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Appunti di Microbiologia (prof. Mastromei)

Appunti schematici del corso di microbiologia tenuto dal prof Mastromei. Sono sufficienti per superare brillantemente l'esame scritto. Appunti basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni del professor Mastromei. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Microbiologia docente Prof. G. Mastromei

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ESTRATTO DOCUMENTO

Positiva attira Negativa

◊ allontana

Fototassi stimolo della luce

I batteri fotosintetici si dispongono lungo le lunghezze d’onda meglio assorbite dai solo pigmenti ROTAZIONE DEL FLAGELLO

◊ ◊

Rotazione in senso anti orario moto rettilineo i flagelli sono sincronizzai nella rotazione

◊ ◊ ◊

Rotazione in senso orario capriole ogni flagello tira in una direzione serve a far cambiare direzione alla cellula MOVIMENTO CASUALE (vedi

disegno) ◊

In ambiente neutro nessuno stimolo che spinge in una direzione

◊ ◊

Movimento rettilineo giro orario movimento rettilineo MOVIMENTO IN DIREZIONE

SPECIFICA (vedi disegno)

Con sostanza attraente

Continuo ad avere alternanza di rotazione, ma i movimenti in direzione opposta alla sostanza sono sfavoriti

La cellula deve percepire il gradiente di concentrazione della sostanza attraente mentre si avvicina memoria di ciò che è successo prima (capire la differenza)

e recettori per percepire la sostanza

RECETTORE (vedi disegno) ◊

La bilancia è in equilibrio quando sui due piatti c’è lo stesso peso recettore a riposo ◊

Su un piatto influisce l’ambiente esterno, sull’altro l’arrivo di uno stimolo positivo o negativo Chemiotassi positiva la bilancia

pende a favore dell’ambiente esterno

Chemiotassi negativa la bilancia pende a favore dell’ambiente interno ◊

Per modulare il segnale, la cellula agisce sul suo piatto per ritornare allo stato neutro adattamento

I recettori sono di nuovo spenti, ma sono diversi da quelli iniziali i recettori hanno bisogno di uno stimolo maggiore per riattivarsi (per chemiotassi positiva) o di

uno minore (per chemiotassi negativa)

Ogni recettore ha una vita media periodicamente viene distrutto rinnovato con recettori allo stato iniziale

FIMBRIE ◊

Altri tipi di filamento sulla superficie cellulare, più corti dei flagelli Non sempre presenti

ciglia

CAPSULA ◊ ◊

Rivestimento più esterno, non sempre presente necessità di informazioni genetiche specifiche per sintetizzarlo Composizione molto variabile zuccheri

(glucosio) o amminoacidi a seconda della specie, organizzati in polisaccaridi o polipeptidi

Leunostoc capsula polisaccaride a base di glucosio

◊ ◊

Crescita su terreno solido a seconda dello zucchero che forniamo, i batteri formano colonie diverse Con saccarosio capsula

presente ◊

Con glucosio capsula assente

La capsula influenza la patogenicità dell’organismo ◊

Organismi capsulati hanno bisogno della capsula per essere virulenti (vedi esperimenti di Griffith) protezione dalla risposta immunitaria

PARETE CELLULARE

Rivestimento sottostante, presente nella maggioranza dei batteri Rigido

Enzima lisozima attacca e degrada la parete batterica ESPERIMENTO

In ambiente ipotonico

Il lisozima attacca la parete e la distrugge Acqua continua ad

entrare la cellula scoppia

La parete è un guscio rigido che controlla l’entrata di acqua nella cellula e le impedisce di scoppiare In ambiente isotonico

Il lisozima degrada la parete

Si forma un protoplasto cellula integra senza parete ma di forma tonda La parete dà forma alla

cellula

PRINCIPALI COSTITUENTI ◊ ◊ ◊

Mureina o peptidoglicano parte glucidica due zuccheri acido N­acetilmuranico (NAM) e N­acetilglucosammina (NAG)

parte proteica numerosi amminoacidi, anche in forma D

Struttura catene lineari di zuccheri con legame glucosidico 1­4 NAG – NAM – NAG

β

Catene di cinque amminoacidi che si legano sempre al NAM

In posizione 4 e 5 c’è sempre D­alanina, gli altri tre sono variabili

Le catene si legano tra di loro nella forma finale perde il quinto amminoacido

Batteri gram ­

Batteri gram +

legame peptidico diretto tra il terzo aa di una catena e il quarto aa di quella adiacente

◊ ◊

legame non diretto ponte amminoacidico tra il terzo aa e il quarto, di struttura variabile

Il lisozima attacca il legame glucosidico tra NAM e NAG NUCLEOTIDE DI PARK ◊

Molecola formata da una molecola di NAM e una uridina unite da legame fosfato “Mattone” della mureina

prodotto intermedio della via biosintetica della mureina BIOSINTESI DELLA MUREINA

Produzione in due tappe il nucleotide di park è il prodotto della prima tappa Avviene nel citoplasma

Vedi appunti per la reazione

DIFFERENZE TRA GRAM E GRAM

+ ­

STRUTTURA O COMPONENTE PARETE GRAM PARETE GRAM

+ ­

Spessore 150­800 Å 80­100 Å

Lipolisaccaridi assenti presenti

Lipidi rari presenti

Acidi teicoici presenti rari

Polisaccaridi presenti assenti

Peptidoglicano 30­70% peso parete 20% peso parete

Amminozuccheri NAG­NAM NAG­NAM

Legame interpeptidico diretto raro caratteristico

Legame per interposizione di aa frequente assente

DIFFERENZE NEL COLLOCAMENTO DI MUREINA E COMPONENTI AGGIUNTIVE

◊ ◊

Gram dall’esterno peptidoglicano/spazio periplastico/membrana

+

Gram membrana esterna/spazio periplastico/peptidoglicano/spazio periplastico/membrana cellulare Meno spessa, ma più variegata

­

SPAZIO PERIPLASTICO

Molto evidente nel gram­ Ridotto nel

gram+

Racchiuso tra membrana esterna (molto permeabile) e membrana cellulare (poco permeabile)

Ruolo fondamentale zona tampone tra interno ed esterno dove sono svolte reazioni troppo complesse da svolgere nel citoplasma e troppo problematiche

da svolgere fuori

ACIDI TEICOICI

Tutti i polimeri di parete, membrana e capsula contenenti residui di glicerolfosfato e ribitolfosfato MEMBRANA ESTERNA

Struttura simile alla membrana cellulare

◊ ◊ ◊ ◊ ◊

Diverse componenti lipolisaccaridi lipide A ancora la membrana esterna alla mureina tossico Polisaccaridi importanti per il

sistema immunitario

Porine condotti che mettono in comunicazione ambiente esterno e periplasma PARETE DI ARCHEA

Pseudopeptidoglicano (pseudo­mureina) componente principale della parete

Non c’è NAM, ma NAT (acido­acetiltolosa minutonico)

◊ ◊

Gli zuccheri sono legati con legame 1­3 non attaccabile dal lisozima non sensibile agli antibiotici

β

MEMBRANA CITOPLASMATICA

◊ ◊

Essenziale in tutte le cellule separa ambiente esterno da quello interno Doppio strato fosfolipidico

spessore di circa 8 nm

Parti idrofile verso l’esterno e acidi grassi all’interno ◊

Quasi nulla diffonde attraverso questa membrana solo acqua e poche altre sostanze

◊ ◊

Struttura a mosaico­fluido presenza di proteine (transmembrana o solo su una faccia) non hanno posizione fissa Legame estere tra glicerolo e acido grasso

ARCHEA

Molecola di glicerolo attaccato all’acido grasso con legame etere

◊ ◊

Acido grasso fitanile presenza di alcune ramificazioni con significato evolutivo Glicerolo dietere

Diglicerolo tetraetere l’acido grasso è il bifitanile

Alcuni archea hanno membrana a doppio strato classica

◊ ◊ ◊

disegno)

Altri membrana monostrato formata da diglicerolo tetraetere il bifitanile è totalmente unito (vedi Maggior rigidità organismi che vivono a T°

elevatissime (ipertermofili)

FUNZIONI

• ◊

Barriera di permeabilità previene dispersioni e impedisce l’accesso

• ◊

Sito di ancoraggio per proteine di trasporto

• ◊

Conservazione dell’energia origine della forza proton­motrice PERMEABILITÀ

Totalmente impermeabile solo l’acqua diffonde liberamente in entrambe le direzione

