Appunti di Microbiologia (prof. Mastromei)

Microbiologia introduzione

Alcuni usi dei microrganismi

• Agricoltura: azoto fissazione, ciclo dei nutrienti
• Rumine: degradazione della cellulosa
• Energia/ambiente: biocombustibili, biorisanamento, bioestrazione
• Cibo: conservazione dei cibi, cibi fermentati, additivi alimentari
• Malattie: identificazione di nuove malattie, trattamento, cura, prevenzione
• Biotecnologie: organismi geneticamente modificati, produzione di farmaci, terapia genica per alcune malattie

Quando nasce la microbiologia come disciplina?

Disciplina giovane per via dell’oggetto di studio: organismi non visibili ad occhio nudo. Mentalità passata del ciò che non si vede non esiste.

Il primo strumento per l’osservazione risale al 1700. Leuwenhock, un mercante con l’hobby del naturalismo, inventa il primo microscopio.

Spallanzani e Redi confutano la teoria della generazione spontanea (comparsa spontanea di microrganismi/mosche sulla carne marcia). Spallanzani scalda infusione/brodo, Redi protegge la carne dalle mosche.

Appert inventa i cibi in scatola ispirato dagli esperimenti di Spallanzani (periodo napoleonico).

Pasteur, uno dei padri della microbiologia, usa fiaschi a collo di cigno per dimostrare la presenza di microrganismi nell’aria: il collo del fiasco intrappola i microrganismi sulla curva. Piegando il fiasco si ha contaminazione, altrimenti il liquido resta sterile. Questa è la confutazione definitiva della generazione spontanea. Prova che i microorganismi sono ovunque. Individua l’importanza dei microrganismi nelle malattie infettive e nei processi industriali. Individua la causa di certe malattie, ma non i rimedi.

Lister, nel 1867, introduce l’asepsi chirurgica con uno spray al fenolo. Koch intuisce le basi della batteriologia medica con i postulati di Koch.

Caratteristiche dei microrganismi

• Origine di tutte le forme viventi: prime forme cellulari
• Diversità filogenetica superiore a quella di piante ed animali
• Estremamente numerosi: in 1 mL di soluzione si trova un miliardo di microorganismi
• Vivono in qualunque ambiente, purché ci sia acqua allo stato liquido
• Responsabili delle trasformazioni della materia necessarie alla vita
• Trasformano la geosfera (azione su rocce, sedimenti)
• Influenzano il clima (crescite microbiche nell’oceano rilascio di particelle volatili nuvole)
• Coinvolti in simbiosi con piante, animali ed altri microrganismi
• Causano malattie
• Influenzano il comportamento di piante ed animali

Uso dei microrganismi

• Svolgere reazioni chimiche di importanza industriale
• Modifiche genetiche per produrre proteine utili (es. vaccini)
• Migliorare la produzione e conservazione degli alimenti
• Contribuire alla salute pubblica (impianti di depurazione dell’acqua)
• Biorisanamento di siti inquinati
• Uso malevolo: armi biologiche, bioterrorismo

Cellula procariote e cellula eucariote

Le cellule procariote non hanno organuli e nucleo, mentre le cellule eucariote hanno organuli ben organizzati e un nucleo. La parte cellulare è presente nella maggior parte delle cellule batteriche e il DNA è disperso nel citoplasma.

Batteri ed archea

Tre domini dell’albero della vita: batteria, archea ed eucaria. La cellula degli archea è procariote ma diversa da quella batterica. Differiscono nelle proprietà chimiche di parete e membrana cellulare (archea ha strutture uniche). I batteri sono sensibili agli antibiotici; archea sono insensibili alla maggior parte di essi. Gli enzimi di archea per la sintesi proteica di acidi nucleici sono più simili a quelli eucarioti. La batteria comprende microrganismi patogeni per piante ed animali, archea no. Archea vivono in ambienti estremi (ipertermofili e metanogeni).

La cellula batterica

Grandezza

Le dimensioni sono molto varie, da Haemophilis influenzae (0,25x1,2 μm) a Oscillataria (8x50 μm). In genere nell’ordine dei pochi microni, più piccole delle cellule eucariote. Epulopiscium fishelsoni è un'eccezione, più grande delle eucarioti (fino a 0,5 mm) e vive in simbiosi con un pesce. Gli scambi con l’esterno avvengono attraverso la superficie, ragione per cui le dimensioni degli organismi unicellulari restano ridotte. Più la cellula è grossa, più richiede sostanze, ma la superficie di scambio diventa insufficiente.

