Appunti di Microbiologia e Batteriologia generale

MICROBIOLOGIA pag. 1

 Introduzione pag. 3

 I batteri pag. 4

 Struttura del batterio pag. 9

 Crescita batterica

 pag. 11

Genetica batterica pag. 11

- Elementi genetici mobili

 pag. 15

Microbiologia diagnostica

- Metodi per controllare la crescita dei microrganismi pag. 17

 Gli antibiotici pag. 19

- Inibitori della sintesi della parete cellulare pag.22

- pag. 23

Inibitori della sintesi degli acidi nucleici pag. 24

- Inibitori della sintesi proteica pag. 25

- Antibiotici con azione sulla membrana plasmatica pag. 25

- Inibitori del metabolismo dell’acido folico

 pag. 26

Il microbiota pag. 28

- La flora microbica dell’uomo

 pag. 37

L’azione patogena dei batteri pag. 37

- Meccanismi di invasività

- Tossine batteriche pag. 41

INTRODUZIONE



Microrganismi sono così definiti quegli esseri viventi microscopici, unicellulari e che sono in grado di fare

una vita autonoma. Sono:

 Batteri e Archeobatteri (Archea)

 Funghi

 Protozoi

 Alghe unicellulari (di cui non si occupa la microbiologia)

 Virus (non sono dotati di vita autonoma ma sono importante oggetto di studio della microbiologia)

Le cellule più piccole (con un volume minore) hanno un rapporto superficie/volume maggiore rispetto a

cellule più voluminose; sono quindi avvantaggiate da un punto di vista evolutivo perché un volume minore

ne favorisce lo sviluppo, in quanto:

1) gli scambi con l’ambiente sono più veloci;

2) cellule più piccole necessitano di meno nutrimento.

Sotto questo aspetto, quindi, tutte le cellule procariote (che sono le più piccole) sono avvantaggiate da un

punto di vista evolutivo.

Per osservare le relazioni evolutive tra microorganismi è stata sviluppata una tecnica per confrontare gli

rRNA delle cellule. Con PCR si amplificano determinati geni e le sequenze confrontate tra loro danno

indicazioni su quanto una particolare sequenza di nucleotidi sia conservata. Questo ha permesso di

sviluppare una sorta di “albero genetico” della vita.

Per ottenere energia gli organismi usano:

 

Ossidazione di sostanze chemotropi



o Organiche chemoorganotropi



o Inorganiche chemolitotropi

 

Luce del sole fototrofi 1

In entrambi i casi il risultato della reazione che permette agli organismi di ottenere energia porta alla

produzione di una o più molecole di ATP, in alcuni casi insieme ad altre molecole o sostanze (ossigeno nel

caso di alcuni organismi fototrofi). 2

I BATTERI

Tutti i batteri possono avere una morfologia propria e un certo stato di aggregazione; in base alla loro

morfologia si distinguono due classi principali di batteri:

 Cocchi, di forma sferica;

 Bacilli o bastoncelli, di forma cilindrica allungata.

Nel caso dei bacilli esiste un’ulteriore classificazione che permette di individuare:



o Vibrioni bacilli ripiegati una sola volta;



o Spirilli bacilli ripiegati qualche volta;



o Spirocheti bacilli ripiegati molte volte.

In base allo stato di aggregazione questi batteri assumono nomi diversi:

 

Diplococchi e diplobacilli uniti a due a due;

 

Streptococchi e streptobacilli uno dietro l’altro;

 

Stafilococchi (e stafilobacilli) a grappolo. 3

Struttura del batterio

PARETE CELLULARE (CELL WALL)

 Conferisce rigidità alla cellula batterica e la protegge dal danno meccanico; impedisce la rottura della

cellula, che concentra al proprio interno numerose sostanze e liquidi.

Questa struttura è bersaglio di alcune terapie antibiotiche. Alcuni antibiotici (come le penicilline e le

cefalosporine), infatti, funzionano perché alterano la struttura della parete batterica o ne impediscono

la formazione.

La struttura e la composizione di questa parete conferiscono alle cellule batteriche caratteristiche

tintoriali diverse. Impiegando una colorazione di Gram si possono ottenere due risultati

sostanzialmente opposti, che permettono di parlare di batteri Gram-positivi e Gram-negativi.

