Appunti di Ingegneria proteica, Prof.ssa Molinari

APPUNTI DI

INGEGNERIA PROTEICA

Prof.ssa Susanna Molinari

Appunti di: Laura Ventura

BIOTECNOLOGIE MEDICHE

A.A. 2019-2020

Anno I, Semestre I

Laura Ventura

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Laura Ventura

Libri di testo consigliati

Struttura e funzione delle proteine; strutture delle proteine, aa, legame peptidico.

Proteins: biochemistry and biotechnology; Walsh

Protein engineering: principals and practice; Cleand

Biotecnologie microbiche; Donadio, Marino

Biotecnologia molecolare

Introduzione all’ingegneria proteica

 Definizione di ingegneria proteica

 Principali obiettivi

 Strategie utilizzate per modificare le proteine

Ingegneria delle proteine=concepimento e produzione di polipeptidi che non esistono in natura e

vengono ottenuti per essere utilizzati in vari campi.

I polipeptidi NON naturali possono derivare:

 Dalla modifica di proteine già esistenti in natura

 Da sequenze concepite a livello bioinformatico

Si distinguono 3 fasi storiche

1. 100 anni fa: sfruttare proteine esistenti in natura per le loro proprietà; Rosenthaler usò un

enzima naturale per catalizzare una reazione di interesse;



2. 1980: mutagenesi sito-diretta avvio alle tecniche genetiche per modifica di proteine. Per

sfruttare le proteine è necessario che esse abbiano una certa stabilità.

3. Sfruttare proteine che catalizzano reazioni NON naturali mediante una metodica di

mutagenesi sviluppata da Pim Stemmer e Frances Arnold; evoluzione diretta delle proteine

in laboratorio. Obiettivi

1. Modifica di proteine note per sfruttarle per vari scopi.

 Uso domestico: lipasi e proteasi sono utilizzate per detersivi

 Interesse farmaceutico: red biotechnology; ad esempio insulina, somatostatina,

eritropoietina, targeted drug delivery (ad es per alcune malattie autoimmuni)

 Ricerca scientifica: GFP, Taq polimerasi, enzimi di restrizione, ligasi

 Industriale: per la biocatalisi, che è la sostituzione della catalisi chimica con la catalisi

enzimatica: uso di enzimi o mo geneticamente modificati per catalizzare reazioni di

interesse industriale (white biotechnology)

 Controllo dell’inquinamento (mo utilizzati come biosensori) e biorisanamento



(eliminazione dell’inquinamento) grey biotechnology

2. Studiare struttura della proteina e la correlazione struttura-funzione, verificare gli effetti

della mutagenesi sulla funzione della proteina e sulla sua capacità di interagire con altre

proteine/ligandi. Così si possono disegnare molecole che interferiscano con la funzione di

quella proteina o la potenzino.

3. Ottenimento di strutture proteiche su cui posizionare nanomateriale

Anticorpi monoclonali: principali farmaci proteici ricombinanti utilizzati

Humira (nome è Adamimumab)

Rituxan: specifico per CD20 su linfociti B

Herceptin: specifico per Her2; farmaco usato per il tumore alla mammella.

Avastin: inibitore dell’angiogenesi (del VEGF) usato per terapie anti-tumorali;

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MODIFICAZIONE DELLE PROTEINE

Le proteine possono essere modificate chimicamente (unica opzione fino al 1892) o geneticamente

(cioè modificazione delle sequenze che codificano per proteine mediante 2 possibili approcci:

mutagenesi sito-diretta o random).

1. Modifiche chimiche delle proteine

Aggiunta o rottura di uno o più gruppi chimici con il risultato di modificare la solubilità o altre

proprietà delle proteine, viene realizzata mediante trattamento con una molecola che reagisca con i

gruppi funzionali esposti all’esterno della proteina.

Ad esempio anidride acetica CH3COOCOCH3 che reagisce con i gruppi amminici delle catene

laterali nelle lisine che vengono acetilate (-NH2COCH3).

Limiti:

 Si modificano solo i gruppi esterni (superficiali) della proteina

 Non c’è specificità: tutti i gruppi esposti verranno modificati, a meno che non ci sia un

gruppo fortemente reattivo (ex gruppo amminico della lys); giocando sulla concentrazione

del reagente chimico posso bersagliare solo il sito attivo (rimane comunque poco specifico).

Applicazioni:

 

Marcatura radioattiva di proteine: iodio131 (in vivo) o iodio125 (in vitro) si lega a un

atomo di idrogeno in istidina o tirosina.

 Determinazione dello stato di ionizzazione delle catene laterali.

