Appunti di Microbiologia

MICROBIOLOGIA

La microbiologia è una scienza che studia i microrganismi e i fenomeni a loro correlati, in particolare i

batteri, un gruppo molto grande di cellule molto piccole. La microbiologia studia anche la diversità e

l’evoluzione delle cellule microbiche, come e perché sono comparsi differenti tipi di microrganismi.

La microbiologia ruota attorno a due temi fondamentali interconnessi tra loro: comprendere la natura e i

fenomeni del mondo microbico e applicare la nostra conoscenza del mondo microbico.

Come scienza biologica di base, la microbiologia studia le cellule microbiche per esaminare i processi

fondamentali della vita.

Come scienza biologica applicata, invece la microbiologia applica le conoscenze della fisiologia dei

microrganismi a medicina umana e veterinaria, nell’agricoltura, nell’industria e nell’ambiente.

“Il ruolo dell’infinitamente piccolo, in natura, è infinitamente grande”

Louis Pasteur (1822-1895)

MICROBIOLOGIA MEDICA

E’ la disciplina che studia i microrganismi che causano malattia (infezione) nell’uomo. Studia:

- Batteriologia medica (batteri, organismi procariotici) -> BATTERI;

- Virologia medica (virus, prioni; particelle subcellulari) -> VIRUS;

- Micologia medica (funghi; organismi eucariotici) -> MICETI;

- Protozoologia medica (protozoi; organismi eucariotici) -> PARASSITI.

Tutte le cellule hanno caratteristiche in comune e contengono componenti uguali.

Hanno una barriera di permeabilità chiamata membrana citoplasmatica che separa l’interno della cellula,

cioè il citoplasma, dall’esterno.

Il citoplasma è una miscela acquosa di macromolecole (lipidi, proteine, acidi nucleici e polisaccaridi),

piccole molecole organiche, di vari ioni inorganici e di ribosomi.

La parete cellulare conferisce forza strutturale alla cellula: è una struttura permeabile localizzata all’esterno

della membrana citoplasmatica ed è molto più robusta della membrana stessa. Le cellule vegetali e la

maggior parte dei microrganismi hanno la parete cellulare, cosa che nelle cellule animali è assente.

L’esame delle strutture cellulari consente di distinguere due diversi tipi di cellule: procariotiche ed

eucariotiche.

TASSONOMIA ORGANISMI VIVENTI -> 3 linee evolutive (domini):

Le cellule procariotiche includono Bacteria (Proteobatteri, Mitocondri, Cloroplasti, Cianobatteri, Batteri

Gram-positivi, Ipertermofili) e Archaea (Ipertermofili, Metanogeni, Alofili estremi) e consistono di piccole

cellule strutturalmente semplici.

Le cellule eucariotiche sono più grandi che quelle procariotiche e contengono una serie di strutture

citoplasmatiche racchiuse nella membrana, cioè gli organelli (Animali, Funghi, Alghe, Protozoi, Piante,

Muffe mucillaginose, Flagellati, Giardia): Dominio Eukarya.

Le cellule eucariotiche ospitano il nucleo contenente il DNA, la struttura più importante, ma anche

mitocondri e cloroplasti, gli organelli specializzati nel fornire energia alla cellula, e vari altri organelli.

Sebbene le specie Bacteria e Archaea possano sembrare simili, dal punto di vista evolutivo non sono

strettamente imparentate.

È stato ipotizzato che le cellule derivino da un comune antenato chiamato LUCA: Last Universal

Commonwealth Ancestor, l'antenato universale comune a tutti gli esseri viventi. Dopo che le prime cellule si

sono sviluppate da materiale non cellulare attraverso un processo durato centinaia di milioni anni, la loro

crescita ha dato origine a popolazioni cellulari che hanno cominciato a interagire e a formare le comunità

microbiche (principali attività delle proprietà delle cellule microbiche cioè metabolismo, crescita, evoluzione,

differenziamento, comunicazione, scambio genetico, motilità). Lungo il percorso, l'evoluzione e lo scambio

genetico hanno dato origine a varianti che hanno reso più probabili il loro successo e la sopravvivenza.

BATTERIOLOGIA MEDICA

Parleremo adesso della (dei batteri):

- Struttura della cellula batterica e dei suoi componenti e le loro funzioni;

- Crescita e moltiplicazione dei batteri;

- Coltivazione dei batteri;

- Interazione microrganismo-ospite;

- Meccanismi con cui i batteri causano malattia (meccanismi di patogenicità batterica);

- Farmaci antibatterici -> meccanismi di azione e meccanismi di resistenza dei batteri a questi farmaci.