Colorazione di Gram

1) un campione batterico sul vetrino viene colorato con cristal-violetto (colore blu/viola);

2) si applica una sostanza che fa penetrare il colore;

3) si fa una decolorazione con alcol: alcuni batteri rimangono blu/vola, altri si decolorano;

4) i batteri decolorati vengono trattati con un colorante di colore diverso, ad esempio rosso/violetto

(come safranina).

 sono Gram-positivi i batteri che non si sono decolorati (e quindi sono colorati in blu/violetto);

 sono Gram-negativi i batteri che hanno perso il primo colorante e hanno acquisito il secondo (e

quindi sono colorati in rosso/violetto).

Gram+ Gram-

Da un punto di vista della loro morfologia i batteri Gram-positivi e Gram-negativi sono diversi; tale

diversità sta innanzitutto nella presenza, solo nel caso dei batteri Gram-negativi, di una membrana

esterna al di fuori della parete batterica. I Gram-negativi inoltre hanno una parete batterica più sottile,

meno ricca di peptidoglicano. 4



PEPTIDOGLICANO si tratta di una molecola complessa formata dalla ripetizione di un’unità detta

glican-tetrapeptide, formata da 2 aminozuccheri (N-acetilglucosamina e acido N-acetilmuramico)

tenuti insieme da un legame β(1,4)glicosidico. Al secondo zucchero sono inoltre legati 4 aminoacidi

diversi tra loro, che nell’insieme formano la parte del tetrapeptide.

Il legame β(1,4)glicosidico è sensibile all’azione del lisozima, una proteina antibatterica che è in grado

di rompere questo legame ed è presente in una gran quantità di fluidi corporei, rappresentando una

delle più importanti armi di difesa di “prima linea” contro gli organismi patogeni di tipo batterico per

l’organismo umano.

Il peptidoglicano non viene sintetizzato all’esterno del batterio; il tetrapeptide viene sintetizzato nella

cellula dapprima come pentapeptide, che si lega ad un carrier chiamato bactoprenolo, che lo porta

fuori dalla cellula. In questa sede un enzima detto transpeptidasi rimuove il quinto peptide in una

5

reazione detta di tranpeptidazione. Cefalosporine e penicilline ostacolano l’attività di questa classe di

enzimi, impedendo quindi la formazione della parete batterica.

Gli aminoacidi del tetrapeptide si legano tra di loro per fare in modo che le catene di peptidoglicano

rimangano unite le une alle altre all’interno della parete batterica. Possono farlo legandosi

direttamente tra loro con legami inter-aminoacidici (soprattutto nel caso di alcuni batteri Gram-

negativi) oppure formando ponti glicosidici tra due aminoacidi (come accade in altri tipi di batteri). Il

risultato è comunque sempre quello di legare tra loro le catene di peptidoglicano.

Nei batteri Gram-positivi il

peptidoglicano è il principale

componente della parete, insieme ad

altre sostanze come gli acidi teicoici.

Nei batteri Gram-negativi lo strato di

peptidoglicano è piuttosto sottile e al di

fuori di questo si trova la membrana

esterna, una struttura presente solo in

questo tipo di batteri e che ha una

composizione simile a quella della

membrana interna (cioè della membrana

plasmatica), ma il suo foglietto esterno è

ricco di lipopolisaccaridi (LPS) e non di

fosfolipidi. Il lipopolisaccaride è una

tossina che permette ad alcuni batteri di

dare origine ad alcune patologie. 6

MEMBRANA CITOPLASMATICA

 Oltre alla classica struttura presenta alcune caratteristiche peculiari nei batteri; al contrario delle

membrane delle cellule eucariotiche, infatti, questa non possiede steroli, sostanze che conferiscono

una certa rigidità e resistenza alla membrana. Questo ruolo infatti è svolto dalla parete esterna, che

non è presente all’esterno della membrana plasmatica delle cellule eucariotiche.

Solo i micoplasmi possiedono steroli nella membrana; essi tuttavia non possiedono una parete esterna

come tutte le altre cellule batteriche.

La membrana ha tra le sue principali funzioni quelle di:

1) ancoraggio di proteine;

2) produzione di energia;

3) regolazione di scambi.

CITOSOL

 Al suo interno non si trovano strutture ben organizzate come nelle cellule eucariotiche: è possibile

osservare ribosomi sparsi e una zona in cui si concentra il DNA, detta nucleoide.

Il genoma dei batteri è formato da un’unica molecola circolare più piccola di quelle dei genomi

eucariotici. Oltre ad essa è possibile trovare anche altre molecole di DNA sparse nella cellula con una

funzione particolare, i plasmidi.

I ribosomi sono formati da 2 subunità (30S e 50S, per un totale di 70S), costituite da proteine e da tre

tipi di rRNA (23S, 16S, 5S). questi organuli sono bersaglio della terapia antibiotica, in quanto diversi dai

ribosomi delle altre cellule (eucariotiche) del nostro organismo. Con determinati antibiotici è dunque

possibile inibire la sintesi proteica in procarioti non ostacolando quella in eucarioti.

