare della lamina terminale (che rivela la presenza di peptidi)
• L’eminenza mediana (che modula l’adenoipofisi a livello ipotalamico)

Ci sono pochi organi che sono in grado di monitorare quello che succede ed eventualmente interagiscono con l’organismo modificando il rilascio di sostanze nel torrente circolatorio.

Cellule del sistema nervoso

Nel sistema nervoso sono presenti diversi tipi cellulari: le cellule gliali (astrociti e oligodendrociti), i neuroni, la microglia, le cellule ependimali e le cellule endoteliali dei vasi. Tutte queste componenti hanno interazioni molto strette tra di loro e si modulano a vicenda in modo estremamente sofisticato e complesso.

Modulazione e ridondanza

Nei sistemi di modulazione è presente ridondanza, nel senso che ogni fenomeno è regolato da più meccanismi: positivi (induttori) e contrari (inibitori) e anche sovrameccanismi che modulano entrambi i meccanismi (sia quello positivo che quello contrario). Le diverse cellule si possono distinguere dal punto di vista elettrofisiologico, oppure dal punto di vista citochimico/citoimmunologico grazie a dei markers specifici. Ogni cellula è caratterizzata da un diverso pool proteico e le singole proteine possono essere evidenziate dopo essersi legate con uno specifico anticorpo e anti-anticorpo.

Se si individuano delle molecole molto specifiche presenti solo ed esclusivamente in un determinato tipo cellulare, allora si possono utilizzare markers specifici per quella molecola in modo da identificare in modo univoco di che cellula si tratta. Ci sono più markers per ogni tipo cellulare che possono essere più o meno specifici anche in base al grado di maturazione della cellula in questione.

In questa immagine ottenuta con microscopia a fluorescenza si distinguono diversi tipi cellulari grazie alla marcatura con fluorofori di diverso colore. I neuroni sono marcati con anticorpo anti β-tubulina III+ anticorpo secondario coniugato con Alexa 633 (rosso). Gli astrociti sono marcati con anticorpo anti-GFAP + anticorpo secondario coniugato con Alexa 488.

Riconoscimento e interazioni cellulari

Nel sistema nervoso non è importante solo identificare una certa cellula e la sua tipologia, ma soprattutto individuare le relazioni che questa cellula ha con ciò che la circonda. L’iniezione di traccianti retrogradi fluorescenti, come il Fluorogold, a livello delle sinapsi aiuta a comprendere il network cerebrale e quindi le connessioni tra i vari elementi. Questo colorante viene trasportato in modo retrogrado verso il soma neuronale e mostra la morfologia del neurone e la sua localizzazione.

Tecniche di immunofluorescenza e immunoistochimica

Alle tecniche di immunofluorescenza vengono affiancate quelle di immunoistochimica: uso di anticorpi in grado di reagire con uno specifico substrato secondo una reazione conosciuta. La sezione viene poi osservata al microscopio ottico e il luogo in cui la reazione è avvenuta sarà colorato in marrone/nero.

Topi transgenici e mappatura dei circuiti cerebrali

Infine, una tecnica messa a punto circa 7 anni fa, prevede l’utilizzo di topi transgenici in cui, attraverso un sistema di ricombinazione chiamato Cre/Lox, è possibile inserire a livello del genoma dei geni derivati da coralli o meduse che codificano per proteine naturalmente fluorescenti (rosso, giallo, ciano e verde). A seconda del numero di geni inseriti e dell’intensità con cui vengono espressi, che è diversa nelle diverse cellule, si possono identificare addirittura i singoli neuroni, i singoli astrociti, i singoli assoni. Oltretutto si può utilizzare un promotore che vada bene per tutte le tipologie cellulari o un promotore selettivo per uno specifico tipo cellulare. Si possono così avere fino a 90 diverse sfumature di colore! Questa tecnica si può utilizzare per mappare i circuiti cerebrali, per identificare connessioni e per effettuare studi sullo sviluppo cerebrale e sull’invecchiamento.

Caratteristiche dei neuroni e dei motoneuroni

I neuroni sono cellule polarizzate: hanno poli specifici e non tutti i poli della cellula si equivalgono. Dal soma si dipartono due diversi tipi di processi: in una zona ci sono le ramificazioni dendritiche, nell’altra c’è un unico assone che va a prendere contatto sinaptico con altri assoni, con corpi cellulari o con particolari zone di altre cellule.