Alcuni esempi di malattie batteriche: faringo-tonsillite (placche) e impetigine (agente eziologico:

Streptococcus pyogenes); lebbra (agente eziologico: Mycobacterium leprae); peste bubbonica (agente

eziologico: Yersinia pestis); colera (agente eziologico: Vibrio cholerae); sifilide (agente eziologico:

Treponema pallidum); carie dentale (agente eziologico: ancora non si sa); foruncoli; meningite purulenta;

infezioni nosocomiali (si prendono dentro ospedali)…

Nomenclatura batterica: i batteri si denominano con un nome di genere e un nome di specie.

Es. Streptococcus pyogenes -> Streptococcus = genere, pyogenes = specie.

Escherichia Coli -> Escherichia = genere, Coli = specie.

STRUTTURA DELLA CELLULA BATTERICA E DEI SUOI COMPONENTI (FONDAMENTALI E

ACCESSORI) E LE LORO FUNZIONI:

La cellula batterica

I microrganismi sono organismi di dimensioni molto ridotte (1 micron), non sono visibili a occhio nudo ma

sono osservabili con il microscopio ottico. Ha forme diverse generalmente regolari per la presenza di parete

rigida (tranne i micoplasmi). In microbiologia il termine “morfologia” significa forma della cellula.

Tra i procarioti ci sono diverse morfologie:

1) Forma sferica o ovoidale: Cocchi = Diplococchi - Streptococchi (lunghe catene) - Stafilococchi

(irregolari a grappolo) - Sarcina (tridimensionali a cubo);

2) Forma cilindrica: Bastoncini o Bacilli = Streptobacilli – Cocco-bacilli - Vibrioni;

3) Forma spirale: Spirilli - Spirochete (spiraliformi);

4) Altre cellule di altre forme: Peduncolati (estrusioni a forma di lunghi tubi o peduncoli) - Filamenti con

ramificazioni - Filamentosi (lunghe e sottili o catene).

1)

2) 2

<- Vibrioni

3) <- Spirochete

4) <- Forme peduncolate

L'osservazione avviene in tre fasi attraverso il microscopio ottico:

1. Preparare uno striscio: depositare la coltura in uno strato sottile su un vetrino e asciugare all'aria;

2. Fissare con il calore e colorare: passare il vetrino sulla fiamma per fissare il campione; ricoprire il

vetrino con il colorante, risciacquare e asciugare;

3. Microscopio: osservazione.

Colonie batteriche = 1 colonia corrisponde a circa 10^6 cellule.

Prima di iniziare a spiegare della struttura della cellula batterica, apro una piccola parentesi per ricordare

bene quali distinzioni principali ci sono tra le cellule procarioti ed eucarioti: 3

Struttura della cellula batterica

- Fondamentali: cromosoma, citoplasma, membrana plasmatica, parete cellulare.

- Accessorie: capsula, appendici (flagelli, fimbrie/pili), plasmidi (materiale genetico accessorio).

SPIEGAZIONE DEI COMPONENTI FONDAMENTALI

Cromosoma

Rappresenta il corredo genetico essenziale della cellula batterica. È costituito da DNA bicatenario, a

disposizione circolare (esistono eccezioni), ed è generalmente unico (anche qui esistono eccezioni ad es.

brucelle e vibrioni hanno due cromosomi circolari). Il cromosoma è direttamente immerso nel citoplasma

(non esiste il nucleo delimitato da membrana) e tende a localizzarsi nel nucleotide.

Citoplasma

È una matrice costituita al 70% di acqua e contiene sali, zuccheri, aminoacidi, nucleotidi, vitamine, coenzimi

e altri composti solubili.

Contiene: cromosoma, sistemi enzimatici, ribosomi (70s); può contenere i plasmidi, granuli di materiale da

accumulo, detti corpi d’inclusione (es. poli-idrossibutirrato, glicogeno, polifosfati).

NON contiene a differenza delle cellule eucariotiche: organuli rivestiti da membrana (mitocondri, lisosomi,

apparato del Golgi).

(I ribosomi sono due: 70s = procarioti e 80s = eucarioti. Quelli da 70s sono composti di 50s e da 30s;

mentre quelli da 80s sono composti di 40s e da 60s).

Membrana citoplasmatica

È una struttura sottile, che circonda completamente la cellula. È una barriera che separa l'interno della

cellula cioè il citoplasma dall'ambiente ed è costituita da un doppio strato fosfolipidico (fosfolipidi ->

molecole anfipatiche).

-> testa = idrofila (glicerolo)

-> due code = idrofobe (acidi grassi)

Nella membrana plasmatica dei procarioti non sono presenti steroli (contribuiscono a stabilizzare la

membrana e renderla meno flessibile) ma molecole simili chiamate opanoidi. 4

È ricoperta da un rivestimento protettivo cioè dalla parete batterica.

Ha due funzioni: isola fisicamente la cellula e permette lo scambio di sostanze ed energia con l'esterno.