 Valutazione dell’importanza di alcuni gruppi chimici nella funzione della proteina:

modificando alcuni gruppi posso osservare le ripercussioni sull’attività della proteina;

 Blocco dei gruppi sulfidrilici con NEM (N-etilmaleimide, lega in maniera irreversibile) o

MMTS (lega in maniera reversibile, quindi la proteina può essere accesa o spenta a seconda

del bisogno), le quali reagiscono con i gruppi sulfidrilici (in catena laterale della cisteina).

Bloccando questi siti, la proteina potrebbe essere attivata o disattivata.

Possibili modifiche sulle proteine

 Coniugazione di anticorpi monoclonali a molecole tossiche (immunotossine) utilizzate

come farmaci.

 PEGilazione: si aggiunge un polimero inerte di polietilenglicole (PEG) legato ad un gruppo

reattivo della proteina (solitamente il gruppo amminico delle lys). A cosa serve la

PEGilazione? Come tag, per modificare l’emivita e la farmacologia di una proteina

aumentandone la solubilità e la massa del farmaco (che rende più lunga la sua

degradazione).

Immobilizzazione degli enzimi

Gli enzimi spesso sono immobilizzati su supporti solidi e non in soluzione, perché il supporto con

l’enzima può essere riutilizzato. Inoltre gli enzimi immobilizzati sono più stabili.

L’immobilizzazione può avere tramite:

 Attachment: mediante semplice legame fisico molto labile, oppure legame ionico oppure

covalente;

 Incapsulazione: l’enzima può essere incapsulato in liposomi, microcapsule o polimerico

organici/inorganici;

 Crosslinking: formazione di aggregati solidi mediante precipitazione frazionata dell’enzima

e formazione di legami crociati covalenti tra molecole di enzima precipitate.

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(CEA=crosslinked enzyme aggregate) o aggregati di più enzimi che consentono di determinare due

2 reazioni successive a partire da un substrato (combiCEA).

L’aggregazione avviene mediante ammonio solfato che NON denatura la proteina, ma la fa

precipitare.

Bioconiugazione o crosslinking

Processo che porta alla formazione di legami chimici covalenti tra 2 o più molecole. Principali

gruppi reattivi:

 Ammine primarie NH2: gruppo presente in tutte le regioni N-terminali di un polipeptide, ma

anche nelle catene laterali di alcuni amminoacidi (Lys)

 Carbossili COOH: gruppo presente in tutte le regioni C-terminali di un polipeptide, ma

anche nelle catene laterali di alcuni amminoacidi (Asp, Glu)

 Sulfidrilici SH: in cys

 Carbonili CHO (elevata reattività) che non sono già presenti, ma possono essere generati

mediante parziale ossidazione

Il crosslinking generalmente contiene 2 gruppi chimici separati da una catena detta spaziatore

(spacer).

La scelta dipende da:

 Specificità chimica: incluso il fatto che i due gruppi siano identici (struttura omo-

bifunzionale) o diversi (struttura etero-bifunzionale).

 Lunghezza dello spaziatore: incluso il fatto che lo spaziatore possa essere tagliato

chimicamente, rendendo il crosslinking reversibile.

 Solubilità in acqua e permeabilità attraverso le membrane: questi parametri hanno un

impatto sul fatto che l’agente possa entrare nella cellula/nucleo e/o possa indurre

crosslinking tra proteine idrofobiche di membrana.

 Reazione chimica spontanea o gruppi che richiedono un’attivazione (ad esempio con

esposizione a radiazione UV o luminosa).

La reazione può essere reversibile o irreversibile.

I crosslinking quindi possono essere usati per la tecnica CEA (1) (crosslinking tra gruppi

intramolecolari per la stabilizzazione di strutture terziarie o quaternarie), ma anche per

l’individuazione di nuovi partner (2) proteici di una proteina bersaglio (co-immunoprecipitazione) o

immobilizzare anticorpi (3) su un supporto per fare una cromatografia di affinità (tecnica molto

usata per la purificazione di proteine ricombinanti) che si fa utilizzando ligandi posizionati in

maniera stabile su fase solida.

Ad esempio: il gruppo iodoacetile legato al supporto reagisce con il peptide che ha un gruppo

reattivo (-SH), liberando un gruppo -HI.

Co-immunopreicipitazione: faccio precipitare la proteina, che può portare con sé una seconda



proteina (interattore) si fanno così studi di interazione. Le interazioni tra proteine sono labili e a

volte è difficile mettere in evidenza le interazioni, perciò spesso può essere utile utilizzare un

crosslinkante reversibile (perché poi le 2 proteine dovranno essere separate per successive analisi)

che mantenga insieme le due proteine interagenti.



