Appunti di Istologia

Istologia

Introduzione

L'istologia è lo studio dei quattro tessuti fondamentali. La cellula è l'unità morfologica e fisiologica fondamentale degli organismi viventi, dei quali possiede tutte le proprietà: riproduzione, nutrimento, respirazione, accrescimento, capacità di sintesi, reattività agli stimoli, movimento.

Le cellule degli organismi pluricellulari sono capaci di vita autonoma, anche una volta separate dall'organismo al quale appartengono. Le varie cellule che compongono un organismo pluricellulare si specializzano per svolgere funzioni specifiche, ovvero assumono determinate proprietà morfologiche e biochimiche che le rendono atte a svolgere le molteplici funzioni dell'organismo. Questa specializzazione prende il nome di differenziamento.

Cellule con caratteri morfologici e funzionali simili si associano tra loro a costituire i tessuti. I diversi tessuti hanno ciascuno un'architettura caratteristica finalizzata a svolgere in maniera ottimale le specifiche funzioni alle quali le cellule che li costituiscono sono dedicate.

Studio delle cellule e dei tessuti

Le cellule ed i tessuti possono essere studiate a diversi livelli:

• Morfologico
• Biochimico
• Funzionale

Analisi morfologica

Ha l'obiettivo di conoscere la forma, le dimensioni, la distribuzione, i rapporti, ed in generale l'organizzazione strutturale della cellula, delle sue parti e dei costituenti extracellulari.

Analisi biochimica e funzionale

Ha l'obiettivo di studiare la natura chimica e le modalità di funzionamento dei costituenti delle cellule e dei tessuti.

Strumenti per l'analisi di cellule e tessuti

Il microscopio ottico

Il potere di risoluzione è condizionato dai seguenti parametri:

• Potere di risoluzione
• Ingrandimento
• Contrasto

Il potere di risoluzione è definito come la distanza minima alla quale due oggetti possono essere distinti (l'occhio umano non può distinguere due punti separati da una distanza minore di 0,1 mm).

Il braccio del microscopio ottico viene detto stativo, alla base è presente una lampada e sopra la lampada un condensatore. Nella parte alta del braccio è presente un disco rotante dove si trovano gli obiettivi (in genere sono presenti tre diversi ingrandimenti).

Nella parte alta sono presenti due viti, utili per mettere a fuoco:

• Vite macrometrica: da un'immagine generale, più ampia, ma poco definita.
• Vite micrometrica: da un'immagine definita per nitidezza.

La parte più alta del microscopio è formata dagli oculari, i quali, in base al sistema di lenti, hanno il proprio potere di ingrandimento. L'immagine viene ingrandita di "ingrandimento dell'oculare x ingrandimento dell'obiettivo" volte.

Principi del microscopio ottico

Il microscopio ottico è basato sul principio che: un fascio di lenti attraversa la struttura da studiare e l'immagine così ottenuta, passando attraverso il sistema di lenti, giunge ingrandita all'occhio dell'osservatore. Per ottenere questo risultato occorre che il materiale da studiare sia attraversabile, in maniera diversificata, dalla luce senza che ci siano sovrapposizioni tra le cellule. Osservare al microscopio un intero frammento di tessuto è pressoché impossibile in quanto la luce non riuscirebbe ad attraversarlo.

Per evitare che l'immagine sia disturbata dalla sovrapposizione di più strati di cellule occorre effettuare sezioni dei tessuti da osservare che abbiano uno spessore massimo di 5-10 micron (in questo modo non si supera lo spessore di una singola cellula).