È una barriera di permeabilità, impedisce la dispersione di sostanze e funziona da controllo per il trasporto

delle varie sostanze. Inoltre è un sito di ancoraggio di molte proteine, coinvolte nel trasporto di

metaboliti/cataboliti.

Sono presenti le proteine di trasporto -> trasportano i soluti attraverso la membrana e hanno la funzione

di accumulare i soluti contro un gradiente di concentrazione.

I sistemi di trasporto della membrana

Si dividono in:

- Trasporto semplice = è controllato dall'energia associata alla forza Proton-motrice (stato energizzato

della membrana caratteristica per avanzamento di alcune funzioni cellulari che richiedono energia) e

utilizza solo una proteina di trasporto che attraversa lo spessore della membrana;

- Traslocazione di gruppo = è la modificazione chimica della sostanza trasportata, è controllata dal

fosfoenolpiruvato (P - composto organico ricco di energia);

- Sistema ABC = coinvolge tre elementi: una proteina che lega il substrato (1); un trasportatore integrato

nella membrana (2); e una proteina che utilizza l'ATP (3).

Trasportatori trans-membrana

Sono formati da dodici segmenti trans-membrana che procedono avanti e indietro nello spessore della

membrana formando un canale, e attraverso a esso un soluto è trasportato all'interno della cellula.

Esistono tre tipi di trasportatori trans-membrana:

1) Uniporter = trasportano una sostanza unidirezionalmente da un lato a un altro della membrana;

2) Antiporter = trasportano una sostanza in una direzione e un'altra nella direzione opposta.

3) Symporter = trasportano attraverso la membrana nella stessa direzione una sostanza insieme con

un'altra; 5

Proteine di membrana

Svolgono molte funzioni.

Possono essere: trasportatori (permeasi); enzimi coinvolti nella replica del cromosoma; enzimi deputati alla

secrezione di proteine (tossine o molecole coinvolte nella biosintesi di altre strutture cellulari come parete e

flagelli); proteine per il metabolismo energetico (vedi sotto); sensori per parametri ambientali (vedi sotto).

Proteine di membrana coinvolte nel metabolismo energetico

Nella cellula batterica l'energia è accumulata sotto forma di un gradiente protonico di membrana (forza

Proton-motrice). Il gradiente protonico di membrana è trasformato in ATP dal complesso ATPasi.

Proteine di membrana con sensori ambientali

La cellula batterica risponde agli stimoli esterni sfruttando le proteine di membrana.

Parete cellulare

È una struttura di rivestimento cellulare, e si trova all'esterno rispetto alla membrana. Inoltre conferisce alla

cellula forma e rigidità. È essenziale per proteggere la cellula dall'elevata pressione osmotica (in assenza di

parete la cellula batterica va incontro a lisi osmotica).

È la sede di antigeni che reagiscono con gli anticorpi ed è la sede di vari fattori di virulenza/patogenicità.

La componente principale della parete batterica è il PEPTIDOGLICANO (chiamata anche mureina, è una

molecola esclusiva dei batteri e non esiste nelle cellule eucariotiche). È un polisaccaride, un polimero rigido

costituito da zuccheri e proteine.

Ogni suo strato è una sottile lamina costituita da due amino zuccheri: il N-acetil glucosamina NAG e

l'acido N-acetil muranico NAM, e da pochi aminoacidi rappresentati da L-alanina, D-alanina, D-

glutammico e da L-lisina o dalla molecola strutturalmente simile all’acido diaminopimelico (DAP).

<- Componente glicanica

<- Struttura completa

<- Escherichia Coli 6

Questi componenti sono assemblati in modo da formare un'unità strutturale di ripetizione, il glican

tetrapeptide. Nella sottile lamina che costituisce la struttura di base del peptidoglicano le catene di glicano,

formate da zuccheri, sono tenute insieme da legami crociati peptidici tra aminoacidi.

Struttura

I batteri possono essere divisi in due gruppi principali: Gram-positivi e Gram-negativi.

Tale distinzione è dovuta alla presenza strutturale del peptidoglicano nella parete cellulare, che si presenta:

- Nei Gram-positivi (A): la parete è molto più spessa ed è costituita da un solo tipo di molecola (ha più strati

peptidoglicano -> 90%) e non contiene la membrana esterna;

- Nei Gram-negativi (B): invece è più complessa ed è costituita da un solo strato di peptidoglicano (10%) e

contiene la membrana esterna.

La colorazione di Gram (1884)

Attraverso la colorazione di Gram (colorazione differenziale) permette di individuare i batteri tra:

I Gram-positivi -> batteri colorati di blu-violetto;

I Gram-negativi -> batteri colorati di rosso.

Gram deriva dal nome del batteriologo danese che ha sviluppato la tecnica.

Si utilizza cristal violetto, soluzione iodo-odurata, decolorazione con alcool, eosina o safranina.