Crosslinking tra proteine e DNA chromatin immunoprecipitation (ChIP):

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La formaldeide reagisce con gruppi amminici presenti nelle proteine formando un gruppo

intermedio instabile, il metilolo. Esso subisce una disidratazione formando una base di Shiff che

reagisce con un acido nucleico o col gruppo amminico di un’altra proteina, formando un legame

(gruppo metilenico) crociato tra le 2 molecole (DNA-proteina o proteina-proteina).

Si usa la formaldeide come agente crosslinkante perché:

 E’ piccola, quindi permeabile e solubile ed in grado di permeare facilmente le membrane

cellulari (la cromatina si trova all’interno del nucleo)

 Essendo piccola, avvicina molte le 2 molecole unite avendo un’alta risoluzione: se si trova

quel legame, le molecole sono molto vicine.

 Crea legami reversibili, quindi la 2 molecole possono essere separate mediante reverse

crosslinking che utilizza alte temperature per separare le molecole.

Quindi la ChIP prevede i seguenti step:

 Si fa entrare la formaldeide nel nucleo

 Si fa la sonicazione per frammentare il DNA

 Si fa immunoprecipitazione con un anticorpo che riconosce quel fattore

 Si stacca il complesso dalla colonna cromatografia e si procede con reverse crosslinking ed

eventualmente si studia la proteina mediante western blot. Altrimenti, se ci interessa studiare

il DNA, la proteina è degradata con proteasi e il DNA è analizzato mediante RT-PCR o high

throuput sequencing.

La sintesi chimica di una proteina è applicata solo a mini-proteine, che possono ad esempio essere

usate come supporto per nanomateriale o gruppi di legame specifici. Le grandi proteine NON

vengono sintetizzate chimicamente perché sarebbe molto costoso e poco efficace.

2. Modifiche genetiche delle proteine

Le tecniche genetiche possono essere applicate per:

 Ottenimento di geni sintetici (o meglio cDNA), parzialmente modificati rispetto a quelli

naturali o affatto nuovi;

 Produzione delle proteine ricombinanti in organismi geneticamente modificati

A. Mutagenesi sito-diretta

Metodica che consente di alterare in maniera specifica la sequenza amminoacidica di una proteina.

Riguarda un punto specifico della proteina, ma può essere fatta anche a livello di più aminoacidi

alla volta; in ogni caso si decide a priori dove modificare la proteina.

Il primo articolo in cui si parla di questa metodica è del 1978 (Hutchinson C & Smith, Mutagenesis

at a specific position in a DNA sequence, J. Biol. Chem. 253, 6551-6560 (1978)). Prima di arrivare

a questo era stato necessario poter fare sequenziamento e disporre di oligontd di sintesi.

Nel 1982 uscirono contemporaneamente 2 articoli: i primi approcci genetici di ingegneria proteica

erano mirati a stabilire le relazioni struttura-attività di una proteina.

Articolo 1: Winter, G., Fersht, A. R., Wilkinson, A. J., Zoller, M. & Smith, M., Redesigning enzyme

structure by site-directed mutagenesis: tyrosyl tRNA synthetase and ATP binding. Nature 299, 756–

758 (1982).

Articolo 2: Sigal, I. S., Harwood, B. G. & Arentzen, R. Thiol,β-lactamase: replacement of the active

site serine of RTEM β-lactamase by a cysteine residue. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7157–7160

(1982).

Strategie di mutagenesi sito-diretta:

 Rational redesign: si parte da una proteina di sequenza nota, di cui si conoscono quindi

molte informazioni;

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 Semi-rational redesign: conoscenza della struttura, ma NON degli amminoacidi cruciali per

la struttura o la funzione della proteina. In questo caso si ha una maggior probabilità che la

mutagenesi sito-diretta dia esito negativo.

In ogni caso la bioinformatica è fondamentale per analizzare sequenze omologhe e prevedere gli

effetti di una mutazione.

B. Mutagenesi random: strategia laboratory directed evolution (mima l’evoluzione naturale).

Le variazioni vengono introdotte in modo casuale, quindi si seleziona il fenotipo desiderato. Questo

approccio si usa se NON si conoscono gli aa cruciali di una proteina oppure se si deve ottenere

un’ampia libreria di mutanti che poi vengono sottoposti a screening per valutare quali hanno

ottenuto un miglioramento od un’evoluzione ulteriore; è più facile che vi siano mutazioni che

peggiorano o destabilizzano la proteina. I mutanti favorevoli sono sottoposti ad altri cicli di

mutazione casuali, per mimare quello che succede in natura.

