Appunti Batteriologia e micologia

La microbiologia: studio delle forme di vita microscopiche

La microbiologia è la Scienza che studia le forme di vita microscopiche: batteriologia (Procarioti), protozoologia (protisti), micologia (funghi), virologia. Un numero molto limitato di microbi causa danno all’uomo. Nel nostro organismo abbiamo più cellule batteriche che eucariote.

Microbioma

Microbioma: insieme dei microbi, se ne parla come di un vero e proprio organo. I microbi vengono visti come parte di una comunità appartenente alla stessa specie o a specie differenti, formando un biofilm all’interno del quale i batteri si scambiano segnali.

I batteri

I batteri sono procarioti unicellulari, sono nella parte più bassa nella classificazione di Whittaker. Origine della microbiologia posta alla fine del '600 quando un commerciante olandese inventò il primo microscopio; Pasteur (vaccino rabbia) e Koch (vaccino TBC, postulati della microbiologia) alla fine dell'800 svilupparono vaccini senza conoscere l'esistenza di un sistema immunitario; scoperta antibiotici, anni '40 vengono diffusi; scoperta DNA; introduzione di tecniche di biologia molecolare.

Esperimento di Pasteur

L'esperimento di Pasteur con la fiasca a collo di cigno, per dimostrare che non c’era generazione spontanea della vita dalla materia organica, pone del brodo non sterile in coltura, formando una doppia curva nel collo della beuta, portava ad ebollizione, eliminava batteri ma non le spore più resistenti (che nel suo esperimento non c’erano), materiale rimaneva sterile a meno che non venisse posto in contatto con l’ambiente esterno. Processo di pasteurizzazione: eliminare batteri.

I postulati di Koch

I postulati di Koch collegano un micro-organismo ad una patologia, organismo lo inoculo, replico la patologia, lo isolo da quell’animale e lo re-inoculo per riprodurre la malattia. Non sempre le patologie umano danno patologia nel topo. Manca il coinvolgimento del SI nei postulati di Koch.

• Essere presente in tutti i casi di quella malattia
• Non essere presente in altre malattie né individui sani
• Essere isolata in coltura pura dai tessuti colpiti
• Ridurre quella malattia se inoculata sperimentalmente ad un ospite recettivo

Impatto dei microrganismi

L'impatto dei microrganismi sulle attività umane: medicina umana e veterinaria, sanità pubblica, immunologia, agricoltura, alimentazione (batteri rimuovono le plastiche, i detriti per esempio del petrolio..), ambiente, industriale, scienza di base, genetica e biologia molecolare (modelli facili da usare, usati per veicolare gli acidi nucleici..). Microbi come causa di malattia ma anche come causa di benessere. Nei paesi poveri le malattie infettive rappresentano ancora la principale causa di morte.

Classificazione e identificazione dei batteri

Sulla terra la biomassa principale è rappresentata dai procarioti che sono enormemente differenziati. Noi conosciamo circa 2 milioni di specie batteriche, ma è ipotizzata l’esistenza di 5-30 milioni. Un grammo di terreno contiene fino a 40 milioni di batteri, 1 ml di acqua un milione, un grammo di feci 10¹² batteri, si calcola sulla terra circa 5x10³⁰ batteri. L’eterogeneità è sorprendente, il problema dell’identificazione è ancora attuale.

I batteri sono gli organismi viventi più semplici con una organizzazione di tipo cellulare, è anche la tipologia di cellula più semplice che conosciamo, dimensione da 0.5 a 3 micron, genoma batterico libero nel citoplasma (privo di nucleo), citoplasma privo di RE, Golgi, ci sono ribosomi, no mitocondri, eventuale presenza di granuli, presenza di involucri complessi per resistere a stress ambientali, all’esterno della membrana cellulare c’è un involucro rigido per proteggerlo, DNA circolare aploide, riproduzione scissione binaria, la maggior parte degli antibiotici sono diretti contro i ribosomi (70S) visto che sono diversi da quelli umani (80S) ad eccezione di quelli dei mitocondri. Presenza nella nostra cellulare di steroli assenti nei procarioti, parete con lipidi e peptoglicani. Negli eucarioti la parete è assente o formata da chitina. La respirazione avviene nella membrana citoplasmatica nei batteri.

Morfologia e aggregazione batterica

I batteri presentano diverse forme, possono aggregarsi secondo schemi molto peculiari, forma e modalità di aggregazione sono utilizzate per l’identificazione e la classificazione. I cocchi (sferici) che si dispongono in raggruppamenti irregolari sono stafilococchi (tetrade o diplococchi), quelli disposti a catenelle sono streptococchi; i bacilli (allungati) in cui distinguo un asse trasversale (0.5 micron) e una longitudinale (2 micron) di cui fanno parte gli streptobacilli (catenelle); coccobacilli; vibrioni (curvi); spirilli; spirochete; quadrati; stella.