La spessa parete di peptidoglicano che avvolge i batteri Gram-positivi, cattura e trattiene il colorante cristal-

violetto, così che i batteri appaiono colorati di viola se sottoposti a colorazione di Gram.

Poiché i batteri Gram-negativi hanno molto meno peptidoglicano (che si trova tra la membrana plasmatica a

una membrana esterna) essi non trattengono il colorante cristal-violetto.

Per far risaltare meglio la differenza, si colorano i batteri con un colorante di contrasto (solitamente usata la

safranina) che rende rossi i Gram-negativi.

Perciò il diverso comportamento dei batteri nella colorazione di Gram dipende dalla diversa struttura della

parete batterica e il decolorante non riesce ad asportare il cristalvioletto dai batteri Gram-positivi (che

rimangono blu-violetto) mentre lo asporta dai batteri Gram-negativi (che quindi possono essere colorati di

rosso dalla safranina). 7

La parete dei micobatteri

È impermeabile a numerose sostanze per la presenza dello strato lipidico. Ha un’elevata resistenza ad

antibiotici, disinfettanti e difese naturali; inoltre ha una crescita lenta.

La colorazione di Ziehl-Neelsen

E’ un esame di laboratorio che consente di riconoscere la presenza dei micobatteri in un campione

sfruttando la caratteristica di alcool-acido, resistenza di tali microrganismi.

I micobatteri, per la struttura e composizione della parete cellulare, hanno la capacità di trattenere la

colorazione della fucsina basica di Ziehl anche quando trattati con decoloranti come l'alcool o gli acidi

minerali.

Metodo:

1. Colorazione con fucsina fenicata alla carta da filtro completamente bagnata (a caldo per 3-5 min.) ->

diventa rosso.

2. Decolorazione con la soluzione di alcool acidificato per due min. fino a quando non scompare il

colorante.

3. Eseguire la colorazione di contrasto con blu di metilene per 1-2 min. -> diventa blu.

I micobatteri, per la natura della loro parete ricca di lipidi, assumono il primo colorante e non sono

decolorati dall'alcool acidificato. Per questo motivo sono detti anche ACIDO ALCOOL RESISTENTI.

Gram-positivi

Adesso parleremo della parete dei batteri :

Oltre il 90% della parete cellulare dei Gram-positivi è composta appunto da peptidoglicano e hanno diverse

lamine di peptidoglicano impilate l’una sull’altra.

Si pensa che il peptidoglicano sia sintetizzato dalla cellula in forma di “cavi” di diametro di circa cinquanta

nm, dove ciascun cavo contiene diverse catene glicaniche tenute insieme da legami crociati.

Molti batteri hanno molecole acidiche, chiamate acidi teicoici, inseriti nella parete cellulare. Il termine “acidi

teicoici” include tutti i polimeri della parete cellulare, della membrana citoplasmatica e della capsula

costituiti da glicerolfosfato o ribitolfosfato. Questi polialcoli sono legati da esteri fosfati e contengono

zuccheri o D-alanina. Gli acidi teicoici sono legati covalentemente all’acido muramico nel peptidoglicano.

Gli acidi teicoici svolgono la funzione di legare gli ioni Ca2+ e Mg2+ per il loro trasporto all’interno della

cellula. Alcuni acidi teicoici sono legati covalentemente ai lipidi di membrana e sono chiamati in questo

caso acidi lipoteicoici. 8

<- Acido glicerol-teicoico <- Acido ribitol-teicoico

Le proteine di parete possono formare strutture fibrillari che sporgono dalla parete verso l’esterno.

Le fibrille di proteina M servono per l’ancoraggio delle cellule batteriche alla mucosa della faringe (adesine).

Gram-negativi

Parete dei batteri :

Il peptidoglicano costituisce solo una piccola frazione dell’intera parete cellulare e per la maggior parte

invece è costituita dalla membrana esterna. Il doppio strato lipidico non è costituito solo da fosfolipidi e

proteine, come la membrana citoplasmatica. Contiene anche un glicolipide complesso, il lipopolisaccaride

(LPS, endotossina) localizzato nel foglietto esterno della membrana esterna.

Si tratta di una grande molecola costituita da una porzione lipidica e una polisaccaridica in grado di

suscitare forti risposte immunitarie negli animali.

I LPS sono costituiti da tre regioni principali: lipide A ovvero la porzione glicolipidica, un core polisaccaridico

e il polisaccaride O-specifico.

Il polisaccaride O-specifico, detto anche catena laterale, è costituito da una ripetizione di 20-50 unità che

compongono 4-8 zuccheri comuni (galattosio, glucosio, ramnosio e mannosio (esosi a sei atomi di

carbonio), e uno o più dideossiesosi, quali abequosio, colitosio, paratosio o tivelosio) ed è legato

covalentemente al core. Questi zuc