Appunti di Microbiologia

Studio della microbiologia

Lo studio della microbiologia riguarda i microrganismi, che esistono come cellule singole o gruppi di cellule non differenziate in tessuti.

Tipi di microrganismi

Procarioti: eubatteri e archebatteri

Eucarioti: funghi, protozoi e alghe

Atipici: virus e prioni

Forma e dimensioni dei batteri

Forma dei batteri: sferica (cocchi) o bastoncellare (bacilli)

Dimensioni: 0.1-10 micron

Caratteristiche dei procarioti

Nei procarioti è assente la membrana nucleare (Lunghezza cromosoma E. Coli: 1,5 mm). Nei batteri non sono presenti istoni ma vi sono proteine basiche che hanno una funzione analoga. Nei batteri c’è un solo cromosoma con un’unica origine di replicazione (ORI C: origine del cromosoma) e termina a 180° in TER C.

Trascrizione e traduzione

Trascrizione e traduzione avvengono simultaneamente; la porzione appena trascritta in mRNA prende già contatto con i ribosomi (più piccoli di quelli eucariotici) per la traduzione. Questo influenza la rapidità di crescita dei batteri.

Citoplasma batterico

Il citoplasma batterico contiene enzimi e altre molecole organiche, è molto concentrato, quindi la pressione osmotica è elevatissima. Nei batteri non vi sono presenti: mitocondri, RE, apparato del Golgi. Vi sono però presenti accumuli di materia di riserva: polifosfati, glicogeno, lipidi, zolfo.

Membrana citoplasmatica

La membrana citoplasmatica non contiene steroli (membrana meno rigida rispetto agli eucarioti, eccezione per i mycoplasmi). Ha un elevato contenuto di proteine (fino al 70%, implicate in: trasporto, fosforilazione ossidativa, sintesi della parete e altri organuli esterni). Presenza di mesosoma, invaginazione della membrana per aumentarne la superficie (proteine concentrate in questa regione, sede di processi ossidativi, regola processi di secrezione, punto di ancoraggio dell’acido nucleico per la divisione cellulare).

Organuli batterici

Parete batterica: parete rigida esterna (non presente solo nei Mycoplasmi). Protegge da ipertonicità citoplasmatica, ha un ruolo nella patogenesi delle infezioni, conferisce forma al batterio, le diverse composizioni della parete conferiscono proprietà tintoriali diverse. Gram-positivi: la parete è composta da uno spesso strato di peptidoglicano, nei Gram-negativi il peptidoglicano compone una parete poco spessa, sottostante ad un’altra struttura fosfolipidica (membrana esterna).

Peptidoglicano

Il peptidoglicano è un polisaccaride composto da alternanza di N-Acetilglucosammina e N-Acetilmuramico legati da legami β-1,4. Le catene sono affiancate e ancorate tramite ponti di pentaglicina (solo nei Gram-+). I ponti legano NAM anche trasversalmente, cementificando la parete. Il Lisozima (contenuto nella saliva) scinde questi ponti e permette il filtraggio dell’acqua uccidendo il batterio, fungendo da antibatterico naturale.

Acidi teicoici

Gli acidi teicoici sono polimeri di alcoli esterificati con acido fosforico, si intrecciano con il peptidoglicano rafforzandolo e svolgono un’attività adesiva.

Nei Gram-negativi non vi sono ponti di pentaglicina, i residui delle catene lateriali del NAM si legano direttamente (questo caratterizza una parete di peptidoglicano 6 volte più sottile). All’esterno vi è una membrana esterna, costituita da due foglietti; quello interno è composto da fosfolipidi tipici, quello esterno è composto da lipopolisaccaride (LPS). La parte più interna è composta da Lipide A (caratteristica solo dei Gram-negativi, è un endotossina). La prima porzione polisaccaridica è definita Core-polisaccaridico. La porzione più distale è polisaccaride O, unità ripetitive fra loro, struttura molto variabile, anche all’interno della stessa famiglia batterica, questa struttura ha caratteristiche antigeniche (chiamato anche Antigene O).

Proteine della membrana esterna

Le proteine e polisaccaridi (solo se sono molecole disciolte in una parete più grande) sono antigeni. Le proteine della membrana esterna sono porine (pori che permettono il passaggio di piccole molecole, strutture beta-foglietto).

Tra membrana esterna e parete di peptidoglicano c’è uno spazio periplasmico, ambiente parzialmente controllato dalla membrana esterna, presenti enzimi, membrana e parete legate da lipoproteine.

Componenti facoltative

Capsula: rivestimento esterno alla parete composto da polisaccaridi (solo per Bacillus anthracis è proteica), rende più difficile la fagocitosi da parte di fagociti, attività adesiva, proprietà antigenica (antigene K).

