Appunti di Microbiologia

Microbiologia

Introduzione

La microbiologia è la scienza che studia i microorganismi. Il primo ad individuare forme di vita unicellulari fu Robert Hooke nei funghi. Successivamente vennero scoperti batteri, virus e altri. Si stima che i microorganismi compongano circa la metà della biomassa terrestre. Inoltre, essi sono i primi organismi viventi, comparsi sulla terra circa 3,5 miliardi di anni fa, e per questo hanno subito un processo evolutivo molto lungo che li ha portati a differenziarsi molte volte. Essi vivono in qualsiasi tipo di ambiente e anche in ambienti estremi per l’uomo. Sono sempre presenti nella nostra vita e permettono la sopravvivenza sia dell’uomo che dell’intera biosfera. Inoltre, vengono spesso usati come modelli per la comprensione del funzionamento cellulare degli organismi cellulari. L’ordine di comparsa dei vari microorganismi è il seguente:

La maggior parte delle prove sull’esistenza di microorganismi molto tempo prima della comparsa dell’uomo si trova all’interno di stromatoliti fossili, ossia “rocce” formatesi stratificando nel tempo e combinandosi con microorganismi. Anche adesso vi sono stromatoliti in formazione soprattutto vicino al mare, pertanto è possibile analizzarli al microscopio elettronico osservando una struttura rocciosa che stratifica attorno a dei microorganismi.

Microambienti

All’interno di un dato ambiente è possibile distinguere molti microambienti in base alla variazione di sostanze che vi è tra essi. Ogni microambiente presenta le condizioni ottimali per la crescita di un dato microorganismo. Di conseguenza, all’interno di un determinato ambiente (che può essere anche solo 31 cm di terra) si trovano molti microorganismi diversi, poiché ognuno colonizza il microambiente più congeniale alla sua crescita.

Le biotecnologie che si basano sui microorganismi sono dette biotecnologie microbiche e spaziano in tutti i campi delle biotecnologie eccetto le biotecnologie mediche. Tra esse rientrano gli insetticidi (basati su un batterio che uccide gli insetti), biotecnologie che sfruttano microorganismi per incrementare la crescita di certe piante e biotecnologie in cui vengono usati microorganismi per smaltire l'inquinamento e le sostanze inquinanti.

Batteri, archaea e miceti

I microorganismi cellulari sono batteri, archeabatteri e miceti (esistono anche microorganismi non cellulari, come i virus). Una prima classificazione degli organismi viventi sulla base delle caratteristiche macroscopiche viene fatta da Whittaker nel 1950: egli li suddivide in 5 regni: animali, piante, funghi, protisti e monere. Dopodiché, Woese crea una nuova classificazione usando metodi molecolari: batteri, archeabatteri ed eucarioti. Questa classificazione si basava sullo studio di geni particolari chiamati orologio molecolare, tramite i quali si scoprì l’esistenza di un progenitore comune per ogni dominio. Dallo studio dell’orologio molecolare venne anche elaborato un albero della vita:

Come si può vedere da questo albero, c’è stato un progenitore comune per tutti e tre i domini, il quale si è poi differenziato sempre più fino alle specie odierne. È inoltre possibile vedere che gli archeabatteri si sono differenziati a partire da un progenitore in comune con gli eucarioti e quindi, sebbene rimangano dei procarioti, hanno caratteristiche simili agli eucarioti.

I microorganismi sono sia procarioti (batteri ed archeabatteri) sia eucarioti (miceti, alghe e protozoi). La caratteristica comune a tutti i microorganismi è che nessuno ha una differenziazione in tessuti, sono tutte cellule non necessariamente isolate ma potenzialmente autosufficienti. Nei microorganismi si nota sempre la differenza tra procarioti ed eucarioti (dimensioni, presenza del nucleo, suddivisione in organelli e metodi di riproduzione).

Morfologia dei procarioti

Solitamente la forma della cellula procariote è caratteristica e costante per ogni specie, inoltre alcune specie presentano delle forme di aggregazione tipiche. Vi sono poi eccezioni come specie prive di parete (e quindi senza una forma ben definita) e specie che hanno una morfologia variabile. Le forme più comuni sono le seguenti:

• Cocchi: hanno forma sferica, possono esistere singolarmente o formare degli aggregati. Se formano aggregati a coppie si dicono diplococchi, a gruppi di 4 tetradi, in gruppi di 8 a cubo sarcina, a catenelle streptococco e a grappolo staphylococchi. La forma dell’aggregato dipende dalle direzioni prese dalle cellule dopo la divisione cellulare.
• Bastoncini: anche questi si possono trovare in aggregati a coppia, catena (streptobacillo) o palizzata (affiancati sul lato lungo).