Alcune molecole passano più facilmente di altre Gli ioni hanno

permeabilità molto bassa TRASPORTO

Semplice associato all’energia proton­motrice

Traslocazione di gruppo modifica chimica della sostanza trasportata

La sostanza è presa dall’esterno e portata dentro modificandosi lungo la strada

Con il glucosio per compensare le perdite (sistema bilaterale di trasporto) viene fosforilato e rilasciato nella cellula come

glucosio 6­fosfato (bloccato nel citoplasma)

◊ ◊

Sistema ABC richiede ATP e proteine di legame avviene nel periplasma

Può essere uniporto, simporto o antiporto FUNZIONI DELLA

MEMBRANA BATTERICA

Separazione fisica tra esterno ed interno

Formazione del setto nella divisione delle cellule figlie e del genoma

◊ ◊

Membrana fotosintetica lamelle di ripiegamenti nel citoplasma dove ancorano gli enzimi fotosintetici Permeabilità regola l’ingresso delle

sostanze ◊

Mantiene vicini enzimi correlati (es. enzimi della stessa via metabolitca) compartimentalizzazione della cellula

NUCLEOIDE

Acido nucleico presente nella cellula batterica ◊

Non c’è una disposizione precisa del DNA no nucleo

Quantità di DNA in una cellula è notevole compattato all’interno della cellula

Vedi disegni

SUPERAVVOLGIMENTO DEL DNA

DNA circolare a doppio filamento e superavvolto

◊ ◊

Quando è di grosse dimensioni domini superavvolti zone della molecola chiuse da proteine (istonsilli) Sequenziare il DNA batterico oggi è

molto semplice abbiamo a disposizione molte sequenze

◊ ◊

E. coli organismo modello doppio filamento chiuso covalentemente

Una sola molecola di DNA circolare contiene tutte le info geniche

Non è così per tutti i batteri

CARATTERISTICHE DEI CROMOSOMI BATTERICI E ARCHEA

Paragonati a genomi di organismi unicellulari eucarioti

◊ ◊

Numero di cromosomi essenzialmente uno tutto il DNA in una sola molecola

Negli eucarioti più numerosi (lievito ha 16 cromosomi)

◊ ◊

Alcune eccezioni anche in batteri e archea microrganismi con più di un cromosoma Struttura lineare negli eucarioti

◊ ◊

Circolare nei procarioti forma più comune alcune eccezioni di procarioti con cromosoma lineare Il lineare ha replicazione più

complessa (problema di formare due molecole identiche telomeri) Nel circolare la replicazione è più semplice

Dimensioni tutte molecole a doppio filamento

Molto variabile compreso tra 0,58 mb e 8,66 mb nei procarioti (generalmente circa 4 mb) Negli eucarioti è molto più

grande media di 12 mb

◊ ◊

Eucarioti grande quantità di DNA non codificante (DNA spazzatura/egoista) Procarioti il DNA è quasi

tutto codificante riduce le dimensioni ◊

Maggiormente soggetto a mutazioni maggior pressione selettiva

◊ ◊

Tampone di mortalità da mutazione negativa numero elevato e riproduzione veloce Primo genoma sequenziato

Hoemophilus influenzae 1,83 mb

Qual è il genoma minimo per consentire la vita? ◊ ◊

In alcuni batteri è stato trovato DNA di 180.000 mb più piccoli di alcuni virus individui incapaci di vita autonoma

◊ endosimbionti che delegano all’ospite una serie di funzioni

◊ ◊ ◊ ◊

Streptomyces coelicolor genoma di 8,66 mb doppio della media evento di duplicazione ancestrale Ubiquitari nel suolo

sfruttamento di sostanze complesse e molte diverse

REPLICAZIONE BIDIREZIONALE

Formazione di strutture teta ◊ ◊

Parte dall’origine di replicazione procede in entrambe le direzioni finisce al punto di fine, circa 180° dal punto di inizio

CITOSCHELETRO PROCARIOTICO

Tre strutture (microfilamenti, filamenti intermedi e microtubuli) omologhi agli elementi citoscheletrici eucariotici Composizione diversa

◊ ◊

Funzioni ruolo nella divisione cellulare ancora molecole Localizzazione proteica

◊ compartimentalizzazione Responsabile della forma

VESCICOLE GASSOSE ◊

Si trovano in cianobatteri vivono in ambiente acquatico e sono fototrofi Devono sapere dove è il fondo

e dove la superficie ◊

Vescicole gassose all’interno della cellula tubuli agganciati gli uni agli altri

Strutture rigide formate da proteine GvpA, GvpC

Componenti più leggere della cellula per questo la cellula galleggia Pressione del gas

dentro la vescicola è uguale a quella esterna

La densità della vescicola è 5­20% di quella cellulare

Per processi metabolici vescicole di contenimento per prodotti metaboli che sono dannosi in quantità eccessiva

ENDOSPORA

Si forma nei bacilli e Clostridi Oggetto di

diversificazione cellulare

Forma di resistenza si formano all’interno della cellula madre, che poi si dissolve Forma differenziata,

metabolicamente inattiva e isolata dal mondo esterno Insensibile a calore, agenti chimici, freddo, siccità, radiazioni

◊ ◊

Scopo sopravvivenza della cellula a condizioni critiche per consentire la nascita di una nuova cellula Posizione di formazione terminale,

sub­terminale, centrale

Struttura una copia del DNA molto compattato nella parte più interna Piccola quantità di

citoplasma enzimi necessari per il risveglio

Numerosi strati di rivestimento due copie di membrana cellulare, rovesciati tra di loro ( interna ed esterna)

Corteccia Tuniche

Esosporio

ACIDO DIPICOLINICO

vedi disegno

Forma polimeri con il calcio ◊ ◊

Si forma durante il processo di sporificazione contribuisce alle strutture di rivestimento Spora solo il 10­25% di acqua

Cellula vegetativa 80­90% di acqua

SPORIFICAZIONE

Innesco segnali di ambiente critico

Una parte della cellula viene adibita alla formazione della spora

I due compartimenti restano in dialogo tra di loro durante tutto il processo Endospora (funzione di resistenza) =/=

spora fungina (forma riproduttiva del fungo)

◊ ◊ ◊

Al cambio delle condizioni ambientali segnale di attivazione per tornare alla forma vegetativa germinazione

perdita di rifrangenza e resistenza al calore, eliminazione dei vari gusci Durante la sporificazione

produzione di nuove molecole (proteine)

◊ ◊ ◊

Bacillus thurigiensis cristalli parasporali tossici per alcuni bruchi di lepidotteri insetticida biologico specifico I BATTERI DORMONO?

Le specie di batteri che non formano spore hanno altre forme di resistenza

Si addormentano/vanno in catalessi rallentamento del metabolismo

◊ ◊

Per verificare le condizioni ambientali batterio esploratore se ci sono risorse, sveglia gli altri, altrimenti muore

TECNICHE MICROBIOLOGICHE

STERILIZZAZIONE

Tecniche per rimuovere/uccidere tutti gli organismi viventi e i loro virus in un campione o in terreno di coltura

1) CALORE

Effetti della temperatura sulla vitalità (vedi grafico)

Tempo di frazione decimale (D) tempo necessario per uccidere il 90% dei microrganismi

Diminuisce con l’aumentare della temperatura Il grafico non

arriva allo zero il 10% sopravvive ◊ ◊

Calcolare la probabilità che una cellula viva sul campione 10 per basse quantità il campione è considerato sterile Diversi organismi sono più o meno

­3

sensibili alle temperature alcuni muoiono più velocemente di altri

Organismo di controllo spore batteriche (molto resistenti)

• FIAMMA

In laboratorio si usa la fiamma del becco di bunsen Usato per

sterilizzare anse, aghi, bacchette di vetro Trattamento forte

limitato a strumenti semplici

Su grande scala incenerimento (smaltimento rifiuti biologici)

• CALORE SECCO

In stufa a 160° C per 2­3 ore

◊ ◊

Aria cattivo conduttore tempi lunghi

Usato per vetreria e materiali resistenti al calore ◊

Il materiale da sterilizzare va chiuso in contenitori per evitare nuove contaminazioni Fa evaporare l’acqua

disidratazione e morte cellulare

A T° elevate può indurre sporificazione Tempi lunghi per

coprire tutto il prodotto

• CALORE UMIDO

Autoclave strumento che sostituisce l’aria con vapore acqueo Chiuso per aumentare la

pressione (+1 atm = 120° C)