Forme

Tra le più comuni ci sono:

• Cocco
• Bacillo
• Vibrione
• Spirillo

La morfologia è utile per il riconoscimento, ma può trarre in inganno. Le condizioni ambientali influenzano la forma. Ogni cellula batterica è un individuo.

Aggregazioni cellulari

Ammassi di cellule batteriche formati da cellule che dopo la divisione non si separano. Ogni cellula resta indipendente:

• Diplococchi
• Streptococchi
• Sarcina: ammassi sulle tre dimensioni
• Stafilococchi: ammassi casuali
• Streptobacilli (testa-coda)

Localizzazione delle macromolecole nella cellula

Le proteine sono ubiquitarie (membrana, parte, citoplasma, flagello). Gli acidi nucleici (DNA, RNA) e i polisaccaridi e lipidi si trovano in granuli di accumulo, separati dal resto del citoplasma.

Morfologia

Numerosi strati partendo dall’esterno:

• Flagello (uno o più di uno)/fibre
• Capsula (non sempre presente, zona di accumulo di sostanze)
• Parete importante, presente nella maggior parte dei procarioti, rigida e fondamentale per sopravvivere
• Membrana con funzioni diverse dalla cellula eucariote
• Citoplasma che contiene il genoma
• Nucleoide (DNA batterico)

Flagello

Il flagello è un filamento sottile che parte dalla superficie della cellula. Molto lungo, non indispensabile per la vita. Non tutte le cellule che l’hanno. Alcune possono perderlo per traumi meccanici. Posizione e numero variano da un microrganismo all’altro:

• Monotrico: un flagello collocato a un’estremità della cellula
• Lofotrico: ciuffo di flagelli a un’estremità (Spirillum)
• Peritrico: numero elevato su tutta la superficie (Proteus vulgaris)

La funzione del flagello è il movimento attivo. La perdita del flagello comporta movimento passivo tramite correnti. Il movimento è necessario per nutrirsi, riprodursi e trovare condizioni ambientali ideali. Il flagello batterico gram-negativo ha una parte basale che è il punto di aggancio alla membrana. Due piatti agganciano, uno sulla parte esterna e uno interno. I piatti imprimono la rotazione, un motore che sfrutta l’energia di membrana. Il punto di inizio della biosintesi del flagello è la crescita di tipo apicolare, formato da un’unica proteina: flagellina. Un batterio si muove alla velocità di 60 lunghezze cellulari/sec (17 m/h), una velocità relativa enorme.

Stimoli per il movimento

Chemiotassi: uno stimolo di base chimica. Un capillare vuoto viene immerso in una sospensione batterica e non succede nulla. Se nel capillare è invece presente uno zucchero/sostanza attraente, crea un gradiente di nutrienti. Le cellule sono attirate, maggiore torbidezza (densità cellulare) verso l’apertura capillare. Chemiotassi positiva attira, negativa allontana.

Fototassi: stimolo della luce. I batteri fotosintetici si dispongono lungo le lunghezze d’onda meglio assorbite dai solo pigmenti.

Rotazione del flagello

La rotazione in senso anti orario comporta moto rettilineo, i flagelli sono sincronizzati nella rotazione. La rotazione in senso orario causa capriole, ogni flagello tira in una direzione, serve a far cambiare direzione alla cellula.

Movimento casuale

In ambiente neutro, nessuno stimolo spinge in una direzione. Movimento rettilineo, giro orario, movimento rettilineo.

Movimento in direzione specifica

Con sostanza attraente, continuo ad avere alternanza di rotazione, ma i movimenti in direzione opposta alla sostanza sono sfavoriti. La cellula deve percepire il gradiente di concentrazione della sostanza attraente mentre si avvicina, memorizzando ciò che è successo prima e usando recettori per percepire la sostanza.

Recettore

La bilancia è in equilibrio quando sui due piatti c’è lo stesso peso: recettore a riposo. Su un piatto influisce l’ambiente esterno, sull’altro l’arrivo di uno stimolo positivo o negativo. Chemiotassi positiva: la bilancia pende a favore dell’ambiente esterno, negativa a favore dell’ambiente interno. Per modulare il segnale, la cellula agisce sul suo piatto per ritornare allo stato neutro: adattamento. I recettori sono di nuovo spenti, ma sono diversi da quelli iniziali. I recettori hanno bisogno di uno stimolo maggiore per riattivarsi (per chemiotassi positiva) o di uno minore (per chemiotassi negativa). Ogni recettore ha una vita media, periodicamente viene distrutto e rinnovato con recettori allo stato iniziale.

