Appunti di microbiologia

Appunti di Claudia Tropea

Appunti di MICROBIOLOGIA

tratti dalle lezioni e dalle slide dell’anno 2016-2017

delle professoresse

TAVANTI e BOTTAI

del corso di studi di SCIENZE BIOLOGICHE

dell’Università di Pisa

Claudia Tropea

INDICE: 1

Appunti di Claudia Tropea

Introduzione alla microbiologia  pag. 3

Classificazione dei batteri  pag. 5

Cellula batterica  pag. 6

Parete batterica  pag. 8

Flagello, pili e chemiotassi  pag. 14

Sistemi di trasporto  pag. 17

Membrana cellulare  pag. 19

Capsula e protoplasto  pag. 20

Spora  pag. 22

Nutrizione microbica  pag. 23

Crescita batterica  pag. 25

Genetica batterica  pag. 29

Metabolismo  pag. 32

Virus  pag. 33

Miceti  pag. 38

Interazione ospite-parassita  pag. 40

Streptococchi, Neisseria, Salmonella  pag. 42-44-46

Antimicrobici  pag. 50 Laboratorio  pag. 54

INTRODUZIONE ALLA MICROBIOLOGIA 2

Appunti di Claudia Tropea

La microbiologia è lo studio dei microrganismi, ovvero degli organismi

invisibili ad occhio nudo. Essa si basa sull’osservazione, che ebbe inizio nel

1677 grazie al lavoro di Van Leeuwenhoek. Egli osservò per primo i

microrganismi a vita autonoma tramite dei microscopi semplici.

Nel 1765 Lazzaro Spallanzani confutò la teoria della generazione spontanea

(secondo la quale gli organismi si generano naturalmente da composti

organici in putrefazione) tramite questo esperimento:

1. Bollì dei brodi di carne in fiasche di vetro;

2. Le fiasche sigillate non divenivano torbide;

3. Le fiasche aperte divenivano torbide per la presenza di microrganismi.

Giunse alla conclusione che la crescita microbica era causata da

contaminazione esterna (tramite l’aria) e non si generasse spontaneamente

dalla carne.

Questi esperimenti però non furono ritenuti validi: molti sostenevano che la

vita non si generasse nelle fiasche sigillate solo perché in queste ultime

mancava l’ossigeno.

Questo problema fu risolto da Pasteur nel 1864. Egli utilizzò una fiasca di

vetro dal collo contorto. In essa versò del brodo e lo fece poi bollire,

sterilizzandolo. La fiasca era aperta, quindi l’ossigeno entrava. Tuttavia, i

microrganismi provenienti dall’esterno restavano intrappolati nel collo

contorto e non riuscivano a raggiungere il liquido, che restava limpido.

Altre date importanti: 3

Appunti di Claudia Tropea

1878: Koch dimostra l’eziologia microbica di una malattia contagiosa, il

carbonchio (causato dal Bacillus anthracis).

1. Prelevò sangue da un animale infetto;

2. Seminò il sangue infetto in brodo (coltura monomicrobica);

3. Inoculò il brodo in un animale sano;

4. L’animale sano si ammalava;

5. Prelevò sangue da quest’ultimo;

6. Isolò nuovamente il microrganismo in vitro (per dimostrare che tutti gli

individui malati dovevano possedere l’agente eziologico).

Questi punti sono definiti “postulati di Koch”. Esponendo il B. anthracis a 44

gradi, esso perdeva la capsula e quindi la sua virulenza -> vaccino anti

carbonchio.

1877: Tyndall aveva osservato crescita batterica anche negli infusi fatti bollire

a 100 gradi centigradi, capì quindi che esistevano alcuni batteri

termoresistenti;

1877: Cohn dimostrò la teoria di Tyndall osservando che il Bacillus subtilis

era in grado di differenziarsi in spore termoresistenti. 4

Appunti di Claudia Tropea

CLASSIFICAZIONE DEI BATTERI

I batteri sono microrganismi unicellulari procarioti, le cui dimensioni possono variare da 0,2

micrometri a 30 micron.