Necessari trenta minuti

Sterilizzare soluzioni (terreni di coltura)

Il campione deve entrare in contatto con il vapore Uso di vapore

fluente non uccide spore batteriche

I liquidi dentro il contenitore non entrano in ebollizione Il vapore denatura

le proteine in fretta tempi veloci

• PASTORIZZAZIONE ◊ ◊

Scaldare a 60°­65° C per trenta minuti uccide solo alcuni microrganismi riduce il carico microbico Il latte viene pastorizzato per

eliminare i patogeni ◊ ◊

Pastorizzazione istantanea 71°C per quindici secondi continua applicazione del processo

◊ ◊ ◊

Latte a lunga conservazione trattamento a T° più elevate 130° per qualche secondo sterile

2) RADIAZIONI Si

divide in due gruppi

• RAGGI UV ◊

I più efficaci sono quelli a lunghezza d’onda 360 nm agisce sul DNA Non penetrano

in profondità usati sulle superfici

Agenti mutageni

Usati per stanze, cappe

• RAGGI X E γ

Ionizzanti, penetranti Molto

efficaci

Richiedono attrezzature particolari

Causano formazioni di ioni che uccidono le cellule

I sono usati per materiale plastico monouso (es. siringhe) già chiuso nelle confezioni Usato anche per alcune derrate

γ

alimentari (frutta e verdura)

3) FILTRAZIONE

Metodo che separa fisicamente i microrganismi dal campione

Solo per i liquidi

Per i campioni che non tollerano alte temperature (termolabili) Membrana filtrante

◊ buchi di 0,20­0,50 μm ◊

Mantenere tutto su un sistema a vuoto il liquido viene risucchiato attraverso la membrana I batteri non passano

Non filtra i virus

4) SOSTANZE CHIMICHE DISINFETTANTI Sostanze

che abbattono la carica batterica ◊

Molte di queste sostanze hanno ricadute commerciali devono essere efficaci e vendibili

• FENOLO E DERIVATI Primo agente

disinfettante Impiegato nei laboratori ospedalieri

Denatura le proteine e disgregano le membrane

Efficace in presenza di materiale organico e resta attivo per lungo tempo Emana odore pungente e può

irritare la pelle

• ALCOLI

Tra i più utilizzati

Non sono efficaci sulle spore

I più usati sono etanolo e isopropanolo CH – CH – OH Usati

3 2

al 70­80%

Pulisce le ferite da materiale estraneo

• ACQUA OSSIGENATA

H2O2 usata al 3% ◊

Deve il suo effetto al rilascio di ossigeno attivo ossida

• ALOGENI I

più usati sono:

◊ ◊

Cloro trattamento dello acque il cloro gassoso forma acido ipocloroso che libera ossigeno, che ossida

◊ ◊

Iodio antisettico cutaneo (tintura di iodio) iodinazione delle proteine cellulari

• SALI DEI METALLI PESANTI Argento e

mercurio, che però sono tossici ◊

Nitrato d’argento è il più usato in soluzione al 1% viene instillato negli occhi dei neonati per prevenire infezioni

Poco usato macchia in modo indelebile

• FORMALDEIDE

Si lega ai gruppi solfidrici delle proteine

◊ ◊

In soluzione acquosa al 37% formalina conservazione dei campioni biologici

• BETA­PROPIOLATTONE Proprietà

simili all’ossido di etilene

Sterilizzante agisce molto rapidamente ◊

In soluzione acquosa è idrolizzato in forma attiva acido acrilico

• OSSIDO DI ETILENE

◊ ◊

Sempre allo stato gassoso molto penetrante ed efficace non danneggia il campione Mescolato a CO2

perché esplosivo

Trattamento di reperti archeologici e artistici

USO DI DISINFETTANTI NELL’INDUSTRIA

Industrie Composto Uso

Cartiere fenoli/organomercuioli prevenzione crescita microbica

Concerie fenoli/metalli pesanti gli agenti antimicrobici sono sul prodotto finito Plastiche

detergenti cationici prevenzione crescita microbica

Legname fenoli prevenzione dal deterioramento

Petrolifere Hg, fenolu, detergenti cationici prevenzione crescita microbica durante l’estrazione Condizionamento

cloro, fenoli prevenzione crescita microbica negli impianti

Centrali elettriche cloro prevenzione crescita microbica in condensatori

I TERRENI DI COLTURA

◊ ◊

Terreno di coltura soluzione nutriente usata per far crescere i microrganismi in laboratorio Soluzione in partenza sterile

far crescere quello che interessa

Terreno liquido crescita in soluzione

◊ ◊ ◊ ◊

Terreno solido stessa composizione, con aggiunta di una sostanza gelificante agar polisaccaride prodotto da alghe rosse liquefa a 85° e

◊ ◊

solidifica a 45° substrato inerte per la maggior parte degli organismi forma un gel, in cui le sostanze intrappolate possono diffondere

1) TERRENI CHIMICAMENTE DEFINITI/MINIMI ◊ ◊

Preparato con precise quantità di sostanze organiche e inorganiche è nota l’esatta composizione chimica Ingredienti base acqua (1 L), sali

(fosfati, solfati, cloruri), elementi in traccia (K, Na, Fe, cobalto, Mg, Mn, Cu) Carbonio e azoto sono fondamentali produzione di macromolecole

◊ ◊

Aggiunte terreno 1 NH Cl 1g

◊ ◊

Possono essere ricavati dall’aria grande consumo di energia solo pochi organismi sanno farlo 4

◊ fonte di azoto per la cellula

◊ ◊

Terreno 2 NH Cl 1g + glucosio 5g fonte di energia

4

◊ ◊

Es. terreno 3 NH Cl 1g + glucosio 5g + acido nicotinico 0,1 mg varia a seconda delle esigenze del microrganismo in esame

4

◊ ◊ ◊

Terreno 4 glucosio + estratto di lievito 5 g l’estratto contiene grandi quantità di vitamine, proteine, lipidi, ecc. non è più un terreno

minimo terreno minimo arricchito

2) TERRENI COMPLESSI/MASSIMI

Alte quantità di sostanze nutritive, ma non si conosce la concentrazione dei singoli composti (chimicamente indefinita) Può essere un brodo di carne, latte di soia,

sangue (per organismi patogeni)

I microrganismi crescono più velocemente e più numerosi

Più facile da preparare, ma non si osservare l’effetto di un componente sul microrganismo TERRENI DIFFERENZIALI

Può crescervi più di una specie microbica con aspetto differenze Permette di evidenziare

particolari attività metaboliche

Es. terreno per individui capaci di produrre esoproteasi

Aggiunta di albumina, che durante la sterilizzazione denatura, ottenendo delle piastre opache

Le cellule che producono esoproteasi idrolizzano l’albumina, formando un alone trasparente attorno alle loro colonie

Es. fermentazione di uno zucchero (lattosio)

Riconoscere la capacità di E. coli di fermentare il lattosio su terreno EMB I batteri trasformano il

lattosio in acidi organici, che aumentano il pH

TERRENI SELETTIVI

Terreni su cui possono crescere solo determinati microrganismi Non esiste un terreno

universale

◊ ◊

Es. terreno privo di azoto seleziona gli organismi azoto­fissatori

Terreno con un antibiotico seleziona gli organismi resistenti ad esso

MORFOLOGIA DELLE COLONIE BATTERICHE

Ciò che si forma sui terreni di coltura

◊ ◊

Forma puntiforme, circolare, filamentosa, irregolare, rizoide, fusiforme Spessore piatto, rialzato,

convesso, cupoliforme, umbonato

Margine regolare, ondulato, lobato, eroso, filamentoso, increspato OSSERVAZIONE AL

MICROSCOPIO ◊

Utilizzo il microscopio ottico con contrasto di fase i batteri sono quasi trasparenti, occorre una lente che accentui la

sfasatura della luce per aumentare il contrasto

◊ ◊

In alternativa colorazione importante per mettere in evidenza cellule o particolari strutture, ma altera le cellule Porre colorante direttamente sul vetrino

portaoggetti ◊le ◊

Preparo il campione e Asciugo l’aria cellule sono fissate al vetrino con la fiamma

aggiungo il colorante osservazione (ingrandimento x1000)