Ingegneria proteica:

 Analitica: studio della relazione struttura-funzione (genetica inversa: dal genotipo ottenuto

per mutagenesi al fenotipo) ed ottenimento di determinati elementi di struttura a partire da

una sequenza studiata a tavolino (approccio detto “inverse protein folding”: si fanno

supposizioni su quale possa essere la struttura associata a quella sequenza);

 Sintetica: riguarda lo sfruttamento di organismi per la produzione di queste proteine.

Aspetti di interesse dell’ingegneria proteica

 Catalisi

 Riconoscimento molecolare

 Interazioni proteina-proteina: riguarda soprattutto il “Molecular drug design”. Si possono

costruire piccole molecole che possono interrompere questa interazione.

 Ripiegamento

 Stabilità

Enzimi

Sono di grande interesse industriale

Vantaggi: biodegradabilità, alta chemo e stereospecificità, bassa tossicità, alta efficienza.

Problemi: perdita di attività a causa di solventi organici e alte T, inibizione da substrato o prodotto,

elevati costi di produzione dell’enzima.

L’ingegnere proteico può modificare alcune proprietà enzimatiche:

 Attività catalitica: aumento Vmax, diminuzione Km, modificazione del pH ottimale,

eliminazione di un sito inibitorio;

 Specificità di substrato e stereospecificità: alterazione della specificità di reazione e

modificazione della specificità di legame al ligando

 Termostabilità: aumento di termostabilità o della stabilità in solventi organici

2.A. Mutagenesi sito-diretta

Cosa serve?

 Sequenza di cDNA della proteina da mutagenizzare (quindi la sequenza deve essere nota)

che deve essere clonata in un vettore plasmidico

 Servono oligonucleotidi (oligodt) che portino la mutazione nella sequenza

 Metodo per selezionare il mutante

Tipi di mutazione: puntiforme, inserzione, delezione.

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Primo approccio: PCR-based site directed mutagenesis of linear DNA

La sequenza che deve essere mutagenizzata (cDNA) viene inserita in un vettore plasmidico. Si

prendono 2 oligontd con direzioni opposte complementari tra loro e alla sequenza del cDNA in

corrispondenza alla zona in cui si vuole introdurre la

mutazione, ad eccezione del punto esatto in cui deve

essere posizionata la mutazione (generalmente al centro

della mutazione).

Si fanno 2 reazioni di PCR: ho due provette con la

sequenza da mutagenizzare. In entrambe si avranno 2

primer, uno contiene la mutazione.

Le sequenze amplificate per PCR nelle 2 diverse

provette sono parzialmente sovrapponibili.

Le sequenze con la mutazione ottenute per PCR

vengono separate e purificate rispetto allo stampo

naturale senza mutazione (che è più grande, quindi si fa

ad esempio per elettroforesi).

I prodotti ottenuti per PCR nelle 2 provette vengono

riunite (poiché sono in parte sovrapponibili), in modo

tale da ottenere la molecola di DNA completa come

l’originale, ma con la mutazione.

Poi il gene mutato è clonato in un vettore che viene utilizzato per l’espressione della proteina.

Secondo approccio: quick change site-directed mutagenesis of circular DNA

La sequenza di cDNA da mutagenizzare deve essere clonata all’interno di un plasmide e possiamo

avere una sequenza che vogliamo modificare. Le modifiche sono varie, come sostituzione di uno o

più nucleotidi. Sono necessari un plasmide a doppio filamento e 2 oligonucleotidi di sintesi

complementari alla regione da mutagenizzare.

Il plasmide e i 2 oligo sono incubati e sottoposti a reazione di PCR (in termociclatore, 25-40 cicli):

 Denaturazione

 Annealing: i primer si complementano con le sequenze che devono essere mutagenizzate

 Estensione: terminata la PCR si hanno 2 tipi di plasmidi, uno costituito dai filamenti

parentali e uno con filamenti di nuova sintesi con le mutazioni in entrambi i filamenti.

Il prodotto della reazione viene trasformato in cellule batteriche mediante trasformazione: i plasmidi

sono messi a contatto con cellule batteriche rese competenti ad accogliere DNA esogeno.

Selezione

Il quick cloning è veloce nella selezione dei mutanti: sfrutta un metodo di selezione prima della



trasformazione prima di trasformare i batteri si selezionano solo le molecole plasmidiche con la

sequenza mutata.

Come? + +

Si utilizzano batteri DAM (quindi il cDNA è clonato in un plasmide di un batterio Dam ) nel

genoma hanno un gene codificante per l’enzima Desossi-Adenosina-Metilasi. Questi batteri

metilano l’adenina e sfruttano questa attività per proteggere il loro genoma da attività enzimatiche

indesiderate. Il DNA di nuova sintesi che contiene la mutazione, ottenuto completamente i