FLAGELLI

 Sono strutture esterne che conferiscono motilità alla cellula batterica. Il movimento che compiono è

come quello di un’elica. Sono formati per lo più da una proteina detta flagellina, unita ad una struttura

detta corpo basale, che è contenuta nello

spessore della parete e della membrana

cellulare, e che dà la direzione al flagello. Il corpo

basale è formato da 4 dischi; ai 2 interni sono

legate proteine dette MOT, che forniscono

energia, e proteine delle FLI, che danno il senso

(orario o antiorario) del movimento, cui

corrisponde una diversa direzione del senso di

marcia del batterio.

 

Monotrichi un singolo flagello ad un polo del batterio;

 

Anfitrichi due flagelli, uno per polo del batterio;

 

Locotrichi un ciuffo di flagelli ad un solo polo del batterio;

 

Peritrichi cellule batteriche interamente ricoperte di flagelli. 7

PILI (O FIMBRIE)

 Strutture esterne con importante significato di ancoraggio della cellula batterica.

CAPSULA

 Al di fuori di alcune cellule batteriche si può trovare una struttura che prende il nome di capsula, la

quale impedisce la fagocitosi di queste cellula da parte dei fagociti.

ENDOSPORA

 Le cellule batteriche sono in grado di differenziarsi in questa struttura, prodotta da batteri sporigeni.

La possono produrre sia batteri Gram-positivi che Gram-negativi. Questi batteri hanno una doppia vita:



1) accrescimento vegetativo in un ambiente ricco di nutrienti si dividono e si riproducono;



2) generazione di una spora in condizioni sfavorevoli i batteri generano una spora e rimangono

nell’ambiente in questa struttura di resistenza. Sono metabolicamente non attivi e molto resistenti.

Sono in grado di resistere lungo tempo e attendere condizioni nuovamente favorevoli (CICLO DI

SPORULAZIONE: se la spora trova ambiente nuovamente favorevole può andare incontro ad un

processo inverso e generare nuovamente una cellula batterica che procede col normale ciclo vitale).

L’endospora è resistente a:

- Calore

- Radiazioni,

- pH

- Agenti chimici

- Essicazione

E’ insensibile al lisozima perché il peptidoglicano è nascosto da molti strati e anche la presenza di

diplotinato di calcio è utile.

E’ composta da numerosi strati:

- Esosporio

- Tunica sporale

- Membrana citoplasmatica esterna

- Cortex

- Membrana citoplasmatica interna. 8

Crescita batterica

Per crescita batterica si intende l’aumento del numero di cellule in una popolazione. I batteri si moltiplicano

attraverso il meccanismo di scissione binaria: la cellula cresce e quando ha raggiunto circa il doppio della

propria lunghezza forma il “setto trasverso” per invaginazione della membrana e della parete cellulare.

Quando la cellula è in crescita il DNA si replica restando ancorato alla membrana e con l’allungamento della

cellula le 2 molecole che si formano vengono trasportate verso i poli. La duplicazione del DNA avviene

prima che sia completata la divisione cellulare.

È detto tempo di generazione il tempo necessario perché da una cellula se ne formino due; esso dipende

dal tipo di microrganismo e dal tipo di terreno di coltura.

La crescita batterica si può apprezzare su terreno liquido o solido.

In un terreno liquido la crescita batterica si misura in diversi modi: principalmente valutando la variazione

nel tempo di 2 parametri: 

- la concentrazione cellulare intesa come numero di cellule per ml di soluzione; si misura attraverso la

conta totale o la conta vitale (o in piastra);



- la massa si misura attraverso la misurazione della torbidità.

La crescita di una popolazione batterica viene espressa con una curva di crescita, mettendo in rapporto il

logaritmo di massa o concentrazione cellulare e il tempo.

Esistono 4 fasi di crescita batterica:



1) fase di latenza è la fase di adattamento;



2) fase di crescita esponenziale fase di massima velocità di crescita in cui i batteri crescono

velocemente; 

3) fase stazionaria caratterizzata da un numero di cellule costante perché le cellule non si dividono più o

perché il numero di cellule che si dividono è compensato dal numero di cellule morte. In questa fase gli

sporigeni fanno spore; alcuni batteri in questa fase producono antibiotici;

4) fase di morte. 9

La crescita batterica è influenzata da diversi parametri:

 temperatura

 energia

 nutrimento

 pH

 concentrazione salina adeguata (o disponibilità d’acqua)



 concentrazione di O 2

 AEROBI

- Obbligati

- Facoltativi

- Microaerobi

 ANAEROBI

- Aerotolleranti

- Obbligati

Per far crescere i batteri anaerobi si usano le giare in anaerobiosi, particolari strutture a chiusura ermetica.