COLORAZIONE DI GRAM

Gram microbiologo danese ◊

Divide la popolazione di organismi in due grandi gruppi chi si colora e chi no Si devono usare cellule

vitali ed integre, altrimenti il colorante esce

◊ ◊ ◊

Fase 1 aggiungo colorante cristal violetto tutte le cellule sono viola

◊ ◊

Fase 2 trattamento in soluzione iodata per 3 minuti tutte le cellule restano viola

◊ ◊ ◊

Fase 3 decoloro rapidamente con alcool le gram+ restano viola, le gram­ perdono il colore Fase 4

controcolorazione con safranina gram+ viola, gram­ rosso

COLTURA PURA

Coltura contenente un solo tipo di microrganismi Ottenerle è

complicato in terreno liquido ◊

Più facile e rapido in terreno solido ogni colonia distinta dalle altre è una coltura pura TITOLO DI COLTURA BATTERICA

Indica la concentrazione di cellule presenti in una coltura (in cellule/mL)

◊ ◊

Titolo totale vengono contate tutte le cellule, sia vive che morte Titolo vitale

vengono contate solo le cellule vive più usato

◊ ◊ ◊ ◊

Per il totale conteggio diretto con il microscopio uso la camera contacellule griglia di dimensioni note più altezza camera nota volume

misurato da cui ricavo quello della soluzione totale

Per il titolo vitale

Un batterio vivo si riproduce, quello morto no ◊

Per individuare i batteri vivi vedo quanti possono riprodursi dà origine a colonie distinte

◊ ◊

In una provetta metto 1 mL della mia soluzione + 9 mL di soluzione sterile mischio prelevo 1 mL e lo sposto in una seconda provetta con 9

mL di soluzione sterile così via, diluendo sempre più ◊

Da ogni soluzione prelevo un campione noto e lo poso su terreno solido con i campioni più diluiti distinguo

le colonie e per conto ricavo la concentrazione totale UFC unità

formato colonie

Continue diluizioni della coltura originaria◊ottengo un numero di colonie contabile◊ numero di cellule esprimibile in UFC ESERCIZIO D’ESAME

Piastro 0,1 mL di una diluizione 10 di una coltura batterica. Conto 80 colonie. Qual è il titolo vitale?

­5

Titolo = potenze in base dieci

80 (conto cellule) x 10 (fattore di diluizione)

­5

Devo ottenere il numero di cellule per mL di soluzione

◊ ◊

Soluzione numero di cellule / mL soluzione originale mL soluzione originale = 0,1 x 10 (mL per diluzione) 80 / (0,1 x 10 ) = 80 / (10 x 10 ) =

­5 ­5 ­1 ­5

80 / 10 = 80 x 10 = 8 x 10 UFC/mL

­6 6 7

Il titolo viene usato per studiare l’andamento di crescita di una coltura

MASSA ◊

Possiamo determinare anche la massa di una coltura (pero per unità di volume mg x mL)

Massa e titolo non sono immediatamente convertibili tra di loro DETERMINAZIONE DELLA

MASSA ◊

Pesare le cellule separarle da terreno di coltura

Peso umido le cellule sono raccolte per centrifugazione o filtrazione e pesate

◊ ◊

Problema fino al 80­90% di questo peso è acqua la quantità di acqua in una cellula non è costante La pesatura non è precisa

Peso secco dopo la filtrazione le cellule sono seccate a 100° C ◊ ◊

Il peso secco è circa il 20­25% del peso umido non c’è più acqua peso costante

◊ ◊

Problemi si deve usare una grande quantità di materiale in media una cellula pesa 3x10 g (E. coli) Per avere pesi determinabili

­13

◊ ◊ ◊

grande quantità di cellule campioni molto consistenti Occorre molto tempo ore per far evaporare tutta l’acqua

Volume misura indiretta

Si centrifuga un’aliquota della coltura in provetta graduata e si osserva il volume occupato dalle cellule che sedimentano

Più veloce, ma occorre grande quantità di materiale

◊ ◊

Nefelometria/colorimetria misura indiretta, ma è la più usata si usa uno spettrofotometro)

Si usa un fascio di luce monocromatica (λ precisa) che incide sulla provetta con la coltura Una parte del fascio passa

indisturbato luce trasmessa (misura turbidinometrica)

Una parte del fascio viene assorbita dalle cellule

Una parte del fascio viene riflessa misura nefelometrica

Lo strumento, secondo la legge di Lambert­Beer, misura la luce trasmessa Si ottengono valori numerici

correlati alla massa cellulare nella provetta ◊

La trasmittanza è inversamente proporzionale alla massa si usa l’assombranza (­log naturale della trasmittanza) che

direttamente proporzionale alla massa ◊

Lunghezza d’onda del fascio di luce compresa tra 600 e 700 nm parte alta del visibile

Misurazione velocissima permette di seguire in tempo reale quello che succede nella coltura

Posso usare campioni molto piccolo i fotometri misurano anche V < 1 mL e non

consumano il campione

CRESCITA BATTERICA

Mondo batterico niente riproduzione sessuata In genere

riproduzione per scissione:

1. replicazione del DNA

2. aumento della massa cellulare ◊

3. formazione del setto a metà della cellula si forma in un punto preciso

4. una copia del DNA a ciascuna cellula figlia ­> meccanismi che lo assicurano

5. formazione di due cellule figlie identiche tra loro e alla cellula madre DIVISOMA

Struttura che si forma nella zona di formazione del setto processo guidato Accumulo di proteine

specifiche per questa funzione

Fts Z ring proteina segnale di dove accumulare e portare le singole componenti per gli involucri delle nuove cellule

Ogni cellula figlia ha metà involucro della cellula madre e metà di nuova generazione

◊ ◊

Proteine citoscheletriche MreB (struttura simile all’actina) implicata nella morfologia cellulare e nella migrazione dei cromosomi

La regione di origine di ciascuno cromosoma neoreplicato si associa alla proteina mezzo

per assicurarsi che ogni cellula figlia abbia un cromosoma La proteina trascina

ogni cromosoma a un lato della cellula

TEMPO DI GENERAZIONE

Tempo necessario perché una cellula si duplichi (definizione teorica)

Tempo necessario perché raddoppi il numero di cellule della popolazione (definizione pratica) Tempo tipico per ogni specie microbica

Influenzato da tutta una serie di fattori ambientali

In condizioni ottimali, qual è il tempo di generazione minimo?

◊ ◊

Dato in minuti grande variabilità in media circa 20 minuti Anche

l’organismo più lento ha un tempo di 6 ore

La maggior parte nell’ordine dei minuti

Eucarioti ore/giorni

CURVA DI CRESCITA

1) Scala lineare (vedi appunti)

1 è il numero minimo di cellule

Si ottiene una curva di tipo esponenziale

2) Scala semilogaritmica (vedi appunti) Trasforma la

curva n una retta

Dal grafico, posso facilmente ricavare il tempo di generazione Es. t (tempo) = 6 h

N (n° generazione) = 1

G (tempo di generazione) = t/n = 6/1 = 6 h Posso anche

estrapolare valori attesi N = N x 2 N =

Dalla curva esponenziale equazione tipica per illustrare la crescita batterica n

0

numero finale cellule N = numero iniziale cellule === dati ricavabili sperimentalmente

0 N e N

N = numero di generazioni 0

sono espressi come potenze in base 10

Posso usare questa equazione per ricavare il numero di generazione e poi il tempo di generazione

Log N = log N x nlog 2 n = (log N – log N ) / log 2 Log 2 = 0,301 = 0,3

0 0

Problema d’esame N = 10 N = 10 t = 10 h

In 10 ore una coltura batterica è passata da 10 a 10 cellule. Qual è il tempo di generazione (G)?

2 8 8 2

0

N = (log 10 – log 10 ) / 0,3 = 8­2/0,3 = 6/0,3 = 20

8 2 ◊

G = t/n = (10x60)/20 = 30 min converto le ore in minuti PROBLEMA

Partendo da una singola cellula, una coltura batterica cresce in modo esponenziale per 36 ore, con tempo di

generazione di 30 minuti. Calcolare il peso delle cellule al termine di questa crescita.

N = N x 2 1 cellula = 3 x 10 g (peso medio di una cellula n = 36 x 2 = 72

n ­13

0

◊ numero di generazioni

N = 1 x 2 = 4,7 x 10

72 21

Peso = 4,7 x 10 x 3 x 10 = 1,4 x 10 g

21 ­13 9

Crescita esponenziale partendo da niente, numeri all’inizio molto bassi diventano sempre più elevati Il fenomeno spesso diventa

visibile quando è tardi per fermarlo

Cosa impedisce a una coltura batterica di raggiungere i valori estremi dell’esempio?