Se gli esopolisaccaridi non sono attaccati al batterio si parla di glicocalice, che può formare biofilm batterico: strato composto da colonia batterica. Originano da matrice, colonia atta alla riproduzione. Raggiunta la maturità, batteri possono staccarsi per colonizzare ancora. Molte infezioni sono dovute alla formazione di biofilm sulle mucose, più difficili da raggiungere, ambiente controllato. Possibilità di formazione anche su strumentazione medica (cateteri).

Flagelli

I flagelli sono organi di movimento, monotrichi (un solo flagello), lofotrichi (flagelli a ciuffo), peritrichi (tutto attorno al batterio). Natura proteica (flagellina globulare forma struttura elicoide) antigenica (antigene H). Ancorate ad un corpo basale, collegata al flagello grazie ad una struttura chiamata uncino. Il movimento avviene per rotazione del flagello, richiede energia dalla forza protonmotrice di membrana.

Il movimento viene definito chemiotassi, gli stimoli possono essere chimici o fisici (luce). Ruotando il flagello in senso orario il moto è rettilineo, se antiorario allora il moto è casuale (in assenza di stimoli).

Fimbrie o pili

Le fimbrie o pili possono essere comuni o sessuali. Comuni: più corte, molto numerose, natura proteica (pilina), adesivi. Solo in Gram-negativi. Pilus sessuale: uno solo per cellula, la presenza è temporanea. Struttura tubiliforme per mettere in comune i citoplasmi di due batteri, permette scambio di materiale genetico (coniugazione batterica).

Endospore batteriche (solo Gram-positivi)

Alcuni batteri producono spore, non sono per riproduzione, ma come meccanismo di difesa in condizioni ambientali sfavorevoli, resistenti a fattori fisici e chimici, i batteri entrano in dormienza biologica (non attive metabolicamente). Batteri sporigeni di interesse batterico:

• Bacillus anthracis (aerobi)
• Clostridium (anaerobi)

Elevata resistenza a: calore, essiccamento, pH estremi, radiazioni, agenti chimici, assenza di nutrienti. La tindalizzazione è un tipo di sterilizzazione, alzo leggermente la temperatura per permettere alla spora di germinare, successivamente alzo di molto la temperatura per uccidere la forma vegetativa.

Struttura della spora

Core: componenti essenziali (DNA, enzimi, ribosomi, pochi AA) in ambiente disidratato (H₂O al 10%). Alcuni metaboliti presenti:

1. Dipicolinato di Ca serve a eliminare H₂O in eccesso.
2. Proteine SASP (Small Acidic Soluble Protein) protezione del DNA da raggi UV (impediscono formazione di dimeri di Timina).
3. Acido 3-fosfo-glicerico, deposito energetico dei gruppi P, più conservativo dell’ATP.

Corteccia: peptidoglicano modificato + dipicolinato di Ca

Tunica: proteine cheratinosimili ricche di legami S-S, coinvolto in impermeabilizzazione della spora.

Esosporio: lipoproteine, sempre impermeabilizzante.

Stimoli alla sporulazione

• Mancanza substrati di N, C, P, O₂ (per aerobi)
• Secrezione di un peptide segnale EDF-1 (fattore di differenziamento extracellulare)
• Calo di GTP e GDP
• Proteasi che incrementano il turn-over delle proteine.

Arrivato il segnale si attiva una regolazione genica. Si formano mRNA più stabili poli-adenilati. La sporulazione inizia come una divisione cellulare, ma il materiale è distribuito in maniera non omogenea; metà con meno materiale diventa il precursore della spora. Si formano le pareti attorno alla stessa e raggiunta la maturità viene liberata.

Germinazione

La germinazione richiede circa 90 min. Attivazione a seguito di shock termico o meccanico, segnale di fine quiescenza. In seguito la spora deve germinare. Il cortex viene leso, H₂O entra, ricomincia il metabolismo.

Metabolismo batterico

Divisione del metabolismo

Il metabolismo batterico è diviso in catabolismo (demolizione dei nutrienti) e anabolismo (costruzione di macromolecole dai residui del catabolismo). Il metabolismo batterico è molto più rapido (10-100 volte) di quello di cellule superiori, molto più versatile nell’utilizzo di composti come forma di energia e diversi accettori di elettroni (diversi da O₂), alcuni processi biosintetici sono caratteristici solo dei batteri (peptidoglicano, lipopolisaccaridi, acidi teicoici), è capace di svolgere fino a 2000 reazioni diverse.