Coltura e crescita dei batteri

I batteri si generano da divisioni successive di una cellula su un supporto solido (terreno agarizzato) dando origine a degli aggregati visibili ad occhio nudo detti colonie. La crescita su superfici animate o inanimate porta alla formazione dei biofilm: aggregati batterici tenuti assieme da una MEC e attraversati da canali. I cateteri sono rapidamente colonizzati da ammassi di cellule microbiche.

Membrana cellulare e citoplasma

La membrana cellulare: doppio strato fosfolipidico, l’acqua può penetrare, è flessibile ma poca resistenza, si rompe facilmente, regola permeabilità (barriera osmotica) e trasporto (con vari meccanismi), sede della catena respiratoria (fosforilazione ossidativa) citocromi, escrezione di enzimi idrolitici per la digestione extracellulare (esoenzimi), funzioni biosintetiche (glicopeptide, fosfolipide, complesso DNA replicante mesosoma), individuazione dei segnali ambientali che regolano la chemiotassi e densità popolazione microbica.

Il citoplasma è composto per l'80% da acqua e per il 20% da sali-proteine, importante per shock osmotico. Materiale genetico con singola (aploide) molecola di DNA, vantaggi rispetto a 2N DNA più efficiente, cresce più rapidamente, mutazioni consentono un più rapido adattamento all’ambiente, presenza di plasmidi con extra DNA circolare.

Batteri gram-positivi e gram-negativi

I batteri gram-positivi (spessore fino a 100 nm) possiedono una parete cellulare monostrato, di densità uniforme formata soprattutto da peptoglicano. I batteri gram-negativi (fino a 10 volte inferiore dei +) possiedono una parete cellulare a doppio strato formata da uno strato molto sottile di peptoglicano e da una membrana esterna (di natura lipidica), presenza di spazio periplasmico.

Peptoglicano e lisozima

Peptoglicano: polimero con il disaccaride come unità fondamentale (N-acetilmuramico + N-acetilglucosamine), al residuo Nam legati residui aa (L-ala, D-Glu, L-Lys, D-ala, D-ala) che forma un legame peptidico con un altro residuo di NAM (legami crociati, enzima transpeptidasi). Legame tra Aa posizione 4 e quello in posizione 3 di un'altra catena, liberano il residuo 5. Si forma una rete a più strati. Nei gram + invece per creare dei legami tra punti distanti della maglia si creano dei prolungamenti formati da glicine per formare il legame tra catene distanti.

Lisozima (saliva, lacrime..) taglia il legame beta 1-4 che tiene assieme i residui di NAM e NAG; gli antibiotici si legano all’enzima transpeptidasi perché viene riconosciuta come il dimero ala-ala, impedisce la formazione del legame peptidico, parete diventa fragile, tende ad entrare acqua nella cellula e può provocare la rottura del peptide glicano e si ha lisi.

Struttura dei batteri gram-negativi

Lo spazio periplasmico gram - ci sono tanti enzimi importanti per la degradazione di antibiotici, porine; la vancomicina blocca la sintesi del peptidoglicano ma non riesce ad attraversare la membrana esterna, porine possono subire mutazioni. Teicoplanina non passa gram -.

Il foglietto esterno della membrana esterna è costituito da lipopolisaccaride lipide A (disaccaride N-glucosammina esterificato da acidi grassi) ancorato alla membrana, riconosciuta dalla cellule ed attiva processi infiammatori; all’esterno della cellula collegata al lipide A abbiamo il core (lineare zucchero), all’estremità troviamo il polisaccaride O con organizzazione ramificata. Anticorpi contro sequenze zuccherine prodotte dai linfociti. Il core allontana il polisaccaride O. LPS importante per attivare la risposta infiammatoria e innescare il rilascio di una serie di molecole solubili attivando la cascata infiammatoria.

Gram positivi vs. gram negativi

Quindi gram + possiedono una membrana, strato spesso di peptidoglicano (acidi teicoici e lipoteicoici), esoenzimi; gram - con due membrane, spazio periplasmico, strato sottile di peptidoglicano (LPS), esoenzimi e enzimi periplasmici; eccezioni micoplasmi, batteri acido-alcol resistenti.

Micobatteri parete più spessa, si legano strutture di natura lipidica, all’esterno si trova rivestimento simil lipidica proteica che forma rivestimento ulteriore, alcol acido resistenti. I micoplasmi non presentano una parete rigida, sostituita da “una membrana di unità” tristrati catacontenente steroli. Resistenti a beta-lattamici.

Strutture e funzioni batteriche

Flagelli e movimento

Flagelli movimento, pili ancoraggio. Flagelli in numero e distribuzione molto variabile, struttura complessa, ancorati a livello della parete, differenza del corpo basale del flagello a seconda di gram + o -. Sistema di ancoraggio.