Servono enormi risorse nutrizionali un andamento del genere può essere mantenuto solo per tempi brevi

FASI DI UNA CRESCITA BATTERICA

1) In laboratorio Ci

sono quattro fasi:

◊ ◊

Prima fase latenza non c’è cambiamento nel numero di cellule

◊ ◊

Nuovo ambiente le cellule devono imparare a crescere in questo ambiente sviluppare i processi metabolici adeguati

per la crescita

Più o meno lunga a seconda delle cellule, del loro tipo e delle condizioni del terreno di coltura

◊ ◊

Seconda fase esponenziale crescita nel numero di cellule molto rapido

◊ ◊

Usano le risorse presenti più cellule ci sono, più rapido è il consumi il sistema non può sostenete all’infinito

questo tipo di cellule

◊ ◊ ◊

Terza fase stazionaria la crescita si arresta (non c’è più divisione) n° cellule morte = n° cellule vive

La richiesta energetica si riduce le sostanze rimase sono sfruttate per il metabolismo essenziale

Concomitante aumento delle sostanze tossiche di scarto metabolico

◊ ◊

Quarta fase morte le cellule iniziano a morire per mancanza di nutrienti e aumento di sostanze tossiche Quelle che possono, sporificano

per superare questa fase

2) In natura

Comunità microbiche sparse nell’ambiente A volte

occupano le stesse nicchie ◊ ◊

Nella maggior parte dei casi ambiente povero crescita lenta

Può capitare che arrivi grande quantità di sostanze le specie microbiche capaci di sfruttarle iniziano a moltiplicarsi esponenzialmente

Due vantaggi aumento rapido del numero di individui

◊ ◊

Consumo rapido delle sostanze vantaggio selettivo delle specie più veloci Esaurimento

stazionario ◊ ◊ ◊

In ambiente naturale le sostanze tossiche di un organismo possono essere utili per un altro nuova crescita Influenza del pH ogni organismi

cresce a un determinato pH

PERDITA DI VITALITÀ ◊

Riguarda le specie che non sporificano diversi fenomeni

Fase di morte le cellule muoiono, tranne pochi superstiti che posso ripopolare l’ambiente Lento calo della popolazione

◊ ◊

Morte cellulare programmata geneticamente codificata alcune cellule muoiono riversando all’esterno il contenuto

citoplasmatico nutrimento per il resto della popolazione Sterilità cellulare

◊ ◊

programmata le cellule entrano in dormienza poco attive, non coltivabili

Solo un segnale opportuno fa riprendere l’attività

CRESCITA SINCRONA ◊

Far sì che tutte le cellule si dividano contemporaneamente sincronizzazione In una popolazione in

genere non c’è ogni cellula si divide quando è pronta Interesse di studio limitato

Tutte le cellule si dividono nello stesso istante crescita a scalini

Regge solo per poche divisioni cellulari

Si vede solo con il titolo vitale (numero di cellule vive) COLTURE CONTINUE­

CHEMOSTATO ◊

Crescita continua mantenere la coltura in fase esponenziale di crescita

Chemostato apparecchio più usato a questo scopo ◊

Camera di cresctia (in terreno liquido) dove creiamo le condizioni idonee di crescita un nutriente a concentrazione limitata (non sufficiente

per far arrivare le cellule a crescita massima)

Un serbatoio da cui faccio affluire terreno fresco mentre un volume uguale di terreno usato viene tolto

Il volume della coltura non cambia le sostanze nutritive non si esauriscono La velocità di crescita è

regolata dalla velocità con cui si fornisce il terreno di coltura

UTILITÀ DEL CHEMOSTATO

Scopi applicativi e di ricerca

Mantenere una popolazione in crescita esponenziale per tempi lunghi

◊ ◊

In ecologia imitare le basse concentrazioni di substrato che si trovano in natura studiare la competitività

Da inoculo misto, utilizzando terreno di arricchimento e variando la velocità di diluizione si può selezionare una coltura pura

FATTORI CHE INFLUENZANO LA CRESCTIA BATTERICA

1) TEMPERATURA

◊ ◊ ◊

Temperatura ottimale tipica di ogni popolazione temperatura a cui la popolazione si accresce a velocità massima Temperatura minima temperatura

sotto la quale non si ha più divisione cellulare (essenziale acqua allo stato liquido) Temperatura massima temperatura massima a cui la popolazione può

sopravvivere ◊ ◊ ◊

Sotto la temperatura minima membrana non più fluida (gelificazione) non può più svolgere le sue funzioni le cellule sono bloccate e non si

dividono più, ma sono vive ◊

Salendo oltre la temperatura minima aumento della fluidità di membrana e aumento della velocità di crescita fino al

valore ottimale

Le reazioni enzimatiche avvengono sempre più velocemente fino alla temperatura ottimale

◊ ◊

Oltre la temperatura ottimale denaturazione proteine, collasso membrana cellulare, lisi termica morte cellulare Ogni microrganismo ha i suoi valori di

◊ ◊ ◊

temperatura ottimale, massima e minima classificabili in tal senso Pricofili/criofili T° ottimale = 10­20° organismi del suolo

◊ ◊ ◊

Mesofili T° ottimale = 30­40° tutti i patogeni dei mammiferi Termofili T°

ottimale = 50­70°

Ipertermofili T° ottimale > 90° ◊

La temperatura influenza il tempo di generazione più altra + T° ottimale, minore è il tempo di generazione T° massima accettabile di un

organismo T° massima a cui può riprodursi ◊

Dal punto di vista evolutivo, si è passata da organismi termofili a mesofili o viceversa? La prima geologicamente

la terra è andata raffreddandosi

Termofili tutte le funzioni metaboliche sono attive a temperature elevate

Basta una mutazione genetica per passare da un organismo termofili a uno mesofilo

◊ ◊

Batteri che vivono in climi artici tempi di crescita molto lenti estrema povertà di risorse nutrizionali

2) pH

Nel citoplasma il pH deve essere attorno alla neutralità

Ambiente esterno i batteri possono crescere in sia in ambienti estremamente acidi che basici

Meccanismi di trasporto di membrana per mantenere la differenza di pH richiede grandi quantità di energia

3) Concentrazione di ioni sodio

Il sodio è molto importante per la vita cellulare

◊ ◊

Non alofili organismi che non sopportano grandi concentrazioni di sodio (E. coli) Alotolleranti organismi più tolleranti,

iniziano a risentirne più lentamente (S. aureus)

◊ ◊ ◊ ◊

Alofili l’organismi ha bisogni di una certa concentrazione di sodio per riprodursi picco massimo declino hanno un optimum di

concentrazione (Vibria fisheri)

◊ ◊

Estremamente alofili hanno bisogno di alte concentrazioni di sodio per riprodursi a un certo punto entrano in

plateau vivono in ambienti satura di sodio (H. salinarum)

4) Concentrazione di ossigeno

Osservando le distribuzioni dei batteri in una soluzione in provetta

◊ ◊

Aerobi obbligati necessitano di ossigeno per crescere (sulla superficie della soluzione) Anaerobi stretti si riproducono

solo in assenza di ossigeno (sul fondo della provetta)

Anaerobi facoltativi sia con che senza ossigeno, ma preferiscono averlo (in tutta la provetta, ma > concentrazione in superficie)

Microaerofili hanno bisogno di ossigeno, ma in concentrazioni più basse degli aerobi (appena sotto la superficie)

Anaerobi tolleranti non hanno preferenze (distribuzione uniforme)

Anaerobi stretti la loro sensibilità all’ossigeno varia da microrganismo a microrganismo ◊

Alcuni muoiono appena ne entrano in contatti, altri lo tollerano ma non si riproducono Giara per anaerobiosi crea

condizioni di anaerobiosi elimina ossigeno combinandolo con l’idrogeno

METABOLISMO BATTERICO

Insieme di tutte le reazioni chimiche della cellula Anabolismo

consumo di energia/sintesi di sostanze

Catabolismo conservazione di energia(degradazione di sostanze) ATP

Molecola principale per immagazzinare e fornire energia

Tre legami fosfato ad alta energia ◊

Processi metabolici catalizzati da enzimi facilitano le reazioni chimiche CLASSIFICAZIONE IN BASE ALLE VIE