Fimbrie

Altri tipi di filamento sulla superficie cellulare, più corti dei flagelli. Non sempre presenti.

Capsula

Rivestimento più esterno, non sempre presente, necessità di informazioni genetiche specifiche per sintetizzarlo. Composizione molto variabile: zuccheri (glucosio) o amminoacidi a seconda della specie, organizzati in polisaccaridi o polipeptidi. Leunostoc ha una capsula polisaccaride a base di glucosio. Crescita su terreno solido: a seconda dello zucchero che forniamo, i batteri formano colonie diverse. Con saccarosio, capsula presente; con glucosio, capsula assente. La capsula influenza la patogenicità dell’organismo. Organismi capsulati hanno bisogno della capsula per essere virulenti (vedi esperimenti di Griffith), protezione dalla risposta immunitaria.

Parete cellulare

Rivestimento sottostante, presente nella maggior parte dei batteri. Rigido. L’enzima lisozima attacca e degrada la parete batterica.

Esperimento

In ambiente ipotonico, il lisozima attacca la parete e la distrugge. L'acqua continua ad entrare e la cellula scoppia. La parete è un guscio rigido che controlla l’entrata di acqua nella cellula e le impedisce di scoppiare. In ambiente isotonico, il lisozima degrada la parete e si forma un protoplasto: cellula integra senza parete ma di forma tonda. La parete dà forma alla cellula.

Principali costituenti

Mureina o peptidoglicano: parte glucidica con due zuccheri, acido N-acetilmuranico (NAM) e N-acetilglucosammina (NAG). Parte proteica con numerosi amminoacidi, anche in forma D. Struttura: catene lineari di zuccheri con legame glucosidico 1-4 NAG – NAM – NAG. Catene di cinque amminoacidi che si legano sempre al NAM. In posizione 4 e 5 c’è sempre D-alanina, gli altri tre sono variabili. Le catene si legano tra di loro nella forma finale perde il quinto amminoacido.

Batteri gram

Batteri gram -: legame peptidico diretto tra il terzo aa di una catena e il quarto aa di quella adiacente. Batteri gram +: legame non diretto, ponte amminoacidico tra il terzo aa e il quarto, di struttura variabile. Il lisozima attacca il legame glucosidico tra NAM e NAG.

Nucleotide di Park

Molecola formata da una molecola di NAM e una uridina unite da legame fosfato “mattone” della mureina, prodotto intermedio della via biosintetica della mureina.

Biosintesi della mureina

Produzione in due tappe: il nucleotide di Park è il prodotto della prima tappa. Avviene nel citoplasma.

Differenze tra gram e gram+

Struttura o componente:

• Parete gram-: spessore 150-800 Å, lipolisaccaridi assenti, lipidi rari, acidi teicoici presenti, polisaccaridi presenti, peptidoglicano 30-70% peso parete, amminozuccheri NAG-NAM, legame interpeptidico diretto raro, legame per interposizione di aa frequente.
• Parete gram+: spessore 80-100 Å, lipolisaccaridi presenti, lipidi presenti, acidi teicoici rari, polisaccaridi assenti, peptidoglicano 20% peso parete, amminozuccheri NAG-NAM, legame interpeptidico diretto caratteristico, legame per interposizione di aa assente.

Differenze nel collocamento di mureina e componenti aggiuntive

Gram-: dall’esterno peptidoglicano/spazio periplastico/membrana.

Gram+: membrana esterna/spazio periplastico/peptidoglicano/spazio periplastico/membrana cellulare. Meno spessa, ma più variegata.

Spazio periplastico

Molto evidente nel gram-, ridotto nel gram+. Racchiuso tra membrana esterna (molto permeabile) e membrana cellulare (poco permeabile). Ruolo fondamentale: zona tampone tra interno ed esterno dove sono svolte reazioni troppo complesse da svolgere nel citoplasma e troppo problematiche da svolgere fuori.

Acidi teicoici

Tutti i polimeri di parete, membrana e capsula contenenti residui di glicerolfosfato e ribitolfosfato.