La classificazione dei viventi di Woese del 1977 riconosce tre regni: Bacteria,

Archea e Eucarya.

I procarioti si dividono in archebatteri ed eubatteri.

Archebatteri: poche specie conosciute. Sopravvivono ad ambienti estremi, si

riproducono solo asessualmente, sono più simili agli eucarioti e considerati

“antenati” di questi ultimi. Tra loro vi sono i termoacidofili (vivono a

temperature e livelli di pH estremi, sono anaerobi [non richiedono O2] ma

richiedono zolfo), i metanogeni (anaerobi, producono metano, spesso vivono

nell’intestino dei mammiferi) e gli alofili estremi (vivono in ambienti ad alta

salinità, aerobi, gram negativi).

Eubatteri: procarioti, unicellulari, più di 4000 specie. Si riproducono per

scissione e coniugazione, sono soprattutto eterotrofi ma alcuni fotosintetici.

Tra loro vi sono: i Cianobatteri (fotosintetici, probabili antenati dei cloroplasti

nei protisti); chemioautotrofi (vivono senza luce solare, ricavano energia dai

gas ridotti, comprendono i solfobatteri), enterobatteri (es. E. coli, di solito

bastoncellari e flagellati, eterotrofi, aerobi o anaerobi, molti causano malattie

negli animali, altri vivono in simbiosi con essi), spirochete (es. Borrelia;

lunghe cellule a spirale con flagelli alle estremità, possono causare malattie),

actinomiceti (es. Mycobacterium tubercolosis, filamentosi, spesso scambiati

per funghi, producono spore e antibiotici come le tetracicline, la streptomicina

e il cloramfenicolo, possono causare malattie come la tubercolosi), e altri. 5

Appunti di Claudia Tropea

CELLULA BATTERICA

La caratteristica principale della cellula procariotica è quella di non possedere

una divisione in compartimenti interna. Il materiale genetico non si trova

quindi nel nucleo ma in una regione del citoplasma detta nucleoide. Molti ruoli

che nella cellula eucarioti a sono svolti dagli organuli, nella cellula

procariotica sono svolti dalla membrana (che avrà quindi una composizione

peculiare). Sono tuttavia presenti i ribosomi, sebbene di dimensioni inferiori a

quelli eucariotici (70 S contro 80 S).

Le varie specie batteriche possono essere classificate in base alla forma

della cellula. In particolare, distinguiamo i cocchi e i bastoncelli.

I COCCHI

Sono batteri gram positivi, hanno una caratteristica forma a chicco di caffè.

Non presentano motilità. In base alla disposizione che assumono in seguito

alla scissione, si dividono in:

- 1 asse di divisione:

A. Diplococchi: se si dispongono a coppie (Streptococcus pneumoniae);

B. Streptococchi: se si dispongono a catenelle (S. pyogenes);

- 2 assi di divisione perpendicolari:

A. Tetradi di 4 cellule su un unico piano;

B. Cellule disposte a formare fogli monostratificati;

- 3 assi di divisione perpendicolari: Sarcine (cubi di 8 cellule);

- Assi casuali irregolari: stafilococchi (grappoli).

I BACILLI

Di forma bastoncellare. Caratteri morfologici assunti come criteri tassonomici

sono: caratteristiche tintoriali, dimensioni, lunghezza, spessore, presenza e

disposizione della spora nello sporangio, e la motilità-flagello mediata. 6

Appunti di Claudia Tropea senza spora

con spora terminale deformante

TASSONOMIA

La tassonomia convenzionale si basa su caratteristiche fenotipiche. L’unità

tassonomica fondamentale è la SPECIE:

“Una specie batterica è definita come un insieme di CEPPI (i singoli isolati)

che condividono un determinato fenotipo (determinato dal loro genotipo), che

si mantiene stabile ed è diverso da quello che caratterizza altri insiemi di

ceppi”