BIOSINTETICHE USATE

Sulla base delle fonti di carbonio

Eterotrofi usano una sostanza organica come fonte di carbonio

Non sono capaci di produrre ex­novo materia organica

Autotrofi capaci di usare l’anidride carbonica atmosferica come fonte di carbonio per la sintesi di sostanze organiche CLASSIFICAZIONE IN BASE ALLA

FONTE DI ENERGIA USATA PER GENERARE ATP

◊ ◊ ◊

Fototrofi usano la luce forza proton­motrice per generare ATP (non sempre fotosintesi) sia auto­ che eterotrofi

Chemiotrofi usano reazioni redox su substrati organici o inorganici Organismi

chemioorganotrofi eterotrofi che usano materia organica ◊

Autotrofi che organicano la CO2 e producono ATP in totale assenza di luce si trovano nelle profondità oceaniche

Organismi chemiolitotrofi l’energia per le reazioni redox proviene da una sostanza inorganica

TIPI DI METABOLISMO USATI DAI MICRORGANISMI CHEMIOTROFI

Catena di reazioni redox flusso di energia fino all’accettore finale

Fermentazione l’accettore finale di elettroni è un composto organico che deriva dalla degradazione del composti di partenza

◊ ◊ ◊

Respirazione aerobia l’accettore finale è l’ossigeno più energia composto iniziale totalmente degradato

◊ ◊ ◊

Respirazione anaerobia l’accettore finale è un composto inorganico diverso da O2 leggermente meno energia Glicolisi (via di embden­meyerof)

inizio delle vie metaboliche respiratorie e alcune vie fermentative degradazione di glucosio a due molecole di acido piruvico

FERMENTAZIONE

Via molto importante

Prodotti finali di grande interesse applicativo Vedi slide per

reazioni

1) Fermentazione omolattica

Streptococchi e lattobacilli Prodotto finale

◊ acido lattico

Usato nella produzione dello yogurt

2) Fermentazione alcoolica Lievito

(eucariote) ◊

Prodotti finali etanolo e anidride carbonica

3) Fermentazione propionica

Propionibacterium, Veillonello

Parte da tre molecole di acido piruvico

Prodotto finali acido acetico, anidride carbonica, 2 acido propionico Usato nella

produzione di alcuni formaggi

Può partire anche dall’acido lattico, riconvertendolo a piruvato

4) Fermentazione misto acida

E. coli, enterobatteri

Prodotti finali acido lattico, acido succinico, etanolo, acido acetico (H2 + CO2) Quale reazione fa dipende

dall’ambiente in cui si trova

5) Fermentazione butilen­glicole

Enterobatteri, Bacillus, Pseudomanus

Prodotto finale gliocole 2­3 butilenico

6) Fermentazione butirrica, butanolica e acetonica

Clostridium

Da quattro molecole di acido piruvico Prodotti finali

◊ ◊

acido acetico etanolo ◊

Acetone isopropanolo Acido

butirrico

Butanolo

CO2

7) Fermentazione eterolattica

Leunostoc ed alcuni lattobacilli

◊ ◊

Parte dal glucosio degradato a gliceraldeide 3 fosfato Prodotti finali di

acido lattico, acido acetico, etanolo e CO2 Sfruttato nell’industria casearia

8) Fermentazione di Entner­Doudoroff

Zymomons, enterobatteri, acinetobacter

Parte dal glucosio

Prodotti finali etanolo, CO2

Usato nella produzione di alcune bevande alcoliche

AEROBIOSI E ANAEROBIOSI

◊ ◊ ◊

Aerobi obbligati necessitano di ossigeno (respirazione aerobia) molecola indispensabile (bacillo tubercolosi) Anaerobi obbligati crescono solo in

◊ ◊

assenza di ossigeno (clostridi) fermentazione, respirazione anaerobia Microaerofili necessitano di una bassa tensione di ossigeno

Anaerobi facoltativi crescono sia in assenza che in presenza di ossigeno, metabolismo sia aerobio che anaerobio Lieviti, enterobatteri

Preferiscono vivere in presenza di ossigeno maggior quantità di ossigeno

Due vie metaboliche fermentazione, respirazione aerobica Anaerobi tolleranti

◊ ◊

crescono sia con che senza ossigeno equamente distribuiti

Operano solo la fermentazione (lattobacilli) PERCHÉ

L’OSSIGENO È TOSSICO? ◊

O è una molecola estremamente reattiva O + e O

­ ­

2 2 2

(superossido)* ◊ ◊

O ­ + e + 2H+ H O (acqua ossigenata)* H O + e + H

­ ­ +

2 2 2 2 2

H O + OH∙ (radicale ossidrile)* OH∙ + e + H H O

­ +

2 2

Totale = O + 4e + 4H 2H O

­ +

2 2

*Molecole molto reattive e pericolose per la cellula ◊

Una cellula incapace di eliminare queste molecole ossigeno letale

◊ ◊ ◊

Enzimi che eliminano i composti tossici dell’ossigeno catalasi H O + H O H O + O

2 2 2 2 2 2

◊ ◊

La catalasi è un carattere discriminante tra le cellule batteriche test semplice due gocce di acqua ossigenata su cui pongo in sospensione le

cellule con presenza di catalasi, la goccia inizia a gorgogliare

RESPIRAZIONE ANAEROBIA ◊

Possibili accettori finali Fe, N, S,

Via metabolica in cui l’accettore finale è diverso dall’ossigeno e il composto iniziale è totalmente degradato

CO , fumarato

2 ◊

Molte di queste respirazioni restituiscono all’aria composti altrimenti fissati in sali respirazione di nitrati BIOMINERALIZZAZIONE

Alcuni microrganismi, se fatti crescere in ambiente con arsenico (solubile), sono in grado di trasformarlo in trisolfuro di

arsenico (non solubile) ◊

Processo in cui il metabolismo microbico mineralizza molto diffuso in natura

◊ ◊

Interesse applicativo l’arsenico è un contaminante usato in molte industrie sviluppo di tecniche di depurazione

FOTOTROFIA ◊

Processo metabolico in cui la luce è usata nella produzione di energia Fotosintesi

processo più diffuso

◊ ◊

Clorofilla mondo vegetale Batterioclorofilla

mondo batterico Le due clorofille hanno struttura

simile ◊

Cianobatteri fotosintesi identica a quella delle piante

Altri batteri batterioclorofilla

Clorofilla pigmento usato dalla cellula per catturare energia luminosa ◊

La batterioclorofilla ha picchi di assorbimento diversi da quelli della clorofilla vegetale Carotenoidi altri pigmenti fotosintetici

Potenziare la capacità di assorbimento della cellula Proteggere la cellula da eventuali

danni dell’energia luminosa

Dove si trovano gli enzimi fotosintetici?

Membrane lamellari ripiegamenti citoplasmatici della membrana cellulare

Clorosomi vescicole subito sotto la membrana che contengono enzimi fotosintetici (batteri che vivono dove la luce è scarsa)

Fotosintesi vegetale libera ossigeno perché l’acqua è il donate iniziale di elettroni

◊ ◊ ◊

La fotosintesi batterica non libera ossigeno flusso di elettroni staccati dall’energia luminosa genera ATP Ciclo chiuso a fine giro gli

elettroni tornano al punto di partenza

◊ ◊

Ciclo aperto donatore diverso dall’acqua di solito H S, S O , S , Fe

2­ 0 2+

2 2 3

Lo zolfo liberato precipita nella cellula e viene segregato in vescicole SINTESI DI AMMINOACIDI

Ci sono tre diverse vie metaboliche

Tramite varie diramazione ognuna produce i 19 amminoacidi

REGOLAZIONE DEL METABOLISMO

◊ ◊

Batteri hanno la capacità di sintetizzare una grande quantità di prodotto necessari allo sviluppi richiede una grande quantità di energia

Certe vie metaboliche sono attive solo se richiesto adattamento

Spesso questo controllo avviene a livello genico STRATEGIE DI

REGOLAZIONE ◊ ◊ ◊

Espressione costitutiva nessuna regolazione il gene non è mai spento continua produzione e attività cellulare Geni fondamentali per la vita

Regolazione prodotto enzima continua produzione dell’enzima, ma l’attività di quest’ultimo può essere regolata