Membrana esterna

Struttura simile alla membrana cellulare, diverse componenti: lipolisaccaridi, lipide A ancora la membrana esterna alla mureina, tossico. Polisaccaridi importanti per il sistema immunitario. Porine: condotti che mettono in comunicazione ambiente esterno e periplasma.

Parete di archea

Pseudopeptidoglicano (pseudo-mureina) componente principale della parete. Non c’è NAM, ma NAT (acido-acetiltolosa minutonico). Gli zuccheri sono legati con legame 1-3 non attaccabile dal lisozima, non sensibile agli antibiotici.

Membrana citoplasmatica

Essenziale in tutte le cellule, separa ambiente esterno da quello interno. Doppio strato fosfolipidico, spessore di circa 8 nm. Parti idrofile verso l’esterno e acidi grassi all’interno. Quasi nulla diffonde attraverso questa membrana, solo acqua e poche altre sostanze. Struttura a mosaico-fluido: presenza di proteine (transmembrana o solo su una faccia) non hanno posizione fissa. Legame estere tra glicerolo e acido grasso.

Archea

Molecola di glicerolo attaccato all’acido grasso con legame etere. Acido grasso fitanile, presenza di alcune ramificazioni con significato evolutivo. Glicerolo dietere, diglicerolo tetraetere: l’acido grasso è il bifitanile. Alcuni archea hanno membrana a doppio strato classica, altri membrana monostrato formata da diglicerolo tetraetere: il bifitanile è totalmente unito. Maggior rigidità per organismi che vivono a temperature elevatissime (ipertermofili).

Funzioni della membrana

• Barriera di permeabilità: previene dispersioni e impedisce l’accesso
• Sito di ancoraggio per proteine di trasporto
• Conservazione dell’energia: origine della forza proton-motrice

Permeabilità

Totalmente impermeabile, solo l’acqua diffonde liberamente in entrambe le direzione. Alcune molecole passano più facilmente di altre. Gli ioni hanno permeabilità molto bassa.

Trasporto

• Semplice: associato all’energia proton-motrice
• Traslocazione di gruppo: modifica chimica della sostanza trasportata. La sostanza è presa dall’esterno e portata dentro modificandosi lungo la strada. Con il glucosio per compensare le perdite (sistema bilaterale di trasporto) viene fosforilato e rilasciato nella cellula come glucosio 6-fosfato (bloccato nel citoplasma).
• Sistema ABC: richiede ATP e proteine di legame, avviene nel periplasma. Può essere uniporto, simporto o antiporto.

Funzioni della membrana batterica

• Separazione fisica tra esterno ed interno
• Formazione del setto nella divisione delle cellule figlie e del genoma
• Membrana fotosintetica: lamelle di ripiegamenti nel citoplasma dove ancorano gli enzimi fotosintetici
• Permeabilità: regola l’ingresso delle sostanze
• Mantiene vicini enzimi correlati (es. enzimi della stessa via metabolica), compartimentalizzazione della cellula

Nucleoide

Acido nucleico presente nella cellula batterica. Non c’è una disposizione precisa del DNA, no nucleo. La quantità di DNA in una cellula è notevole e compattato all’interno della cellula.

Superavvolgimento del DNA

DNA circolare a doppio filamento e superavvolto. Quando è di grosse dimensioni, domini superavvolti chiusi da proteine (istonsilli). Sequenziare il DNA batterico oggi è molto semplice, abbiamo a disposizione molte sequenze. E. coli è un organismo modello con doppio filamento chiuso covalentemente. Una sola molecola di DNA circolare contiene tutte le info geniche. Non è così per tutti i batteri.

Caratteristiche dei cromosomi batterici e archea

Paragonati a genomi di organismi unicellulari eucarioti. Numero di cromosomi essenzialmente uno, tutto il DNA in una sola molecola. Negli eucarioti più numerosi (lievito ha 16 cromosomi). Alcune eccezioni anche in batteri e archea, microrganismi con più di un cromosoma. Struttura lineare negli eucarioti, circolare nei procarioti, forma più comune con alcune eccezioni di procarioti con cromosoma lineare. Il lineare ha replicazione più complessa (problema di formare due molecole identiche telomeri), nel circolare la replicazione è più semplice. Dimensioni: tutte molecole a doppio filamento, molto variabile, compreso tra 0,58 mb e 8,66 mb nei procarioti (generalmente circa 4 mb). Negli eucarioti è molto più grande, media di 12 mb.