Il corpo basale viene prodotto per primo, si posizionano dei ribosomi con monomeri di flagellina, parte interna cava, si spostano all’esterno dove si auto assemblano. Trasferire proteine dal citoplasma della cellula batterica all’interno delle cellule eucariotiche.

Il flagello è un organo locomotore, movimento secondo chemiotassi (spostamento direzionato secondo gradiente di una determinata sostanza).

Pili e adesione

Pili strutture filiformi, ciascun batterio ha un proprio corredo di pili, riconoscono varie strutture come antigeni, garantire ancoraggio. Pili sessuali varianti.

Adesione all’epitelio genito-urinario: infezione nell’uretra penetrano dei batteri che non si ancorano.

Capsula

Capsula all’esterno del gran - e del peptoglicano, natura zuccherina raramente proteine, protegge i batteri dalla fagocitosi, è un fattore di virulenza, capsula previene fagocitosi maschera antigeni di superficie, li rende di difficile digestione, può avere sequenza analoga a quella nell'organismo e quindi il SI. Opsonizzazione le cellule fagocitate sfruttando la parte iniziale della fagocitosi.

Spora batterica

Spora batterica: non tutti i batteri le formano. I gram - non le formano. Tra i gram + che formano spore abbiamo: Clostridium, Streptomiceti, Bacillus cereus e bacillus antracis. Spora è una struttura metabolicamente inerte che può resistere per tempi molto lunghi fino a quando si trasforma nuovamente in una cellula vegetativa. Sono resistenti al calore, addirittura alla bollitura per un’ora. Una spora possiede 10-20% di acqua, quindi è carente perché l’acqua rende instabile le macromolecole, poco citoplasma, poco RNA, pochi ribosomi. Spora contiene un core con ribosomi, DNA, acido dipicolinico; cortex con doppio strato di peptoglicani; coat che è uno strato proteico ricco di ponti disolfuro; esosporio proteine-lipidi. La posizione della spora all’interno del batterio che l’ha prodotta è variabile. Germinazione richiede pochi minuti, passaggio da spora a cellula vegetativa. Le spore vengono prodotte nel tubo digerente di un individuo che è il “carrier” del batterio. Tetano, botulismo e la gangrena gassosa tra le patologie provocate da spore.

Tassonomia e crescita dei batteri

Classificazione tassonomica

I batteri sono classificati tassonomicamente mediante criteri morfologici, biochimici (presenza enzimi quali catalasi...), sierologici (presenza di antigeni di superficie), genetici. Gram - classificati in base all’antigene O del lipopolisaccaride e dell’antigene flagellare.

Classificazione basata sullo studio del Genoma utilizza: dimensioni del genoma (peso molecolare), rapporto tra purine e pirimidine, sequenziamento rRNA ed identificazione di specifiche sequenze. Regno Procarioti, Divisioni, Classe, Famiglia (enterobatteriacee, vibrionacee..), Genere (Escherichia, Shigella, Salmonella, Klebsiella...), Specie (Shigella dissenteriae, S. exneri, S. sonnei, S. boydii).

Fattori che influenzano la crescita dei batteri

• Fattori fisici: pH, T, ossigeno, acqua, pressione osmotica.
• Fattori chimici (nutrienti e sostanze tossiche). Hanno bisogno di macronutrienti per avere fonti di C, di N (acidi nucleici, proteine), ferro, fosforo, potassio, magnesio, zolfo.
• Micronutrienti quali metalli, fattori di crescita (vitamine, aa..).

pH generalmente circa neutro ma anche acido (problemi per industria alimentare), alcalini. Ph vaginale <4.5 ci sono batteri che crescono in maniera ottimale e hanno anche un effetto favorevole per la donna, il ph basso impedisce crescita della clamidia. Anche nello stomaco abbiamo ph molto basso eppure ci sono batteri che riescono a sopravvivere come Elicobacter pilori. Optimum quando tutti gli enzimi si trovano alla T ottimale di funzionamento, poi la membrana perde integrità, enzimi non funzionano più e organismo va eventualmente incontro a morte (T maggiore).

Meso filli: max crescita a T corpo umano; Psicro filli: max crescita a T vicine congelamento (nei cibi refrigerati, listeria cresce in hot dogs); termo filli: max crescita a T vicine ebollizione (legionella in acqua calda), enzimi resistenti al calore per PCR. Febbre ha l’obbiettivo di portare un livello di T non consono alla crescita del batterio.

Umidità: batteri richiedono acqua libera perché 80% del citoplasma è costituito da acqua; liofillizzazione per conservazione batteri (rimuovere acqua da alimenti congelati).