Tipi di microscopia

• Microscopia a contrasto di fase: è basata sul fatto che le strutture biologiche presentano lievi differenze nell'indice di rifrazione che determinano piccoli cambiamenti di fase nelle radiazioni trasmesse attraverso di esse. Queste piccole differenze di fase possono essere amplificate e trasformate in cambiamenti di ampiezza.
• Microscopia in campo oscuro: consiste nell'impiego di un microscopio ottico nel quale il condensatore illumina l'oggetto obliquamente. In questo modo le varie strutture cellulari, determinando la riflessione dei raggi luminosi verso l'occhio dell'osservatore, appaiono brillanti lasciando lo sfondo scuro.
• Microscopia a luce polarizzata: viene impiegata per l'analisi di certe strutture cellulari cristalline o fibrose che presentano un elevato grado di orientamento molecolare. Gli oggetti con queste caratteristiche non trasmettono la luce con la stessa velocità in tutte le direzioni, in quanto hanno indici di rifrazione differenti. Quando questi oggetti sono colpiti da un raggio di luce polarizzata in un piano, il raggio viene scisso in due raggi polarizzati in due piani perpendicolari tra di loro, i quali si propagano con velocità diverse.
• Microscopia a fluorescenza: il preparato viene illuminato attraverso luce UV, che è invisibile. Alcune sostanze chimiche generalmente presenti in alcuni tessuti o organi possiedono la proprietà di emettere luce visibile quando colpite da raggi UV. Questo fenomeno viene appunto chiamato fluorescenza.
• Microscopia confocale: vengono utilizzati una sorgente luminosa laser ed un sistema ottico ed elettronico che permette di effettuare la scansione di una o più sezioni dei campioni osservati, ricostruendo poi sullo schermo di un computer l'immagine tridimensionale risultante.

Il microscopio elettronico

Il microscopio ottico non permette di studiare tutta una serie di complessi sopramolecolari che costituiscono la cosiddetta ultra struttura dei tessuti; per questo si utilizza il microscopio elettronico. Il microscopio elettronico si basa sull'utilizzo di un fascio di elettroni (invece del fascio di luce). Gli elettroni vengono emessi dal catodo (filamento generalmente di tungsteno) e vengono accelerati nel vuoto da un potenziale elettrico. Le lenti vengono sostituite da un campo elettrostatico o elettromagnetico, che deflette gli elettroni. L'immagine prodotta può essere visualizzata su uno schermo fluorescente, oppure può essere registrata attraverso acquisizione digitale.

Tipologie principali di microscopi elettronici

• Microscopio a scansione SEM: ha un potere risolutivo più basso, ma consente di valutare il rilievo delle parti superficiali degli oggetti. È comunemente utilizzato per studiare le strutture pluricellulari.
• Microscopio a trasmissione TEM: permette di vedere le componenti subcellulari. Fornisce un'immagine che deriva dall'attraversamento delle strutture biologiche da parte degli elettroni.

Preparazione del materiale biologico per la microscopia

Le cellule dei tessuti non possono sopravvivere a lungo al di fuori dell'organismo da cui sono state prelevate. Si utilizza una serie di procedure, definite con il termine fissazione, che tendono a conservare la struttura dei campioni biologici mantenendo inalterata la loro organizzazione originaria.

Esistono diversi metodi fissativi, i principali sono:

• Alcol etilico e metilico
• Aldeidi

Un sistema alternativo è il congelamento, il quale rappresenta un sistema alternativo per la conservazione del materiale biologico.

I frammenti per poter essere osservati al microscopio devono essere frazionati in sezioni sottili, ma evitando di ottenere una poltiglia. Per questo motivo si procede ad includere il frammento in un materiale con adeguata consistenza, che generalmente è la paraffina. Il tessuto, per essere miscibile con la paraffina, deve essere preventivamente sottoposto ad un processo di sostituzione dell'acqua di cui è impregnato.

Successivamente alla frammentazione, la paraffina viene eliminata attraverso dei solventi, poi i frammenti vengono colorati per essere resi visibili al microscopio. Per la colorazione si utilizzano una serie di sostanze capaci di colorare varie porzioni della cellula, rendendole così visibili. La maggior parte delle molecole coloranti utilizzate in istologia è rappresentata da molecole idrosolubili.

Metodi istochimici di colorazione

L'istochimica ha l'obiettivo di localizzare sostanze chimiche, non solamente nelle cellule, ma anche nei costituenti intercellulari dei tessuti. I coloranti normali non danno la garanzia di legarsi in maniera specifica ad un particolare tipo di molecola. Attraverso la ricerca istochimica, i metodi di colorazione sviluppati sono in grado di evidenziare in maniera specifica singole categorie di molecole, in modo tale da localizzarle all'interno dei tessuti.

Affinché la ricerca istochimica fornisca dati validi, si devono verificare due condizioni:

• La reazione deve essere specifica per quella determinata sostanza chimica che si vuole identificare.
• La sostanza chimica ed il prodotto di reazione tra essa ed il reagente impiegato non devono subire spostamenti dalla loro posizione originaria all'interno della cellula.

