Appunti di Ingegneria proteica, Prof.ssa Molinari

11 TECNICHE DI RANDOM MUTAGENESI

Tecniche di Random Mutagenesi per introdurre mutazioni in una sequenza

1. Error prone PCR (EpPCR)

PCR ad elevato tasso di mutazione. Tecnica messa a punto da Arnold. Si utilizza un enzima che introduce errori nella sequenza desiderata, mentre normalmente si auspica il minor numero possibile di errori. Si cambiano le caratteristiche del buffer di PCR e in queste condizioni, la polimerasi commette errori nell'appaiamento delle basi durante la sintesi del DNA che provoca l'introduzione di errori nel filamento di DNA complementare appena sintetizzato.

• "Low fidelity enzymes": Taq pol (normalmente 2,7 errori ogni 10 basi) o PFU modificate.
• Sali di manganese invece che magnesio cloruro; oppure utilizzo del magnesio ma in concentrazioni diverse da quelle ottimali (quelle ottimali sono 1,5-4 mM).
• Miscela di dNTP modificate per controbilanciare la tendenza di alcuni enzimi a compensare alle mutazioni.
• Introduzione anche di dNTP di

Analoghi chiamati basi universali (inosina, 8-ossi-GTP, 8-idrossi-dGTP). Nel ciclo successivo di amplificazione, in corrispondenza delle basi universali nel complementare è introdotto un ntd casuale.

2. SeSAM: sequence saturated mutagenesis

Consente di fare una scansione di tutta la sequenza, se fatta bene si fa la scansione di ogni singolo ntd della sequenza ottima libreria di frammenti.

In generale:

• È necessario ottenere una gamma di frammenti (libreria) di tutte le possibili dimensioni della sequenza da mutagenizzare a singolo filamento.
• Processo di "Elongation" dei frammenti, per cui serve l'enzima trasferasi terminale (maggiore è il tempo di reazione, maggiore è l'allungamento).
• PCR con i ntd a disposizione: ntd universali.
• I frammenti con le basi universali all'estremità sono riuniti per ricostruire la sequenza originale: i frammenti sono usati loro stessi da primer. Facendo la PCR, in corrispondenza delle

1. Si fa denaturazione dei frammenti.
2. I frammenti a singolo filamento sono separati con cromatografia per affinità: i frammenti che contengono biotina si legano all'avidina.
3. Tramite ebollizione o SDS si separano i frammenti dalla colonna (eluizione).
4. A questo punto si ottengono frammenti single strand (ss) incubati con la transferasi terminale e con le basi universali e si fa l'elongation.
5. Successivamente si fa un'altra elongation mediante PCR con il reverse primer biotinilato per avere il filamento stampo completo. Ad esso sono complementari tutti i frammenti ottenuti precedentemente (che hanno basi universali) complementandosi con lo stampo biotinilato. Questi frammenti funzionano da primer e si ricostituisce il full lenght.
6. Aggiungo poi primer per ottenere i full lenght a doppio filamento; in corrispondenza delle basi universali si inseriscono mutazioni.

• NON ottengo tutti i singoli mutanti, perché le basi universali in

  realtà hanno alcune preferenze per alcune basi azotate canoniche.

  Degenerazione del codice genetico: a volte la variazione del ntd NON determina una variazione amminoacidica.

  Oligonucleotide-directed randomization

  Per ottenere in vitro mutazioni casuali si possono fare amplificazioni della sequenza usando oligonucleotidi random. La mutazione viene apportata usando oligontd che contengono già la casualità. Quindi nella reazione di PCR si hanno lo stampo e l’oligontd che porta la mutazione. Rimane il bias correlato alla degenerazione del codice genetico.

  Uso di ceppi cellulari mutagenizzati:

  Mutazione su ceppi XL-1 RED di E. coli

  Uso di un ceppo mutato sulle attività enzimatiche preposte al controllo della sequenza genomicapost-replicativa. MutS, MutD, MutT MutS-, MutD-, MutT-Si introduce quindi un’elevata percentuale di errori sulla sequenza plasmidica.

  Il limite di questi ceppi è che essi crescono male, perché hanno bassa

  stabilità genomica: crescono lentamente, accumulano mutazioni e diventa difficile avere la loro amplificazione.

  Uso di cellule BIpermutazione somatica (SHM) sui geni che codificano per queste proteine. Mutazioni su questi siti si usano per mutagenizzare sequenze: primo esperimento 2004: si ottengono cellule B stabili che subiscono comunque ipermutazione somatica, ma inefficiente. Oggi si usano cellule DT40 con elevata efficienza di ricombinazione omologa, con un apparato enzimatico che concentra le mutazioni sul locus della catena leggera delle immunoglobuline dove avviene l’ipermutazione.

  Enzima AID (activation induced citidine deaminase): una volta individuato un clone di cellule DT40 che esprime una proteina mutagenizzata con proprietà desiderate, l’enzima deve essere rimosso così che NON vengano introdotte ulteriori mutazioni.