Sotto il coperchio si trova un catalizzatore di palladio che dà origine all’acqua sottraendo O all’ambiente

2

interno, rendendolo anaerobico.

Durante la respirazione l’O viene ridotto ad acqua e durante questa reazione si formano intermedi tossici

2 2-

dell’O , specie reattive come l’anione superossido (O ), il perossido di idrogeno (H O ) e il radicale

2 2 2

-

idrossilico (OH ). Gli aerobi crescono in presenza di ossigeno perché hanno enzimi che degradano questi

elementi tossici. Gli anaerobi invece non possiedono questi enzimi e quindi non crescono in presenza di

ossigeno. quelli obbligati, in particolare, non hanno gli enzimi superossido dismutasi (che trasforma l’anione

superossido in perossido di idrogeno) e catalasi (che trasforma il perossido di idrogeno in acqua e

ossigeno).

Esiste un test della catalasi, che viene effettuato ponendo su un vetrino una goccia di perossido di idrogeno

e stemperando successivamente un’ansata di batteri: se questi batteri possiedono l’enzima catalasi sono

detti catalasi positivi e si osserva un’effervescenza per la produzione di ossigeno; in caso contrario il

batterio è detto catalasi negativo. 10

Genetica batterica

I batteri sono organismi aploidi, che contengono un’unica molecola di DNA circolare inserita nel citoplasma.

Il cromosoma batterico ha circa 4000 geni e si duplica rimanendo ancorato alla membrana. La duplicazione

prevede la formazione di forcelle replicative, in cui ogni filamento fa da stampo per il filamento

complementare. Il corredo genetico dei batteri può essere suddiviso in due pool:



1) stabile rappresentato dal cromosoma che codifica per processi fisiologici essenziali per la

sopravvivenza del batterio, per la sintesi di ribosomi, membrana e parete cellulare;



2) flessibile (mobile) rappresentato da elementi genici che conferiscono vantaggi selettivi e fenotipi

diversi ai batteri, che permettono la sopravvivenza di questi microrganismi in particolari nicchie, la

resistenza agli antibiotici e conferiscono loro la patogenicità. Fanno parte di quest’ultimo pool genetico

tutti gli elementi genetici mobili.

L’evoluzione dei batteri nel corso del tempo è avvenuta attraverso alcune modificazione di entrambi questi

pool di elementi genici, come per esempio la delezione di porzioni geniche, inserzioni di DNA e mutazioni e

riarrangiamenti.

Elementi genetici mobili



 PLASMIDI elementi genetici extracromosomiali; si tratta di piccole molecole di DNA che si replicano

in modo autonomo. Non codificano per funzioni essenziali per la vita del batterio ma gli conferiscono

alcuni vantaggi selettivi. Possono indurre la sintesi di fattori di virulenza o la resistenza ad antibiotici,

possono portare alla sintesi di batteriocine, sostanze che uccidono batteri che sono privi di plasmidi

analoghi.

 TRASPOSONI



 INTEGRONI recuperano l’espressione di geni silenti.



 ELEMENTI INVERTIBILI permettono l’inversione dell’orientamento di una porzione genica di 180°

(enzima invertasi). 

Trasferimento genico orizzontale permette lo scambio tra batteri di elementi genetici che conferiscono

caratteristiche importanti ai batteri, non fondamentali per la vita ma che rappresentano vantaggi selettivi.

Ne esistono diversi tipi:

 

Trasformazione è il processo in cui molecole di DNA libere, rilasciate da una cellula donatrice

morta, vengono trasferite, incorporate e integrate nel cromosoma di una cellula ricevente. Venne

scoperto nel 1928 da Griffith, che studiò Streptococcus Pneumoniae, che esiste in due forme:

capsulata e acapsulata. La prima viene indicata con S (perché dà colonie lisce), la seconda con R

(perché dà colonie rugose): la prima forma è quella che ha la virulenza, perché possiede la capsula

esterna. Inoculando in un topo cellule S vive il topo muore; viceversa inoculando cellule R vive il

topo sopravvive. Griffith scoprì che inoculando cellule S uccise al calore il topo sopravviveva;

inoculando cellule S uccise al calore insieme a cellule R vive il topo moriva e si poteva estrarre da

esso cellule S