Tra le forme irregolari più importanti vi sono invece gli attinomiceti, ossia batteri con una forma “ramificata” molto simile a quella dei miceti. La peculiarità di questi batteri è che quando colonizzano un substrato producono miceli che fuoriescono da esso ed entrano in contatto con l’atmosfera, e miceli che rimangono sommersi nel substrato a diretto contatto con il nutrimento. Altre forme particolari si riscontrano in Haloquadratum Walsby, batterio di forma quadrata (forma atipica nel mondo della biologia in cui si tende alla sfera), vi sono poi myxobatteri che formano corpi fruttiferi e infine vi sono i cianobatteri che quando sono aggregati hanno una forma filamentosa ma interrotta da cellule differenziate dette eterocisti in grado di usare l’azoto dell’ambiente per produrre ammonio passarlo agli altri cianobatteri.

Un’altra eccezione è data dal pleomorfismo, ossia la possibilità per alcuni microorganismi di presentare più di una morfologia. Tra le eccezioni vi sono poi anche batteri che presentano nucleo e batteri detti solfobatteri giganti perché usano come fonte di energia HS- e sono grandi fino ai 750 micrometri (quasi visibili ad occhio nudo).

Membrana citoplasmatica

La membrana citoplasmatica è un doppio strato fosfolipidico di circa 8 nm il cui compito è quello di racchiudere il citoplasma con organelli, ribosomi e materiale nucleare ed ha anche il compito di permettere o meno il passaggio di sostanze (si dice quindi che è una barriera altamente selettiva). Nei microorganismi è spesso avvolta dalla parete cellulare.

Attraverso la membrana citoplasmatica possono avvenire più meccanismi di trasporto: diffusione passiva (secondo gradiente), diffusione facilitata (secondo gradiente mediante permeasi), trasporto attivo (contro gradiente) e traslocazione di gruppo.

Sulla membrana avvengono inoltre importanti attività metaboliche quali le tappe terminali della sintesi dei lipidi di membrana, catena di trasporto degli elettroni, in alcuni batteri avviene la fotosintesi, vi è la sede di attacco dei flagelli e l'aggancio del DNA ai mesosomi durante la sua duplicazione e infine la membrana serve a formare il setto trasverso a fine mitosi per dividere in due la cellula.

La membrana è formata da un doppio strato di fosfolipidi che puntano le teste idrofiliche all’esterno e le code idrofobiche all’interno, inoltre negli eucarioti la fluidità è data dal colesterolo mentre nei batteri è data dal diplotene (un opanoide). Vi è una differenza nei fosfolipidi dei batteri e degli archaea, infatti quelli degli archaea presentano catene di acidi grassi ramificate e formano un legame etere e non estere con il glicerolo.

Oltre ai lipidi vi sono inoltre proteine di membrana, le quali possono essere lipoproteine, proteine transmembrana e proteine periferiche.

Sistemi di trasporto della membrana

• Diffusione semplice: non richiede né proteine né energia, piccole molecole vengono fatte passare attraverso la membrana per osmosi secondo gradiente di concentrazione (se la soluzione è ipotonica rispetto alla cellula, quindi a concentrazione più bassa, l’acqua o gas tende ad entrare nella cellula, se è ipertonica esce dalla cellula).
• Diffusione facilitata: avviene secondo gradiente senza uso di energia ma attraverso proteine di membrana, poiché vengono trasportate molecole più grandi.
• Sistema Symporter: sfrutta il gradiente elettrico della membrana (positivo all'esterno e negativo all’interno) per trasportare molecole attraverso una proteina sfruttando la sua carica elettrica o quella di un’altra molecola.
• Trasporto attivo: consuma energia per trasportare molecole contro gradiente.
• Traslocazione di gruppo: viene idrolizzato il legame con il gruppo fosfato del fosfoenolpiruvato per liberare energia e fosforilare il glucosio, il quale è così in grado di passare attraverso una proteina dall’esterno all’interno della cellula.
• Sistema ABC: vi è una proteina interna che idrolizza ATP per fornire energia allo spostamento, poi la proteina periplasmica va a legarsi con la molecola e in tal modo essa è in grado di attraversare la proteina di membrana entrando nella cellula.