Inibizione a feedback autoregolato e rapido Siti allosterici

◊ inibitori dell’attività enzimatica

Regolazione sintesi enzima

◊ ◊

Alla traduzione gene sempre trascritto, ma non sempre tradotto Alla trascrizione il

gene non viene sempre trascritto

DNA­girasi riduce i super­avvolgimenti davanti alla forca replicativa

◊ ◊ ◊

Splicing delle proteine sistema di regolazione finché non viene tagliata non funziona (controllo post­traduzione) RNA antisenso (post­trascrizione)

◊ ◊

in alcuni casi piccoli pezzi della catena non codificante sono trascritti complementare al mRNA si possono attaccare al RNA, formare una doppia

elica e bloccare la traduzione il ribosoma non può attaccarsi

◊ ◊

Regolazione della trascrizione non si forma mRNA regolazione tipica batterica

Estremamente rapida

◊ ◊

Geni della stessa via metabolica raggruppati tutti insieme operone PROCESSO DI

REPRESSIONE ENZIMATICA

Nei processi di sintesi di amminoacidi

La RNA­polimerasi si attacca al promotore in testa a un operone

La trascrizione avviene quando il repressore non è agganciato alla catena

◊ ◊

Un corepressore si lega al repressore complesso attivo che si aggancia all’operatore (zona dell’operone tra promotore e primo gene codificante)

trascrizione bloccata

Avviene quando la cellula cresce in coltura con amminoacidi PROCESSO DI INDUZIONE

ENZIMATICA

Nei processi di degradazione di zuccheri Stessa struttura di

prima ◊

Il repressore è attivo appena prodotto si attacca subito all’operatore

Presenza di un induttore si lega al repressore e lo inattiva quando c’è necessità La RNA­polimerasi può

partire

CONTROLLO POSITIVO DELL’INDUZIONE DI UN ENZIMA

In presenza di maltosio ◊ ◊

La RNA­polimerasi non ha bisogno di innesco si attacca al sito promotore sequenza particolare di DNA

◊ ◊

Questo legame deve o può essere aiutato proteine attivatrici si lega a un sito del DNA (sito attivatore) promuovendo l’aggancio della RNA­

polimerasi

L’attivatrice ha bisogno di un induttore per attivarsi

MECCANISMO D’AZIONE DELL’ATTIVATORE

Enhancer proteine attivatrici negli eucarioti

Funzionano solo legandosi al loro sito di aggancio sul DNA Cooperazione tra attivatore e

RNA­polimerasi ◊

Quando il sito di aggancio del promotore è lontano il DNA fa un ripiegamento per avvicinarlo CRESCITA DIAUXICA

Esperimento con E. coli studio sul comportamento dell’operone lattosio

Per grafico, vedi appunti ◊ ◊

In una coltura con il galattosio due fasi di crescita esponenziale intermezzate da una fase stazionaria Prima fase metabolismo del

glucosio ◊

Seconda fase metabolismo del lattosio AMP ciclico

◊ molecola usata come segnale

Regola il legame della proteina attivatrice all’operone lattosio

◊ ◊

Presenza di solo lattosio AMP in grande concentrazione si può legare

◊ ◊

Presenza anche di glucosio AMP in piccola concentrazione l’attivatore non si può legare Il glucosio è favorito

perché l’espressione dell’operone glucosio è costitutiva non si può spegnere OPERONE TRIPTOFANO

Sintesi dell’amminoacido triptofano amminoacido raro

Operone accesso solo quando l’amminoacido non è presente nella coltura ◊ ◊

Esiste una sequenza di nucleotidi tra promotore e primo gene codificante regolazione codifica per un piccolo oligopeptide che contiene due residui

di triptofano ◊ ◊

Attenuazione eccesso di triptofano terminazione della trascrizione

Cerca di attenuare l’espressione genica Sincronizzazione tra

trascrizione e traduzione

mRNA a quattro zone identificate in base alla loro capacità di fare appaiamenti tra di loro Si appaiono le zone 1 e 2, 3 e

4, 2 e 3

Determinazione di quali segmenti sono liberi quando vengono tradotti

Segmenti 1­2 oligopeptide regolatore

Con eccesso di triptofano traduzione senza problemi

◊ ◊

Legame 3­4 segnale di terminazione per la RNA­polimerasi Carenza di triptofano la

traduzione si blocca quando devo agganciare il triptofano

Legame 2­3, lasciando spaiata la zona 4 La RNA­

polimerasi prosegue la trascrizione

Sistema di regolazione a più stadi molto complesso

Sistema di attenuazione sensibile alla quantità di tRNA carico di triptofano ESEMPI DI CONTROLLO

GLOBALE IN E. COLI

Sistema segnale attività regolatrice n° geni controllati

Respirazione aerobia presenza di O2 repressione oltre 50 Respirazione

anaerobia assenza di O2 attivatore oltre 70 Repressione da

cataboliti presenza di AMP ciclico attivatore oltre 300 Risposta SOS

danni al DNA repressore oltre 20

Shock termico temperatura fattore 36

32

σ

Uso di N2 limitazione di NH3 fattore oltre 12

64

σ

FATTORI σ

Compito di riconoscere il promotore Componente

della RNA­polimerasi ◊ ◊

A seconda del fattore , la RNA­polimerasi riconosce un promotore piuttosto che un altro trascrizione di certi geni 70 fattore principale per la crescita

σ σ

a condizioni normali

QUORUM SENSING

Regolazione che riguarda una popolazione batterica, sia della stessa specie che di specie diverse Sistema di combinazione

Sistema di regolazione che si basa sulla percezione della densità cellulare della popolazione

◊ ◊ ◊ ◊

Gram produzione di omoserina lattone acilato (AHL) diffonde all’esterno la sua concentrazione aumenta con la densità cellulare quando

­ ◊ ◊

raggiunge una certa concentrazione rientra nel citoplasma e si lega a un recettore segnale di attivazione

Regola bioluminescenza in alcuni batteri (luciferasi)

Espressione genica in P. aeruginosa produzione di biofilm Espressione di geni di

virulenza (patogenicità) in S. aureus

SISTEMA A DUE COMPONENTI

Proteine transmembrana legano molecole esterne (sensori)

◊ ◊

Legame con il sensore la proteina trasferisce un gruppo fosfato a un'altra proteina attivazione di quest’ultima Sistema per stabilire segnali tra ambiente

esterno ed interno

CICLI BIOGEOCHIMICI

Cicli della materia dove intervengono vari fenomeni

◊ ◊

Batteri ruolo fondamentale senza di essi non sarebbero percorsi ciclici Processi di

trasformazione di elementi fondamentali per gli organismi viventi In questi cicli sono coinvolti numerosi

microrganismi di generi e specie diversi

Spesso sono gli unici agenti biologici capaci di rigenerare le forme degli elementi necessari ad altri organismi CICLO DEL CARBONIO

Carbonio costituente della materia organica Fonte

◊ ◊

principale atmosfera CO2 (inorganica)

◊ ◊

Organismi autotrofi capaci di organicare la CO2 (vegetali, microrganismi) sia in ambiente terrestre che acquatico La materia organica così formata viene

resa disponibile anche per gli organismi autotrofi la trasformano in altra materia organica

Gli autotrofi ne degradano una parte per produrre energia restituita all’atmosfera come CO2

◊ ◊

Microrganismi respirazione aerobia che produce metano (CH4) sfruttato da alcuni batteri per produrre energia Ciclo continuo

◊ ◊

Materia organica disponibile in vari ambienti una parte finisce in profondità zone di anaerobiosi sotto le falde

◊ ◊

acquifere in tempi geologico è trasformato in combustibili fossili (idrocarburi, carbone) da microrganismi anaerobi stretti deposito di carbonio fuori dal

◊ ◊

ciclo usandoli parte di questo carbonio rientra nell’atmosfera e si aggiunge a quello già presente effetto sul riscaldamento globale

Il carbonio si trova in equilibrio nelle sue varie forme Produttori primari

◊ organismi autotrofi (livello I) ◊

Su di essi gravano gli altri livelli trofici direttamente gli erbivori (livello II), indirettamente i carnivori (livelli III, IV) La quantità di materia organica

diminuisce salendo la scala dei livelli trofici

◊ ◊ ◊

Tutti i livelli trofici quando gli organismi muoiono degradatori organismi in grado di decomporre la materia

organica e liberarne le componenti (CO2 e sali) CICLO

DELL’AZOTO ◊ ◊ ◊

Fonte principale atmosfera molecola biatomica N2 gas inerte (triplo legame covalente)