Immunoistochimica

Sfrutta la capacità degli anticorpi di distinguere differenze, anche minime, tra una proteina e l'altra. Gli anticorpi sono in grado di legarsi ad altre proteine in maniera specifica. L'anticorpo si lega all'antigene, ma essendo esso stesso una molecola non può essere visto al microscopio. È quindi opportuno rendere visibile l'anticorpo, in modo tale da evidenziare il suo legame con il tessuto: si utilizzano dei fluorocromi. I fluorocromi quando vengono colpiti da raggi di luce di una lunghezza d'onda non percepibile all'occhio, emettono una luce che invece è percepibile e ci permette di riconoscere il tessuto.

Immunocitochimica

Studi di immunofluorescenza possono essere effettuati anche impiegando simultaneamente due diversi anticorpi o altri reagenti in grado di riconoscere due diverse molecole, in modo tale da analizzare i rapporti spaziali reciproci anche all'interno di una singola cellula. Si possono usare quindi due fluorocromi diversi.

Citologia

Le cellule eucariotiche presentano una struttura interna caratterizzata dalla suddivisione del protoplasma in due compartimenti, separati dall'involucro nucleare: il nucleo ed il citoplasma.

Il nucleo è al centro ed è circondato dal citoplasma, il quale è delimitato esternamente dalla membrana plasmatica. Oltre alla membrana plasmatica, le cellule sono dotate di altre membrane, interne ad essa, che delimitano gli organelli: gli elementi subcellulari specializzati nelle varie funzioni.

La membrana plasmatica

La membrana plasmatica, essendo immiscibile con l'acqua, delimita lo spazio intracellulare rispetto a quello extracellulare, definendo quindi i confini della cellula. La membrana permette una costante comunicazione tra i due lati della membrana, attraverso scambi bidirezionali (il materiale può sia entrare che uscire dalla cellula). Questi scambi garantiscono le attività fondamentali per la vita della cellula.

La membrana plasmatica è formata principalmente da lipidi, in particolare si parla di fosfolipidi. I fosfolipidi sono molecole anfipatiche (polari e non), in quanto presentano una zona polare idrofila (testa) ed una apolare idrofobica (coda). La membrana è un doppio strato fosfolipidico, con le teste orientate verso le zone interna ed esterna della cellula, e le code orientate verso lo spazio interno della membrana.

I fosfolipidi che compongono la membrana plasmatica sono principalmente di due tipi:

• Fosfogliceridi derivati dal glicerolo
• Sfingolipidi derivati dalla sfingosina

Un altro importante componente della membrana è il colesterolo, in grado di mantenere la fluidità della membrana, ma allo stesso tempo di conferirle la rigidità necessaria a:

• Non renderla troppo fragile
• Permettere giunzioni e contatti con le altre cellule

Le proteine di membrana

I lipidi non sono soltanto un fattore fondamentale per l'aspetto strutturale della cellula, ma influenzano anche la composizione e l'attività delle proteine di membrana. Circa la metà della massa della membrana plasmatica è costituita dalle proteine di membrana, distribuite in modo asimmetrico tra le due facce della membrana e con differente localizzazione.

Tipi di proteine

• Proteine intrinseche o integrali: grazie ai propri amminoacidi idrofobici interagiscono fortemente con i lipidi di membrana, in base alla zona della membrana dalla quale sporge la loro porzione idrofila vengono divise in:
  • Bitopiche: attraversano la membrana da parte a parte.
  • Monotopiche: attraversano la membrana solo in modo parziale.
  • Politopiche: attraversano la membrana più volte ed in più punti.
• Proteine estrinseche o periferiche: sono al di sopra del doppio strato fosfolipidico, si legano debolmente ai gruppi polari presenti sulla superficie della membrana.

I residui oligosaccaridici delle glicoproteine, dei proteoglicani e dei glicolipidi sono esposti sulla superficie esterna della membrana. Le glicoproteine di membrana sono caratterizzate da una porzione glicanica, presente sulla porzione extracellulare, e da una porzione idrofobica e priva di carboidrati, immersa all'interno del doppio strato fosfolipidico.

Recettori

Le glicoproteine di membrana possono essere adibiti a recettori, in grado di legare molecole che devono trasmettere un segnale; questi segnali si attivano in seguito ad un'interazione con altre molecole, generando un segnale a cascata che viene trasmesso fino al nucleo.