Parete cellulare

È il rivestimento più esterno della cellula batterica. Conferisce forma e resistenza alla lisi osmotica ai batteri. In base alla parete batterica i batteri si dividono in gram positivi, con una parete più spessa tra i 10 e gli 80 nm, e gram negativi, con una parete più sottile tra i 10 e i 30 nm ma pluristratificata. Questo nome deriva dalla tecnica della colorazione di Gram, ossia una tecnica che permette di colorare la parete batterica la quale diventa viola per i gram+ e rosa per i gram-.

La parete batterica è formata da mureine o peptidoglicano. Il peptidoglicano è composto dagli zuccheri acido N-acetilmuramico e N-acetilglucosammina uniti da un legame β-1,4 glicosidico. La struttura rigida è poi data dal legame crociato tra i peptidoglicani, il quale è formato da pentaglicina per i gram+ ed è diretto per i gram-.

Inoltre, nei gram+ ci sono più strati di peptidoglicano che vanno a ricoprire il 40-50% della parete batterica, nei gram- vi è un solo strato che ricopre sol il 5-15%. Gli archeabatteri non hanno peptidoglicano ma delle pseudomureine.

Solo i gram+ oltre al peptidoglicano presentano acidi teicoici e acidi lipoteicoici, ossia polimeri del glicerolo o del ribitolo legati da gruppi fosfato (i lipoteicoici arrivano a legarsi ai lipidi di membrana), e gli acidi micolici, presenti solo in alcuni gram+, sono acidi grassi con una lunga catena legati ai polisaccaridi della parete con dei ponti estere.

Per tutti i batteri vi è poi uno spazio periplasmatico, ossia uno spazio che separa la membrana plasmatica dalla parete cellulare e in esso hanno sede alcuni enzimi idrolitici, proteine di trasporto e recettori per gli stimoli.

Nei gram+ la parete cellulare si presenta come molti strati di peptidoglicano sovrapposti, mentre nei gram- la parete cellulare è composta da uno strato di peptidoglicano e sopra un doppio strato fosfolipidico.

La parete esterna dei gram- fa quindi da “envelope” con vari ruoli: strutturale, esclude proteine e antibiotici dannosi, ha una permeabilità selettiva, gestisce l’esportazione di sostanze, è sede di recettori ed ha il compito principale di interazione con l’ambiente. Sulla membrana esterna dei gram- è inoltre molto importante la presenza di un lipopolisaccaride il cui compito è quello di attività endotossica che causa i sintomi della febbre quando viene riconosciuto dagli anticorpi. Questo lipopolisaccaride è formato da una porzione lipidica detta lipide A, un core centrale formato da un oligosaccaride e un antigene O dato da una catena laterale di 20-50 zuccheri (è la parte riconosciuta dal sistema immunitario).

Molti batteri oltre alla parete cellulare possiedono un’ultima ricopertura esterna chiamata s-layer, ossia un rivestimento proteico costituito da un solo strato di proteine monomeriche spaziate tra di loro regolarmente. Spesso queste proteine sono glicosilate. Ha varie funzioni tra cui l’interazione con i recettori esterni tramite la quale può anche andare ad impedire la predazione del batterio, aiuta la divisione cellulare, è responsabile del movimento di “swimming” (scivolamento) del batterio nell’ambiente e aiuta anche nella formazione di aggregati.

Rottura della parete: rompere la parete batterica di un microorganismo può rivelarsi molto utile per recuperare materiale cellulare o per poter sviluppare certi tipi di biotecnologie. Spesso rompere la parete cellulare porta anche alla formazione di forme L, ossia microorganismi che presentano forme irregolari poiché senza parete ma conservano le loro resistenze. I metodi per rompere la parete sono l’uso di ultrasuoni, sottoporre il batterio a pressioni elevate, uso di tensioattivi che sciolgono la parete, uso di enzimi quali il lisozima che idrolizza il legame β-1,4 glicosidico o proteinasi che degradano le proteine, e infine l’uso di antibiotici.

Capsula: oltre alla parete cellulare alcuni batteri sono in grado di produrre un ulteriore rivestimento esterno che viene detto capsula. Essa è un rivestimento di esopolimeri (polisaccaridi, proteine o entrambi) a bassa densità e spessore variabile. Non è indispensabile alla vita della cellula e non viene prodotta da tutti i batteri, inoltre la capacità di produrre una capsula può essere persa in seguito ad una mutazione. Le funzioni della capsula sono la protezione dalla fagocitosi (predazione), protezione dall’essiccamento del batterio, può essere usata come sostanza di riserva, favorisce l’adesione del batterio alle pareti e spesso la virulenza di un batterio dipende dalla presenza della capsula (batteri S smooth) o assenza di essa (batteri R rough).