Organismi viventi hanno bisogni di azoto in forma di sale la trasformazione dell’azoto atmosferico è molto importante

Specie vegetali che crescono in associazione con microrganismi in grado di convertire l’azoto atmosferico in altre

◊ ◊

molecole sfruttabili da altri organismi viventi microrganismi azoto­fissatori Azoto fissazione molto

dispendiosa energeticamente ◊

Trasforma N2 in NH3 usato e integrato nei gruppi amminici degli amminoacidi

L’ammoniaca è convertita nei sali d’azoto sfruttati dal mondo vegetale possono essere restituiti all’atmosfera tramite un processo di respirazione anaerobia

Organismi azoto­fissatori sono molto studiati sfruttamento in agricoltura per ridurre la quantità di fertilizzanti

chimici ◊

Si localizzano in noduli radicali nelle piante ospiti solo in alcune specie di piante Gli azoto­fissatori vivono

spesso in simbiosi con le piante riconoscimento specifico Capaci anche di vita allo stato libero

Formazione del nodulo radicale: ◊

Riconoscimento ed attacco rilascio di molecole segnale dalla pianta Escrezione di fattori NOD da

◊ ◊

parte dei batteri arricciamento della radice Invasione il rizoba invade la radice

I batteri si spingono all’interno senza rompere le membrane cellulari ◊

Formazione della camera di crescita vicino ai vasi linfatici e formazione del nodulo Vantaggi per la pianta, fonte

di azoto Per i microrganismi, ottimo rifornimento di sostanze nutritive

◊ ◊

Enzima nitrogenasi strettamente anaerobio una singola molecola di ossigeno lo disattiva in modo permanente

◊ ◊ ◊

Gli azoto fissatori sono spesso aerobi produzione di leg­emoglobina cattura e trasporta l’ossigeno ambiente anaerobio per la nitrogenasi e

rifornimento di O2 per le strutture dove è necessario

CICLO DELLO ZOLFO

Zolfo la fonte principale è lo zolfo elementare o inglobato in minerali (pirite, cuprite, carbone) I microrganismi ossidano lo

zolfo in solfati o acido solfidrico

I solfati sono usati dalle piante materia organica poi disponibile per tutti gli altri

◊ ◊

Degradazione libera acido solfidrico (gas) ossidato per produrre zolfo elementare

◊ ◊

Batteri capaci di creare cortocircuiti per tagliare fuori piante ed animali convertendo direttamente i solfati in acido o non producendo direttamente i sali

◊ ◊ ◊

Questi processi colpiscono in modo forte le attività umane industria mineraria miniere a cielo aperto i drenaggi dell’acqua piovana causano la

liberazione di acidi di zolfo aumento concentrazione di acidi nelle acque

◊ ◊

Immissione di zolfo nell’atmosfera acido solfidrico, anidride solforosa e solforica prodotti di degradazione materia organica, attività vulcanica e attività

◊ ◊ ◊ ◊

umana consumo di combustibili fossili le anidridi diventano acidi precipitano al suolo con i fenomeni atmosferici piogge acide

DMSP

Dimetilsolfoniopropionato ◊

Composto meno significativo del ciclo dello zolfo usato dal batterioplancton come fonte di zolfo

◊ ◊ ◊

Con particolari condizioni atmosferiche fioriture di batteriplancton, poi degradato velocemente liberazione di dimetilsolfuro (DMS) aumenta la

capacità di formare nubi (influenza sui processi atmosferici)

GENETICA DEI MICRORGANISMI

Mutazione cambiamento ereditabile in una sequenza di nucleotidi del DNA genomico di un organismo Si vede l’effetto della mutazione

◊ meccanismo di variabilità genetica

Cambiamento genetico di piccola entità

Ricombinazione genetica processo mediante il quale due molecole di DNA analoghe si scambiano segmenti genetici Crea variabilità

Cambiamento genetico più significativo

La mutazione è un fenomeno pre­adattativo o post­adattativo? diversi esperimenti per capirlo TEST DI FLUTTUAZIONE

Campione colture di E. coli sensibili a un batteriofago

• La coltura è usata per inoculare 50 piccole colture indipendenti preparate allo stesso modo più una coltura più grande il cui volume corrisponde alla

somma delle altre 50

• Crescita fino alla fase stazionaria

• Le cellule di ogni coltura sono piastrate su terreno solido con batteriofago, mentre quello della coltura grande è diviso in 50 colture solide più piccole

◊ ◊

Se post­adattativo variabilità minima circa lo stesso numero di cellule per ogni coltura

◊ ◊

Se pre­adattativo numero di cellule per coltura dipende da quando è avvenuta la mutazione Coltura A non avviene

nessuna mutazione

◊ ◊

Coltura B mutazione in fase tardiva pochi individui mutanti

◊ ◊

Coltura C mutazione in fase precoce 50% della popolazione mutante

Risultati le piastre della stessa coltura presentano circa lo stesso numero di cellule Le piastre di colture

diverse presentano grande variabilità

L’esperimento ci dice che la mutazione avviene prima del contatto con l’agente selettivo (PREADATTATIVO)

TECNICA DEL REPLICA PLATING

Utile per ottenere un duplicato di una coltura cresciuta in terreno solido

1. Cilindro coperto da tessuto sterile

2. Piastra con colture capovolgo e premo sulla garza

3. Prendo piastre nuove e le premo sulla garza ◊

4. Se le piastre sono identiche a quella madre copie perfette della piastra madre Esperimento con colture

di E. coli capace di crescere con virus

◊ ◊

Coltura originaria tutte cellule sensibili al virus (concentrazione di 10 cellule) piastra non selettiva

8

Replico su una piastra con batteriofago se presenti, sopravvivono le cellule resistenti al fago e con il tempo creano una nuova colonia

È possibile individuare la zona da cui è partita la colonia resistente

Vengono prese le cellule di questa zona poste su un nuovo terreno solido (concentrazione di 10 cellule)

6

Ripeto la procedura più volte, fino ad ottenere una coltura con 10 cellule corrispondenza diretta tra colonia selettiva e colonia della piastra madre

2

Dalla piastra madre ottengo una coltura pura di cellule resistenti

ESPERIMENTO DI SIB­SELECTION (1956)

Cavalli­Sforza e Lederberg

Esperimento simile al replica plating, solo in terreno liquido ◊

Facendo delle diluizioni, posso aumentare la frequenza dei mutanti in coltura Esempio coltura con

10 batteri/mL, con 10 batteri resistenti/mL

9 3 ◊ ◊

Rapporto 10 /10 = 10 frequenza delle cellule mutanti nella popolazione Facendo una diluizione 10

3 9 ­6 ­4

ci saranno 10 batteri/mL e 0,1 batteri resistenti/mL

5 ◊ ◊

Su 10 campioni di 1 mL uno conterrà una cellula resistente rapporto 1/10 = 10 Ripetendo il processo più volte ottengo

5 ­5

una coltura pura di cellule resistenti

Questi tre esperimenti provano che la mutazione avviene in modo casuale

MUTAZIONI DIRETTE O ADATTATIVE

Popolazione di E. coli lac mutanti incapaci di usare il lattosio

­

Riacquista più velocemente la capacità di usare questo zucchero se il lattosio è l’unica fonte di carbonio disponibile I mutanti lac compaiono più

+

frequentemente

◊ ◊

Ipotesi alcuni batteri possono selezionare quali mutazioni far avvenire per adattarsi meglio all’ambiente

controverso ◊ ◊

Spiegazione accettata la cellula che non è capace di usare il lattosio è destinata a morire la popolazione induce delle mutazioni per sopravvivere

◊ ◊

stato di impermutabilità (aumento della frequenza di mutazione) generazione di mutazioni multiple casuali in cui solo le cellule con mutazioni favorevoli

sopravvivono

Per cercare di acquisire caratteri nuovi che permettano di sopravvivere in quelle condizioni ambientali

TASSO DI MUTAZIONE

Frequenza con cui può comparire una determinata mutazione


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ciemme.

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10 mesi fa


DETTAGLI
Esame: Microbiologia
Corso di laurea: Corso di laurea in scienze biologiche
SSD:
Università: Firenze - Unifi
A.A.: 2017-2018

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher ciemme. di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Microbiologia e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Firenze - Unifi o del prof Mastromei Giorgio.

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