Le caratteristiche fenotipiche da prendere in considerazione per valutare la

specie di un batterio sono criteri discriminativi STABILI, evidenziabili tramite

saggi che siano ALTAMENTE RIPRODUCIBILI, di FACILE ESECUZIONE ed

UNIVOCA INTERPRETAZIONE:

> Morfologia cellulare, compresa la presenza di spore

> Caratteristiche tintoriali

> Motilità

> Forma della colonia

> Tipo di metabolismo

> Suscettibilità ad antibatterici

> Habitat

> Sequenze geno-specifiche.

Le caratteristiche che invece permettono di valutarne il tipo (ovvero le

differenze intra-specifiche) si osservano tramite:

> sierotipizzazione (sierotipo)

> biotipizzazione (biotipo) 7

Appunti di Claudia Tropea

> tipo della colonia (morfotipo)

> genotipizzazione sequenze geno-tipiche

PARETE BATTERICA

Caratteristica presente solo nelle cellule procariotiche, conferisce resistenza

e protezione, può essere un fattore di virulenza. Protegge soprattutto dalla lisi

osmotica.

Determina la suddivisione dei batteri in Gram + e gram -, in quanto ha

struttura diversa. Tuttavia sia i + che i - possiedono il sacculo, ovvero una

macromolecola detta anche mureina costituita da peptidoglicani.

La mureina può essere degradata dalla lisozima. Le cellule ottenute

sottoponendo batteri gram + alla lisozima si chiamano PROTOPLASTI, quelle

ottenute dai gram – SFEROPLASTI (a differenza dei primi, hanno la

membrana esterna).

PEPTIDOGLICANI

I peptidoglicani sono molecole costituite da unità disaccaridiche che si

ripetono, legate da ponti amminoacidici. I disaccaridi in questione sono N-

acetilglucosammina (NAG) e acido N-acetilmuramico (NAM), legati da legami

beta 1-4. 8

Appunti di Claudia Tropea

Il NAM differisce dal NAG perché possiede un residuo di acido lattico. A

quest'ultimo si lega un tetrapeptide (L-Ala, acido D-glutammico, L-lisina, D-

Ala). Gli aminoacidi D sono presenti solo nella parete poiché conferiscono

resistenza alla proteasi. L'insieme di NAG-NAM-tetrapeptide costituisce

l'unità base della mureina.

SINTESI DEL PEPTIDOGLICANO

Si divide in 3 fasi:

Sintesi dei precursori , nel citoplasma: i precursori sono UDP-

1.

NAM-pentapeptide (‘penta’ piuttosto che ‘tetra’ perché inizialmente ci

sono due D-Ala terminali) e UDP-NAG. Il primo si forma grazie agli

enzimi MurA e MurB in presenza di PEP (fosfoenol-piruvato), il secondo

deriva dal fruttosio 6P e dall'UTP.

Trasporto all'esterno , nella membrana citoplasmatica: il NAM lega

2.

il bactoprenolo, un trasportatore lipidico idrofobico, andando a formare il

lipide 1. Poi si lega anche il NAG e si ottiene il lipide 2. A questo punto il

bactoprenolo trasporta questo complesso dall'altra parte della membrana

e lo rilascia, poi viene defosforilato e torna ad affacciarsi sul citoplasma

per essere riutilizzato.

Polimerizzazione , sul versante esterno: il complesso neo-

3.

sintetizzato deve legarsi alla catena già esistente. Perciò avviene la

reazione di transpeptidazione: nei gram - il legame tra le ultime due D-

Ala si rompe e si trasferisce al gruppo amminico dell'adiacente L-lisina,

formando così dei legami crociati, diretti; nei gram + il legame è mediato

da aminoacidi (ponte interpeptidico, indiretto).

PARETE NEI GRAM +: 9

Appunti di Claudia Tropea

Il peptidoglicano è spesso e fitto (40% del peso secco della cellula), è

separato dalla membrana cellulare da uno spazio periplasmatico (20 nm).