Colorazione di Gram

La differenziazione della parete cellulare in gram+ e gram- deriva dalla colorazione di Gram, ossia una colorazione della parete che visualizza in modo diverso i due tipi di batteri al microscopio. Nell’albero della vita archeabatteri e gram+ vengono classificati negli organismi con una parete monodermica, in quanto possiede solo uno strato omogeneo di peptidoglicano, mentre i gram- hanno una parete didermica, poiché hanno una parete pluristratificata. La colorazione di Gram permette di visualizzare quali batteri hanno un determinato tipo di membrana.

Meccanismo della colorazione: vengono fissate le cellule su un vetrino, poi viene aggiunto il cristal-violetto che le colora di blu e si attende qualche minuto. Il colorante viene poi fissato con un trattamento che contiene iodio e potassio e poi viene decolorato tutto con l’alcool e ricolorato con la safranina. Guardando poi al microscopio si vedranno i gram+ viola e i gram- rosa.

Il motivo per cui i gram+ risultano viola, è che essi presentano una parete ricca di peptidoglicano, il quale è in grado di trattenere il colorante anche in seguito al lavaggio con l’alcool; invece, i gram- hanno molto meno peptidoglicano, pertanto non riescono a trattenere il colorante quanto i gram+ e presentano quindi una tonalità più chiara.

Appendici

Buona parte dei batteri è in grado di muoversi nello spazio grazie all’uso di appendici, ossia strutture proteiche che sporgono dalla cellula e la fanno muovere in risposta a determinati stimoli. I principali addetti al movimento sono i flagelli, ossia filamenti elicoidali lunghi anche 10 volte il diametro della cellula e ancorati alla membrana grazie ad una struttura a dischi che fa da uncino. Essi sono dei rotori elicoidali semirigidi che sfruttano la forza protomotrice data dalla cellula per muoversi in senso orario o antiorario. I flagelli si dividono in due tipi:

• Peritrichi: ci sono più flagelli attorno alla cellula, pertanto durante il movimento tutti i flagelli si orientano nella stessa direzione e seguono lo stesso giro di rotazione, mentre quando la cellula si ferma i flagelli si dispongono attorno ad essa e sono in grado di orientarla molto velocemente per poi riprendere il movimento.
• Polari: la cellula ha un singolo flagello, pertanto si muove in un verso se il flagello si muove in senso orario, o nel verso opposto se si muove in senso antiorario. La cellula quindi si muove più a scatti poiché per curvare ha bisogno di fermarsi e orientarsi da sola (senza l’aiuto dei flagelli come sopra).

Il movimento dei flagelli dipende sempre dalla risposta tattica che danno in seguito ad uno stimolo esterno. Lo stimolo esterno può essere di natura sia chimica che fisica ed in base ad esso si parla di: chemiotassia, segue il gradiente chimico, aerotassia, segue il gradiente di O₂, fototassia, segue il gradiente di intensità luminosa, e magnetotassi, secondo il campo magnetico terrestre. Il movimento può essere inoltre positivo se il microorganismo si avvicina ad una fonte di nutrimento, o negativo se si allontana da un ambiente per lui tossico.

Altre appendici sono i pili o fimbrie, delle appendici filiformi cave formate da fimbrie, in grado di connettere due cellule diverse. Hanno ruolo nell’adesione tra due cellule e nella coniugazione. In particolare, in quest’ultima si ha la formazione di un ponte citoplasmatico grazie al pilo F, tramite il quale una cellula donatrice può trasferire materiale genetico ad un batterio ricevente. Oltre al materiale genetico la cellula donatrice trasferisce anche la capacità di formare il pilo F.

Citoplasma e organelli

Il citoplasma di ogni cellula è molto ricco di organelli, sostanze di riserva, nucleotidi e DNA, proteine, ribosomi, nutrienti e sostanze di scarto. Poiché i microrganismi sono procarioti, risultano molto meno organizzati rispetto agli eucarioti. Tutte le cellule tendono comunque a conservare sostanze di riserva sotto forma di inclusioni cellulari che possono essere visibili al microscopio.