Trasporto di membrana

La membrana plasmatica è una struttura a permeabilità selettiva, cioè permette il passaggio attraverso di essa soltanto di specifiche molecole o ioni. Alcune proteine possono organizzarsi in modo tale da permettere il passaggio di alcune sostanze, attraverso due modalità di trasporto:

• Trasporto passivo
• Trasporto attivo

Trasporto passivo

Il trasporto passivo si suddivide in due categorie:

• Diffusione semplice: le molecole di soluto (generalmente piccole molecole liposolubili) entrano ed escono liberamente dalla cellula, attraversando il doppio strato fosfolipidico. Il movimento si verifica esclusivamente secondo gradiente di concentrazione (da una zona a maggior concentrazione di soluto verso una a minor concentrazione).
• Diffusione facilitata: processo di trasporto agevolato dalla presenza di specifiche proteine transmembrana, che permettono il passaggio di:
  • Molecole idrosolubili
  • Molecole o atomi dotati di carica elettrica
  Le proteine transmembrana che permettono la diffusione facilitata sono di due classi:
  • Proteine trasportatrici
  • Proteine canale

A differenza della diffusione semplice, quella facilitata (attraverso proteine) presenta un meccanismo di saturazione: aumentando progressivamente la concentrazione della molecola in uno dei compartimenti ai due lati della membrana, viene raggiunto progressivamente un livello oltre al quale la velocità di trasporto non aumenta ulteriormente, che è il livello di saturazione.

Differente è il trasporto dell'acqua, in quanto in questo caso si parla del solvente e non del soluto; questo è reso possibile da proteine chiamate acquaporine. Il fenomeno del movimento dell'acqua attraverso la membrana è chiamato osmosi, durante il quale l'acqua si muove spontaneamente da una zona a minor concentrazione di soluto ad una a maggior concentrazione.

Trasporto attivo

Il trasporto attivo avviene invece contro gradiente di concentrazione o gradiente elettrico, ed in questo caso comporta un lavoro ed un dispendio di energia.

Le proteine trasportatrici sono dette pompe ioniche, le quali sfruttano l'idrolisi di ATP (in ADP + Pi) come fonte di energia. L'esempio più classico è la pompa Na/K ATPasi: trasporta ioni Na+ all'esterno della cellula e ioni K+ all'interno, sfruttando l'enzima ATPasi che è localizzato sulla pompa stessa e permette l'idrolisi dell'ATP.

Trasporto accoppiato

Una seconda tipologia di trasporto attivo è il trasporto accoppiato: si sfrutta il movimento di molecole o ioni secondo gradiente per trasportare molecole o ioni che devono muoversi invece contro gradiente.

Traffico vescicolare

Il citosol è attraversato da un intricato reticolo continuo di tubuli e cisterne, definito reticolo endoplasmatico (RE), il quale sintetizza, accumula e trasporta molecole di varia natura. Associate a questo reticolo ci sono vescicole che trasportano le molecole dalla loro sede di sintesi alle loro destinazioni finali, mentre un secondo sistema di vescicole (separato dal RE) funziona da stazione intermedia di questo transito: l'apparato del Golgi.

Reticolo endoplasmatico liscio (REL)

È definito come la porzione di RE priva di ribosomi, in quanto le sue membrane non presentano le proteine in grado di legarli. Il REL è un sistema di membrane sulle quali sono localizzati specifici enzimi, che gli permettono di sintetizzare, accumulare e trasportare determinate molecole.

Funzioni del REL

• Sintesi di lipidi: necessari alla produzione ed al rinnovo delle membrane cellulari; la sintesi è operata grazie alla presenza sulle sue membrane degli enzimi necessari a tale processo. In base alla richiesta di sintesi di lipidi, la sua estensione può aumentare considerevolmente in determinate condizioni.
• Accumuloe rilascio di ioni Calcio: funzione per il quale in determinate cellule (muscolari soprattutto) viene definito reticolo sarcoplasmatico. Lo ione viene prelevato dal citosol da una pompa proteica con attività ATPasica.
• Metabolismo del glicogeno (principalmente negli epatociti). Quando l'organismo ha la necessità di energia, il glicogeno viene convertito in glucosio.