Classificazione dei batteri

I batteri sono divisi in classi a seconda della loro fonte di energia:

• Fototrofi: dalla luce
• Chemiotrofi: dal carbonio (tutti i batteri umani entrano in questa categoria)
  • Chemiorganotrofi: da composti del carbonio
  • Chemiolitotrofi: anche da sostanze inorganiche

Mecanismi energetici

Nei chemiorganotrofi l’energia deriva da due meccanismi diversi.

• Fermentazione: ossidazione del substrato accoppiata con riduzione di un composto da esso derivato.
• Respirazione: ossidazione del substrato accoppiata con la riduzione di un accettore di elettroni.

La fermentazione può essere lattica (la formazione di lattato serve per ripristinare le molecole di NAD⁺ ridotte ad NADH per la formazione di piruvato e ATP) o alcolica (lo stesso principio produce etanolo e CO₂).

Durante la respirazione l’ossidazione avviene per gradi, gli elettroni vengono spostati lungo una catena di molecole (prevalentemente proteine) inserite nella membrana citoplasmatica, ioni H⁺ vengono trasportati all’esterno, dando carica positiva all’ambiente esterno e negativa all’interno. Questa forza viene detta Proton-motrice, nella quale i protoni sono richiamati all’interno della cellula, viene utilizzata per il funzionamento dell’ATP sintetasi.

La respirazione produce 38 molecole di ATP, la fermentazione solo 2, per quanto svantaggiosa viene usata in assenza di O₂. Alcuni batteri effettuano solo respirazione (metabolismo aerobio stretto), altri effettuano solo fermentazione (metabolismo anaerobio stretto), alcuni effettuano entrambi (aerobio/anaerobio facoltativo).

Crescita batterica

Sostanze essenziali

C, N, ioni inorganici, H₂O

Condizioni che influenzano la crescita

• Temperatura, la temperatura ottimale alla crescita è poco inferiore a quella di denaturalizzazione delle proteine.
  • Psicrofili < 37°
  • Mesofili = 37°
  • Termofili > 37°
• Rapporto con O₂ e CO₂
• Capacità di detossificare l’ossigeno dei composti dannosi (H₂O₂)
• pH (basofili e acidofili)
• Concentrazione di Sali (alofili sopravvivono solo in soluzioni ipertoniche, oppure alotolleranti)

Terreni di coltura

Impregnati di sostanze necessarie e fattori di crescita, metaboliti non sintetizzati dal batterio. Possono essere aggiunti anche: sangue, siero, estratti di carne.

Tipi di terreno

• Terreno liquido ("Brodo"): soluzione di peptoni (prodotti della digestione della carne, i batteri non devono catabolizzarla), Sali a pH 7.2 e tamponi (causa acidificazione dell’ambiente esterno per espulsione di H⁺).
• Terreno solido: terreno liquido con AGAR, polisaccaride di alghe rosse, non metabolizzato dai batteri, gelifica il terreno. In terreno solido i batteri rimangono raggruppati in colonie (10⁸ – 10⁹ cellule), la popolazione viene definita clonale, perché deriva da una sola cellula. Alcuni batteri (cromogeni) producono determinati pigmenti in coltura.

Tipi di terreni

• Terreni base
• Terreni ricchi: di una sostanza
• Terreni selettivi: fanno crescere solo una determinata specie di batteri
• Terreni differenziali: differenziano le colonie di diverse specie
• Terreni di arricchimento

Misura della crescita batterica

Metodi fisici

• Peso secco o volume
• Contatori elettronici
• Conteggio diretto

Metodi chimici

• Concentrazione proteine o DNA
• Incorporazione

Metodi biologici

• Numero batteri capaci di formare colonie (unità di misura: UFC /ml)
• Most probable number

Conservazione delle colonie

Per il mantenimento nel tempo di una colonia c’è bisogno di ricorrere a metodi pratici per renderla quiescente fino al momento in cui mi serve per ricerca.

Metodi di conservazione

• Infissione a terreno semi solido: terreno diluito + agar 0.4% (terreno molle). Metto la provetta a solidificare in maniera obliqua, immergendo un'ansa posso capire, in base alla posizione di crescita, se la colonia è aerobia (cresce più in superficie) o anaerobia (più in profondità). Dopo chiudo la provetta ermeticamente e la lascio a temperatura ambiente e al buio. Conservazione a breve termine (alcuni mesi).
• Crioconservazione: si fanno crescere batteri in brodi liquidi per una notte. Poi aggiungo un crioconservante e li lascio a basse temperature.
  • 20° - medio termine (1 anno)
  • 80° - lungo termine
  • N₂ liquido - lungo termine
  Svantaggi: il terreno va mantenuto freddo; Vantaggi: posso prelevare anche una piccola quantità di ghiaccio senza dover scongelare la provetta.
• Liofilizzazione: svantaggio: bassa disponibilità di strumenti; Vantaggio: lunghissimo termine.

