Appunti di neurochimica

GABA.

Quando non serve più, il GABA viene degradato a



semialdeide succinica dalla GABA-α-chetoglutarico

transamminasi (GABA transamminasi, GABA-T).

La semialdeide succinica viene poi trasformata dalla



semialdeide succinica deidrogenasi in succinato e rientra nel

ciclo di Krebs.

Quindi dal glutammato si forma, attraverso la GAD, il GABA, che



viene degradato attraverso l'enzima GABA transamminasi a

semialdeide succinica; nel contempo una molecola di α-chetoglutarato

che deriva dal ciclo di Krebs viene trasformata in glutammato attraverso

questa stessa transaminazione.

La GABA-T catalizza, attraverso la transaminazione, la



formazione di semialdeide succinica per degradazione del GABA e

la formazione di glutammato a partire da α-chetoglutarato.

Quindi per ogni molecola di GABA (formatasi dal



glutammato) che viene degradata viene ripristinata una molecola

di glutammato.

La semialdeide succinica viene poi trasformata dalla semialdeide succinico

deidrogenasi in succinato e rientra nel ciclo di Krebs: in questo modo non

vengono depauperati gli intermedi del ciclo di Krebs.

Tuttavia questo shunt del GABA porta ad una perdita energetica! Infatti, se

l'α-chetoglutarato invece di essere deviato («shunted») verso lo shunt del

GABA proseguisse nel ciclo di Krebs formerebbe succinil-CoA attraverso l'α-

chetoglutarato deidrogenasi.

Si avrebbe la produzione di una molecola di GTP! Poi attraverso la

 succinato deidrogenasi si formerebbe il succinato.

Quindi per ogni molecola di α-chetoglutarato che entra nello shunt



del GABA si perde un GTP, una possibilità energetica!

Si è visto che l'inibizione della GAD, e quindi della produzione di GABA,

attraverso degli inibitori specifici (come l’allilglicina) porta a convulsioni, che

infatti sono caratterizzate da uno squilibrio del sistema GABAergico (anche

l’epilessia).

Invece il sodio valproato (farmaco antiepilettico) blocca la GABA

transamminasi (enzima di degradazione del GABA).

Disponibili più molecole di GABA.

 Allevia i fenomeni convulsivi.



Ci sono almeno due principali isoforme di GAD nel cervello, codificate da due

geni diversi e con distribuzione diversa:

GAD67 (67kDa): presente a livello citoplasmatico nei neuroni

• GABAergici, e sintetizza un pool di GABA che non è vescicolare. A cosa

serve? Teorie:

Si è pensato che GABA venisse utilizzato come fattore trofico per

o la sinaptogenesi, e che fosse importante soprattutto durante lo

sviluppo.

In seguito si è pensato GABA potesse essere un fattore

o neuroprotettivo nella sinapsi e anche una fonte energetica, in

quanto poteva sostituire oppure «appoggiare» il «replenishment»

l'apporto di più intermedi nel ciclo di Krebs.

Siccome si è scoperto che le GAD agiscono soprattutto come

o dimeri, si pensa anche alla possibilità che esistano omodimeri (ad

esempio GAD67-GAD67), ma possano esistere anche degli

eterodimeri (GAD65-GAD67), che potrebbero formarsi

preferenzialmente oppure avere importanza in determinate

condizioni fisiologiche o patologiche.

GAD65 (65kDa): localizzata in modo specifico nei terminali sinaptici, è

• associata con le vescicole sinaptiche: sintetizza quel pool di GABA che

viene rilasciato, attraverso le vescicole, dalle sinapsi GABAergiche.

Forma stretti complessi con il trasportatore vescicolare di GABA

(VGAT, Vesicular GABA Transporter), un antiporter che antiporta GABA

+

e H : infatti, GABA viene immagazzinato in vescicola contro gradiente

+

di concentrazione. Dato che un’ATPasi concentra H in vescicola, VGAT

+

trasporta GABA sfruttando il gradiente di H .

VGAT e GAD65 sono strettamente uniti: questo fa pensare



che VGAT favorisca il trasporto all'interno delle vescicole del

GABA formato attraverso la GAD65, anziché il GABA formato da

GAD67.

VGAT è stato clonato: se ne conosce il gene, che nel ratto e nell'uomo

codifica per una proteina di circa 525 amminoacidi, ed ha 10 domini

putativamente transmembrana. Sia il CTD che l’NTD sono citoplasmatici.

Sembra che lo stesso trasportatore o una molecola molto simile sia coinvolta

anche nella vescicolazione della glicina, che come sappiamo è l'altro

importante neurotrasmettitore inibitorio del sistema nervoso centrale,

soprattutto a livello del midollo spinale.

Regolazione di GAD

La regolazione delle GAD avviene a tanti livelli e l’espressione dei geni

GAD65 e GAD67 e la sintesi delle rispettive proteine sono regolate in modo

diverso. Ci sono diverse isoforme di GAD67 durante lo sviluppo, mentre non

sono riportate delle varianti per GAD65. Questo ha un senso se pensiamo

che sicuramente GAD67 viene prima di GAD65, perché GAD65 è associata

alla presenza di sinapsi funzionanti. GAD67 infatti è espressa precocemente

durante lo sviluppo, mentre GAD65 compare molto più tardi.

Le GAD sono soggette a palmitoilazione, rottura proteolitica e fosforilazione.

N.B.: palmitoilazione e depalmitoilazione permettono l'ancoraggio di proteine a vari tipi di

membrane.