Pressione osmotica: eccezioni pseudomonas che cresce in acqua distillata, gelatine e marmellate, maiale sotto sale; pressione osmotica relativamente simile al citoplasma, non resistono a delta di P osmotica eccessivi.

Tipologie di batteri

Batteri aerobi usano processi glicolitici (come le cellule eucariotiche); anaerobi (stretti, microaerofilli) trasferiscono elettroni al sodio solfato (solfato riducenti), oppure alla CO2 (metano riducenti), al nitrato di sodio (nitrato riducenti); facoltativi fermentazione con alcoli e acidi come accettori, hanno resa molto bassa, ma sono molto flessibili.

Batteri anaerobici non possiedono i sistemi necessari per eliminare i ROS (tipico degli aerobi) che si formano durante la glicolisi aerobia. I ROS vengono degradati da Catalasi, perossidasi, superossido dismutasi.

Dei batteri possono avere uno o due dei sistemi di detossificazione dell’ossigeno. Anaerobi si trovano in ambienti con basso potenziale redox, assenza di O2, oceani, laghi, fiumi, cibo in scatola, sistema fognari, paludi, pantani, animali, uomo. Siamo pieni di batteri anaerobi obbligati e facoltativi soprattutto nel colon ma anche nella cavità orale e nelle vie aeree superiori, vivono nel contesto dei biofilm per questo vivono nel cavo orale. La parte del biofilm superficiale a contatto con l’ambiente esterno contiene batteri aerobi, la parte a contatto con la superficie del corpo contiene anaerobi. Anche nella vie urinarie e nella pelle ci sono anaerobi.

Coltura dei batteri in laboratorio

Lavorati in cappe per anaerobi, ambiente controllato, gas inerti (CO2 o azoto), evitare penetrazione di ossigeno dentro: CAMERA PER ANAEROBI. Si usano spesso GIARE per anaerobi si inserisce un catalizzatore che consuma ossigeno. Limite grosso è la tenuta di queste giare e che sono stati esposti all’ossigeno quindi bisogna sperare che non siano stati uccisi. CANDELA in un barattolo chiuso che bruciando elimina ossigeno (metodo poco usato).

Batteri in un tubo con terreno di coltura si dispongono in base alle esigenze di ossigeno: aerobi si mettono sulla strato più superficiale del terreno, anaerobi opposto perché si trovano nel fondo del tubo, anaerobi facoltativi o aerotolleranti (tollerano il minimo di ossigeno un po’ meno dei facoltativi) in tutto il terreno, per i microaerofilli si forma una banda a metà del tubo.

Terreno al TIOGLICOLATO per far crescere batteri anaerobi perché questa sostanza intrappola ossigeno.

Scissione binaria

Scissione binaria (no mitosi perché non c’è nucleo) in condizioni ottimali di crescita, cellule possono formare coppie o catene quando si separano. Inizialmente in coltura non si dividono, perché devono adattare il proprio apparato biochimico al terreno di coltura o al nuovo ospite con cui sono venuti in contatto, quindi si organizzano in base a quello che offre l’ambiente. Questa fase viene definita FASE DI LATENZA, seguita poi da fase di CRESCITA ESPONENZIALE in cui c’è crescita con T, ph e i parametri ottimali, la popolazione cresce raddoppiandosi ogni 20 minuti (per E. coli per esempio), la crescita ha termine se i nutrienti scarseggiano e se si accumulano sostanze tossiche si entra in fase di crescita STAZIONARIA che può durare per un tempo variabile. Si può arrivare alla morte.

Crescita su terreno solido i batteri tendono a formare aggregati visibili ad occhio nudo. Si usano piastre Petri con materiale nutritizio con spesso agar. A 100 gradi centigradi liquefa, quando viene portato alla T ambientale polimerizza intrappolando il bordo di coltura trasformandolo in solido, dopo 24 ore per gli aerobi, 36-48 per anaerobi abbiamo colonie di batteri visibili. Crescita in terreno liquido i batteri crescono in sospensione tipicamente, si distribuiscono nel tubo in base alla disponibilità di gas, se il tubo viene messo in agitazione per tante ore si distribuiscono e appare torbido.

Quorum sensing

Batteri usano sistema di quorum sensing: ciascun batterio produce autoinduttore, una piccola quantità che viene rilasciata nell’ambiente extracellulare e deve legarsi ad un recettore dello stesso batterio o a batteri della stessa specie. Si attiva una cascata di segnale quando raggiunge una concentrazione critica, man mano che crescono producono autoinduttore fino a quando viene raggiunta soglia critica e si lega al recettore e attiva tx e traduzione di alcuni geni.

Autoinduttori (molecola segnale): omoserina lattone acetilato (gram -), peptidi (gram +). Esempi di regolazione mediante quorum sensing: formazione di biofilm in Pseu