  QUINDI: La sequenza da mutagenizzare è inserita mediante ricombinazione omologa tra vettore e genoma nel locus delle immunoglouline.

  portando ad un’ipermutazione somatica. Le cellule mutagenizzano la sequenza, ma possono anche esprimere la proteina mutagenizzata. Si può fare un test di screening sulla cellula che ha operato la mutagenesi (ad esempio mediante citofluorimetria a flusso). Per evitare mutazioni successive che potrebbero vanificare le mutazioni benefiche, si deve evitare l’ipermutazione. Quindi seleziono il clone e uso Cre-ricombinasi per fare un knock-out del gene AID. Sul genoma ci sono regioni regolatorie in cis che reclutano l’apparato enzimatico per l’ipermutazione. Se si individuano queste sequenze, si possono inserire nel plasmide, reclutando l’apparato enzimatico per indurre SHM anche sul vettore senza attivare la ricombinazione (il vettore può essere di espressione, così che possa esprimere la sequenza mutagenizzata). Facendo invece una mutagenesi in vitro, per fare lo screening si deve prima produrre la proteina. Con le cellule si hanno entrambi gli aspetti.

  (mutagenesi e screening) nello stesso sistema. 6. DNA shuffling o PCR sessuale Si ottengono delle chimere, con sequenze che sono un mix di quelle originali. Tecnica ideata da Stemmer, 1994. - Un gruppo di sequenze viene frammentato con DNAsi (size fractionation). La frammentazione deve avvenire in modo da creare frammenti parzialmente sovrapposti; non può essere quindi una frammentazione con enzimi di restrizione che produce frammenti sempre uguali (perché tagliano sempre negli stessi punti). - I frammenti sono sottoposti a PCR primerless, dove NON vengono introdotti dei primer. Quindi come si ricostituiscono i frammenti full lenght? Quando i vari frammenti funzionano da primer per i frammenti con cui sono parzialmente complementari. La frammentazione deve quindi essere casuale, fatta utilizzando DNAsiI (introduce nick che rompe legami fosfodiesterei in maniera casuale teoricamente senza preferenze) o un metodo fisico (sonicazione). Bias: - Frammentazione deve essere casuale, maNON è così semplice (si preferisce DNAsi5 che ha meno preferenze rispetto alla DNAsiI). È più probabile che si appaino i frammenti che derivano dalla stessa sequenza (frammenti simili o identici) in questo caso NON ho ricombinazione. Via via si hanno frammenti sempre più grandi fino ad arrivare a quello full length. Varianti del DNA shuffling: 1. Single gene DNA shuffling Richiede omologia del 95-99% tra le sequenze. Le sequenze sottoposte al rimescolamento derivano tutte dalla stessa sequenza originale. Le sequenze usate nella ricombinazione sono il prodotto di una mutagenesi random attuata su una sequenza originale. Faccio una EpPCR (1), ottengo libreria di mutanti che sottopongo a screening selezionando quelli con mutazioni favorevoli. Tra questi si fa una ricombinazione omologa, sperando di ottenere una sinergia tra queste mutazioni benefiche, ottenendo una libreria ricombinante. Da questa libreria procedo con un metodo DNA shuffling (2), partendo da una
  1. libreria di mutanti che subiscono ulteriori mutazioni ( ottengo una seconda libreria) ottenendo mutanti con funzioni migliorate (sperabilmente, NON necessariamente è così). Il DNA shuffling è quindi usato per rendere più efficiente l’evoluzione diretta in laboratorio.
  2. Family shuffling
     Le sequenze utilizzate per il rimescolamento appartengono ad una famiglia genica, quindi possono derivare da una duplicazione genica o sequenze della stessa famiglia provenienti da specie diverse. In questo caso l’omologia di sequenza è minore, quindi affinché il DNA shuffling abbia successo l’omologia di sequenza deve essere almeno del 60%, altrimenti NON si ha annealing fra sequenze diverse.
  3. StEP-Staggered extension process in vitro
     Si fanno reazioni di PCR con primer forward e reverse che legano le estremità del frammento. L’estensione è molto breve, quindi l’estensione non arriva fino al termine del filamento. Dopo

  Il primo step, i primer si allungano di qualche nucleotide. Nel secondo step, i primer allungati possono fare da primer agli stessi frammenti o ad altri, e così via. Si ottiene, come nella Shuffling, una chimera. Con la StEP si hanno gli stessi problemi della Shuffling. Serve un'omologia almeno dell'80%.

  8. Random chimeragenesis on transient templates (RACHITT)

  Descritta in questo articolo: Pelletier, J. N. (2001). Nature Biotechnology, 19, 314–315. Coco, W.M. et al. Nat. Biotechnol. 19, 354–359 (2001).

  Parto da una famiglia genica che contiene X geni da ricombinare. Si ottengono frammenti (con DNAsiI) delle sequenze originali, ma a singolo filamento. Questi frammenti vengono fatti ibridare con la sequenza complementare a singolo filamento che deve essere full lenght, per poter avere alla fine il filamento intero. Il full lenght deriva dalla sequenza di un solo gene della famiglia di sequenze che si sottopongono a reazione. I frammenti.