In particolare, GAD65 è sintetizzata come proteina citosolica, ma poi sono presenti due residui di

cisteina (Cys30 e Cys45) che possono subire dei cicli di palmitoilazione e depalmitoilazione che

permetterebbero il trasporto di GAD65 dall'apparato del Golgi o dal reticolo endoplasmatico alle

zone presinaptiche dei neuroni.

Permette anche una regolazione dei livelli di enzima che sono presenti in un determinato

 momento nella sinapsi.

Ci sarà quindi sicuramente (anche se non è conosciuta bene) una regolazione che dipende

dall'attività neuronale.

La rottura proteolitica di GAD è stato visto che è in gran parte determinata dall'attivazione di una

proteasi, che è la calpaina. La calpaina genera delle forme troncate sia di GAD65, sia di GAD67.

Tuttavia le forme troncate di GAD65 hanno un'attività catalitica che è dalle 2 alle 3 volte più elevata

rispetto alla forma full-length, mentre le forme troncate di GAD67 perdono attività.

Anche l'effetto della fosforilazione è diverso sulle due isoforme di GAD: infatti GAD65 è attivata

dalla fosforilazione mediata da PKC, mentre GAD67 è inibita dalla fosforilazione mediata da PKA.

Le forme troncate di GAD65 si formano soprattutto in condizioni patologiche, cioè quando non c'è

da parte di GAD65 un'attività sufficientemente elevata per mantenere l'omeostasi GABAergica.

È stato infatti provato che GAD65 si può associare ai mitocondri.

Forse c’è un ruolo energetico!



L'attività della GABA transamminasi è localizzata a livello dei mitocondri,

dove ci sono il ciclo di Krebs e lo shunt del GABA.

GAD65 potrebbe anche allontanarsi da VGAT e dalle vescicole

 sinaptiche e associarsi, ancorarsi in qualche modo ai mitocondri.

A questo livello, il GABA prodotto dalla GAD65 diventerebbe un

substrato di GABA-T, e quindi verrebbe convertito in semialdeide

succinica e poi in succinato, entrerebbe così nel ciclo di Krebs e

favorirebbe pertanto la produzione di ATP in condizioni in cui la cellula

necessità di più energia.

L'associazione della GAD65 ai mitocondri potrebbe servire o localmente, per

fornire l'energia necessaria per il «refilling» delle vescicole contenenti GABA,

in condizioni in cui c'è un esaurimento (quindi, si suppone, condizioni di

stress o non fisiologiche), oppure, anche in sinapsi non GABAergiche, in altri

neuroni, o nella glia, per aumentare la produzione di ATP. Questa è un'ipotesi

confortata da diversi ritrovati sperimentali, ma che comunque deve essere

rivisitata.

Quindi GAD è molto strettamente regolata a livello post-traduzionale e a

livello genico, ed è anche ovviamente regolata dal microambiente, ed in

particolare dal pH. Il pH acido attiva la GAD. Inoltre, la GAD è particolarmente

attiva in anaerobiosi. In aerobiosi ovviamente aumenta anche il pH, perché

non essendoci O si avrà inizialmente glicolisi anaerobica con produzione di

2

acido lattico, o comunque si avrà un’inalterata produzione di CO e di

2

conseguenza si avrà un aumento dell'acidità. Infatti nei tessuti post-mortem i

livelli di GABA sono sempre elevati.

GABA come gliotrasmettitore

Abbiamo visto che ci sono dei gliotrasmettitori, e che la glia, attraverso il

rilascio di particolari molecole (glutammato, l'ATP, l'adenosina, la D-serina...)

può modulare l'attivazione sinaptica, potenziando o deprimendo il processo di

informazione.

Uno di questi gliotrasmettitori è il GABA. Infatti, GABA-T è altamente

espressa negli astrociti e a livello del cervelletto è stata osservata

immunoreattività per GAD, quindi è presente l'enzima di sintesi del GABA;

GAD è presente anche nei pedicelli, nei processi astrocitari nella corteccia

cerebellare umana.

Quindi potrebbe proprio servire a un rilascio localizzato di GABA.



È stato però anche visto che l'attività della GAD è sicuramente molto bassa

negli astrociti: quindi la GAD65 può essere ancora considerata un marker di

sinapsi GABAergiche.

Lo studio del GABA come gliotrasmettitore negli astrociti ha portato anche

all'identificazione di un pathway diverso, valido però sicuramente anche nei

neuroni, per la produzione di GABA: la derivazione da una poliammina, la

putrescina.

La putrescina attraverso un'acetilazione, che prevede l'intervento di ACoA,

produrrebbe una monoacetilputrescina.

A questo punto un'ossidazione attraverso una monoamminoossidasi

 (presente a livello della membrana esterna dei mitocondri) produrrebbe

N-acetil-γ-amminobutirraldeide (NAGABald).

Una seconda ossidazione darebbe poi origine a N-acetil-



GABA. A questo punto una deacetilazione darebbe origine al



GABA.

N.B.: Tutti gli enzimi che catalizzano questi step sono

presenti sia a livello gliale, sia a livello neuronale.

Il rilascio di GABA dagli astrociti avverrebbe per inversione dell'attività del

trasportatore.

I trasportatori del GABA sono dipendenti sia dalla temperatura, sia dalla

+ -

concentrazione ionica, soprattutto di ioni Na e Cl .

La ricaptazione termina (dando praticamente lo «switch-off») l'effetto del

GABA: il GABA viene eliminato (per la maggior parte) dalla tasca sinaptica.

Esistono diversi tipi, almeno tre diverse forme di trasportatori per il GABA:

GAT1 (GABA Transporter type 1)

• GAT2 (GABA Transporter type 2)

• GAT3 (GABA Transporter typ