Nella parete vi sono intercalati acidi teicoici e teicuronici che hanno carica

negativa stabilizzante e funzione antigenica. Sensibile a lisozima e penicillina.

- Acidi teicoci: polimeri anionici costituiti da unita ripetute 1,3 glicerol fosfato

̀

o 1,5 ribitol-fosfato legati da legami fosfodiesterici (lipoteicoici se legati a lipidi

e se prendono contatto con la membrana plasmatica);

- Acidi teicuronici: polimeri privi di fosforo contenenti N-acetil-galattosammina

e acido D- glucoronico in uguale proporzioni.

PARETE NEI GRAM -: 10

Appunti di Claudia Tropea

al di là della membrana cellulare vi è uno spazio periplasmatico, poi un sottile

strato di peptidoglicano, poi ancora spazio periplasmatico e infine la

membrana esterna (LPS), peculiare dei gram -.

-Nello spazio periplasmatico abbiamo proteine periplasmatiche che hanno

diverse funzioni: assunzione nutrienti, produzione energia, ripiegamento

proteine, degradazione antibiotici, biogenesi della membrana esterna. Ad

esempio Skp regola la traslocazione delle proteine, SurA le consegna a

complessi proteici che a sua volta le trasporteranno.

-Le porine sono complessi proteici omotrimerici costituiti da proteine a botte

(beta barrel) intercalate nella membrana. Esse permettono il passaggio di

nutrienti, in generale molecole di piccole dimensioni, ma anche degli

antibiotici. In risposta il batterio può ridurre l'espressione genica delle porine,

oppure sostituire gli aminoacidi neutri che le costituiscono con aminoacidi

carichi che occludono il passaggio dell'antibiotico. Inoltre le porine fungono

da recettori e mediano l'adesione ad altre cellule.

-Il lipopolisaccaride (LPS) è un ulteriore rivestimento del batterio che spesso

costituisce un fattore di virulenza. Esso si può dividere in porzioni che,

dall'esterno verso l'interno, sono:

l'antigene O: antigene di natura polisaccaridica che stimola la

1.

risposta immunitaria, in particolare interagisce con i macrofagi.

Il core: polisaccaridico. Si divide in interno (conservato) ed

2.

esterno (varia da microrganismo a microrganismo). Quello interno è

costituito da eptosio e KDO (2-cheto-3-deossiottonato), quello esterno da

eptosi e esosi. Ha una carica superficiale negativa che reagisce con i

cationi bivalenti e può essere un altro fattore di virulenza.

Il lipide A: il fattore patogeno vero e proprio. Costituito da un

3.

dimero di NAG esterificato con due gruppi fosfato e un numero variabile

di acidi grassi.

L'LPS è un'endotossina secreta ad esempio in grandi quantità dalla Neisseria

meningitidis. Questi sono gli effetti in caso di:

Piccole quantità di endotossina: nella norma gli antigeni sono proteici e

•

richiamano i linfociti T, che a loro volta incitano i linfociti B ad attaccare 11

Appunti di Claudia Tropea

ed a specializzarsi in cellule della memoria. Ma in questo caso gli

antigeni sono lipidici e questo scatena una risposta immunitaria più forte

senza produzione di cellule della memoria. Inoltre, tramite produzione di

IL1, vengono stimolati i macrofagi a produrre interleuchine, causa del

rialzo febbrile.

Grandi quantità di endotossina: alterazione della funzionalità degli

•

organi, shock, coagulazione intravasale (N. meningitidis).

Trasporto dei componenti della membrana esterna: i precursori del lipide A,

del core e dell'antigene O vengono trasportati al di fuori della membrana

interna dal sistema di trasporto ABC. Successivamente sono trasportati a

quella esterna dal complesso proteico LptBGFC (LptA lo consegna a LptD e

LptE che lo consegnano alla M.E.).