I neuroni possono essere interneuroni, cioè avere corpo e processi nella stessa regione cerebrale, oppure possono proiettare il loro assone in un'altra regione cerebrale o su un organo. I motoneuroni sono i neuroni con le proiezioni più lunghe in assoluto e si trovano a livello corticale nella corteccia motoria somato-sensoriale, oppure a livello del midollo spinale, nelle corna ventrali, da cui escono i loro processi che vanno ad innervare la muscolatura scheletrica per produrne il movimento. I motoneuroni hanno diverse peculiarità rispetto agli altri neuroni, in particolare poiché prendono contatto sinaptico con le fibrocellule muscolari, formando le placche neuromuscolari; proiettano fuori dal SNC, pur avendo i corpi all’interno del SNC protetti dalla BBB.

Questo significa che possono essere esposti a livello sinaptico ad agenti esogeni e questo può essere talvolta negativo. Gli assoni dei motoneuroni sono mielinizzati da oligodendrociti e cellule di Schwann, un particolare tipo di glia presente nel SNP. Queste cellule formano un envelopment, cioè impacchettano tutto l’assone lasciando solo dei piccoli spazi, i nodi di Ranvier, a livello dei quali sono concentrati i canali voltaggio dipendenti. La conduzione dell’impulso si dice saltatoria. Un’altra caratteristica dei neuroni è che a livello dendritico possono essere presenti le spine.

Spine dendritiche e neurotrasmettitori

Queste spine, localizzate in particolare negli interneuroni a livello corticale, sono delle sinapsi glutamatergiche eccitatorie che, a seconda dello stato fisiologico, del microambiente (->degli stimoli che arrivano) possono essere più o meno numerose e cambiare dinamicamente. Il numero di spine e la loro variazione è stata associata ai processi di memorizzazione.

Esistono diversi tipi di neurotrasmettitori (NT) con diversi pathways. Alcuni sono presenti in neuroni che proiettano in zone del cervello lontane dal proprio soma, mentre altri sono presenti solo in circuiti locali. I neuroni noradrenergici, hanno il corpo neuronale localizzato nel locus coeruleus, da cui si dipartono gli assoni che vanno ad innervare tutto il resto del cervello.

La stessa cosa è valida per la serotonina: il nucleo del rafe magno è uno dei più importanti nuclei serotoninergici, lì si trovano i corpi e da lì si dipartono fibre che in direzione centrifuga vanno verso il resto del cervello. La dopamina ha sia interneuroni che neuroni con lunghe proiezioni. Se invece consideriamo il GABA vediamo che è presente soprattutto negli interneuroni che hanno un andamento centripeto: i nuclei sono esterni e mandano le proiezioni all’interno. I neuroni GABAergici formano dei veri e propri sincizi: una rete inibitoria che modula l’eccitazione cerebrale. Glutamato e aspartato sono eccitatori e hanno andamento centripeto come il GABA con proiezioni lunghe verso l’interno e nuclei esterni.

Divisione e proliferazione delle cellule nel sistema nervoso

I neuroni sono cellule post-mitotiche, cioè che non si dividono più dopo l’ontogenesi. Invece, la glia continua a moltiplicarsi e può farlo in seguito ad uno stimolo indotto da danni ai neuroni. La glia che si attiva in seguito ad uno stimolo di questo tipo è detta glia reattiva e le cellule gliali prodotte possono andare ad occupare il posto che era prima dei neuroni formando una cicatrice. Es. nella SLA si ha una degenerazione progressiva e selettiva dei motoneuroni che vengono sostituiti da cellule gliali. Il tessuto cicatriziale che formano è indurito (scleros = duro) e non ha le stesse caratteristiche di quello precedentemente presente.

Le cellule gliali reattive hanno caratteristiche diverse da quelle che non si moltiplicano: i processi sono accorciati, ipertrofici e poco lineari. Come tutti i fenomeni, la reattività della glia può, entro certi limiti, essere utile perché rilascia delle sostanze, come le citochine, che possono avere effetti positivi sui neuroni; tuttavia, se il processo è troppo intenso c’è uno switch verso un danno.

Funzioni degli astrociti e della glia

Le cellule della glia non sono polarizzate perché i processi sono simili in tutte le parti cellulari, non formano sinapsi, non sono eccitabili elettricamente (in vitro è possibile rilevare la presenza di canali voltaggio dipendenti per il Ca²⁺, ma in vivo questi canali non sono presenti). Prima si riteneva che gli astrociti fossero solo un sostegno, ma ora è stato visto che sono in grado di modulare l’attività neuronale; inoltre, ci sono molti studi che dimostrano che gli astrociti possono rilasciare dei trasmettitori (gliotrasmettitori) che possono modulare l’attività sinaptica dei neuroni adiacenti.