Genetica batterica

Genoma batterico

Il genoma batterico è costituito da un unico cromosoma circolare (aploide). Possibilità di presenza di cromosomi particolari = plasmidi. Replicazione per divisione binaria, non c’è ricombinazione del materiale genetico, moltiplicazione clonale. La variabilità è determinata dalle mutazioni.

Tipi di mutazioni

• Puntiformi
  • Silenti
  • Missenso: sostituzione AA, se è diverso la proteina associata non è più sintetizzata
  • Non senso: codoni di stop precoci, proteina troncata a metà
  • Tipo selvatico
• Frameshift
  • Aggiunta a taglio di basi

La conservazione e fedeltà dell’informazione genetica è mantenuta da sistemi multienzimatici riparativi. Vi è però un fattore di frequenza di mutazione da mutageni (10^-7 - 10^-11). Le mutazioni avvengono anche in coltura pura, è possibile che un’intera coltura porti un gene mutato. Le mutazioni avvengono in maniera casuale, il fatto che siano. Deriva dalla pressione selettiva che viene esercitata dall’ambiente su di loro, per questo il fenotipo emerge solo se vantaggioso, altrimenti la colonia mutata tende a sopperire.

Tipi di mutanti

• Mutazioni per resistenza ad antibiotici: è selezionabile (in terreno selettivo si mette antibiotico, coltura non mutata muore e mutata vive)
• Mutazioni nutrizionali: auxotrofi - Perdono la capacità di sintetizzare un componente essenziale, che va aggiunto al terreno, per questo non sono selezionabili in terreno, perché in terreno base non cresceranno, ma si sviluppano solo nel terreno con aggiunta, insieme al ceppo selvatico.

Ceppi selvatici

I ceppi selvatici (non mutati) sono prototrofi.

Test di Ames

Il Test di Ames è uno studio nelle prime fasi di un farmaco per valutarne la mutagenicità, viene valutato sui batteri, si valuta se l’esposizione della sostanza varia gli acidi nucleici e crea mutazioni. Utilizzati dei ceppi di Salmonella typhimurium, auxotrofi per istidina (portatori di mutazioni che lo rendono incapace di sintetizzarla). Gene xxx mutato – enzima xxx non funzionante – non produce istidina (necessario metterla in terreno).

➢ Retromutazione = gene mutato muta di nuovo e torna normale. Nel test di Ames il gene viene sottoposto a un mutageno che fa retromutare il gene xxx, facendo funzionare enzima xxx che produce istidina, non più necessaria in terreno.

Al test si aggiunge omogenato di fegato di ratto, simula il metabolismo epatico del ratto, per rivelare i pro-mutageni. Vengono utilizzati diversi ceppi, con mutazioni diverse per identificare le diverse classi. I ceppi sono mutati per avere il polisaccaride O più corto, ciò la rende più permeabile. Presentano dei difetti nella riparazione del DNA, test più sensibile. Il limite principale è l’utilizzo di cellule procariote, non consente di predire il risultato su cellule umane.

Origine delle variazioni genotipiche

Le variazioni genotipiche derivano da mutazione oppure acquisizione di nuova informazione genetica (in senso orizzontale, fra due cellule già esistenti, che scambiano pezzi di materiale genetico). Processo di ingresso dell’informazione (trasformazione, transduzione, coniugazione) e successivamente trasferimento in senso verticale (alla progenie).

Transduzione

La transduzione passa attraverso i batteriofagi T4, virulento = provoca lisi della cellula ospite. Nella fase di assemblaggio nel capside va introdotto il DNA virale, lunga catena con genoma replicato molte volte, concatameri, viene introdotto a riempimento, fin che sta. Il fago Lambda può prende anche via lisogenica, al posto di replicarsi si integra nel genoma dell’ospite (situazione “profago”), continua a replicarsi trasmettendo il profago alle figlie. Continua fino ad un’attivazione ambientale ed entra in ciclo litico. L’integrazione del Lambda è sito-specifica.

In natura molti batteri sono lisogeni, in alcuni casi vi è Conversione fagica, comparsa di nuovi caratteri nelle cellule. Alcuni lisogeni producono tossine. La transduzione nei batteri è causata da batteriofagi, può essere generalizzata o specializzata. Generalizzata: quando le particelle vitali vengono rilasciate durante lisi, alcuni virioni possono portare parti di DNA batterico anziché virale, che entrando in un nuovo ospite va a integrare l’informazione genetica. Non c’è più ciclo litico.