Trasporto delle proteine della M.E. : sono riconosciute per via di una

sequenza segnale amino-terminale. Sono catturate dalla chaperonina Skp

che previene il ripiegamento e le consegna a SurA, che le ripiega e consegna

ad un complesso proteico che le inserisce nella ME. Le lipoproteine invece

sono catturate da LolA, passate a LolB e consegnate alla membrana.

CRESCITA DEL BATTERIO: con la crescita del batterio, anche il

peptidoglicano deve accrescersi. Ciò è possibile grazie alle autolisine, enzimi

idrolitici:

- Muramidasi e transglicosilasi litiche: tagliano il legame b 1-4;

- Amidasi taglia il legame tra NAM e L-Ala

- Endopeptidasi tagliano i legami peptidici

- Carbossipeptidasi rimuovono l'ultima D-Ala.

Questi enzimi sono utilizzati anche durante la divisione cellulare: 12

Appunti di Claudia Tropea

- I batteri coccoidi sintetizzano la nuova parete solo nel caso di scissione e

quindi lungo l'asse di divisione, così le cellule figlie avranno un emisfero

costituito da peptidoglicano nuovo e l'altro vecchio;

- I batteri bastoncellari hanno una fase di allungamento in cui il

peptidoglicano si forma in zone sparse della cellula (esclusi i poli) e poi, prima

della divisione, si ha un allungamento FtsZ-dipendente e la sintesi di

peptidoglicano si concentra lungo l'anello di divisione.

Pochi batteri bastoncellari (Corynebacterium) non hanno la MreB (vedi

capitolo protoplasto) e di conseguenza hanno un iniziale allungamento che

coinvolge i poli, per poi dividersi lungo l'asse centrale.

PARETE DEI MICOBATTERI

I micobatteri hanno una parete differente, costituita da due strati:

Strato basale: peptidoglicano e arabinogalattano;

1. Strato esterno: uno strato di acidi micolici e uno di cere.

2. 13

Appunti di Claudia Tropea

La CLAMIDIA: priva di parete. Il peptidoglicano è sostituito da proteine ricche

di cisteina, esternamente è rivestita da LPS e proteine MOMP (come porine).

Si presenta come corpo elementare, di piccole dimensioni. Penetra la cellula

ospite e sfrutta il suo metabolismo per replicarsi. Si sviluppa in corpo

reticolato, che produce diversi corpi elementari che fuoriescono uccidendo la

cellula ospite.

PARETE DEGLI ARCHEBATTERI

Gli archebatteri possono possedere diversi tipi di parete:

Pseudomureina: non contiene D-aminoacidi né NAT, ma contiene NAG

•

e NAT (N-acetil-talosaminuronico). Si colora come un Gram+, è

insensibile al lisozima.

Pareti proteiche e glicoproteiche: estremamente resistenti, negli

•

ipertermofili e alofili estremi.

Pareti polisaccaridiche: complesse.

•

Thermoplasma: no parete ma membrana tristratificata.

FLAGELLO E CHEMIOTASSI

Il flagello è una struttura complessa che consente il movimento di alcuni

microrganismi mobili. Esso è costituito da un corpo basale, nella membrana 14

Appunti di Claudia Tropea

plasmatica, un uncino esterno alla parete e un filamento anch'esso esterno,

cavo e costituito da flagellina.

Il corpo basale contiene un complesso di proteine motrici (Mot e Fli: FliM,

FliG e FliN sono disposte ad anello alla base e costituiscono il rotore, MotA e

MotB lo statore) che cambiano di conformazione in risposta al flusso

protonico. Questo provoca il movimento delle proteine del motor shift, che

trasmettono il movimento all'uncino e di conseguenza al flagello. l'impalcatura

è stabilizzata da tre anelli (MS, P, L) che attraversano le membrane e il

peptidoglicano e sono statici. Se si muove in senso antiorario, il batterio

procede di moto lineare. In senso orario il batterio fa delle capriole e cambia

direzione.