Un gruppo di Zurigo ha visto a livello delle sinapsi eccitatorie nell’ippocampo dei recettori ionotropici per il glutamato chiamati NMDA. Però questi recettori sono spostati perifericamente, quindi quando il glutamato viene rilasciato dal neurone nello spazio intersinaptico non può interagire con questi recettori perché si concentra a livello della postsinapsi e anche perché i processi di degradazione e ricaptazione sono molto veloci. Solo se vengono rilasciate enormi quantità di glutamato questo riesce a raggiungere i recettori periferici. Ma gli astrociti che avvolgono queste sinapsi hanno delle microvescicole contenenti glutamato nella membrana giustapposta a questi recettori; questo glutamato può essere rilasciato a seguito di stimolazione.

Il glutamato rilasciato dagli astrociti interagisce con quei recettori periferici e intensifica l’attività della sinapsi. Gli astrociti possono modulare la trasmissione sinaptica. Però il rilascio di queste microvescicole gliali e del loro contenuto non è dipendente dal Ca²⁺ nello stesso modo in cui lo è il rilascio dei NT nei neuroni: nei neuroni sono necessari una depolarizzazione ed un ingresso spontaneo di Ca²⁺ all’interno della cellula per la fusione delle vescicole con la membrana presinaptica, invece negli astrociti il Ca²⁺ deriva dai magazzini interni alla cellula, quindi dal reticolo endoplasmatico, da cui viene liberato grazie a dei recettori purinergici (ionotropici o metabotropici).

Oltre al glutamato, le cellule gliali possono rilasciare anche ATP, D-Serina. Accanto ad un potenziamento della sinapsi ad opera degli astrociti, può esserci anche un effetto inibitorio. A livello postsinaptico sono presenti dei recettori per l’acetilcolina (Ach), ma anche la glia ne ha, anche se strutturalmente sono un po’ diversi. L’Ach che viene rilasciata dal neurone presinaptico va a stimolare sia i recettori postsinaptici che quelli gliali. Nella postsinapsi ha una funzione eccitatoria, mentre nella glia stimola il rilascio di una proteina specifica, la Ach-binding protein. Questa proteina sottrae l’Ach dalla tasca sinaptica impedendole il legame ai recettori postsinaptici e quindi inibisce la trasmissione del segnale perché limita il potenziale eccitatorio provocato dall’Ach. Questo dimostra che la presenza della glia può modulare l’attività sinaptica.

Conclusioni sulle funzioni degli astrociti

In questi ultimi 10/15 anni si è visto che gli astrociti sono parte attiva nella modulazione dell’attività neuronale e non hanno soltanto funzione trofica, strutturale e di fornitura di metaboliti ai neuroni, si è iniziato a parlare di sinapsi tripartita: l’unità sinaptica funzionale comprende una porzione presinaptica del neurone, una porzione postsinaptica del neurone e la glia.

Criteri per definire un astrocita maturo

Gli astrociti sono cellule molto diverse tra loro quindi hanno un corredo enzimatico, proteico e recettoriale diverso. Anche la funzione sarà diversa: a seconda della regione cerebrale in cui sono localizzati potranno rilasciare determinati metaboliti, determinati fattori di crescita, e non altri. Quindi per affermare che una cellula è un astrocita bisogna avere delle evidenze sperimentali e si sono scelti dei criteri che sono:

• Non eccitabilità elettrica. Infatti, gli astrociti nel tessuto in situ non sembrano avere canali voltaggio-dipendenti per il Ca²⁺ o per il Na⁺, ma sono ricchi di canali voltaggio-dipendenti per il K⁺. Quindi hanno un potenziale transmembrana come tutte le altre celle
• Hanno un potenziale di membrana molto negativo (-75mV) proprio a causa dei canali voltaggio-dipendenti per il K⁺. Questo è importante perché quando i neuroni sono molto attivi, rilasciano neurotrasmettitore e sono depolarizzati: la fase di ripolarizzazione prevede un’uscita di K⁺ all’esterno della cellula. Ma se nel fluido extracellulare c’è già un’elevata concentrazione di K⁺, questo ha un effetto depolarizzante. Quindi le cellule della glia funzionano da sink (pozzi) sequestrando K⁺ e quindi