Genetica II - Appunti

1) CARATTERI QUANTITATIVI DEI LOCI (QTL): Loci associati a caratteri quantitativi

Un carattere quantitativo può essere l’altezza. I caratteri quantitativi sono determinati dalla

segregazione di alleli di più geni che interagiscono insieme e con l’ambiente. Questi QTL sono

spesso trovati su differenti cromosomi. Sono dei caratteri poligenici cioè controllati da più geni e

multifattoriali cioè oltre al fattore geni esiste anche il fattore ambiente (es. dieta). Quindi i

genetisti cercano di capire qual è l’ereditarietà di quella componente (genica e ambientale).

Troviamo caratteri quantitativi con una manifestazione continua: altezza, peso, colore della pelle,

degli occhi, colore del sangue ma ci sono anche caratteri che si manifestano in modo dicotomo (il

fenotipo o c’è o no): palatoschisi, diabete di tipo II, la displasia dell’anca. Bisogna anche cercare di

capire come mai ci sono dei caratteri con manifestazione discontinua. La foto da l’idea di come i

singoli caratteri si possono piazzare come un punto qualsiasi del

triangolo, ci possono essere quelli multifattoriali o quelli poligenici o

quelli che risentono dell’ambiente. Il numero di QTL che spiega la

variazione della caratteristica fenotipica è molto variabile come è la

loro contribuzione alla varietà fenotipica. Un carattere potrebbe

essere controllato da molti geni svolgendo un piccolo effetto o da

pochi geni con effetti maggiori. La distribuzione matematica di un QTL

è la gaussiana.

Esempio: abbiamo dei loci che hanno varianti alleliche codominanti (vedo l’effetto di entrambi gli

alleli nel fenotipo) con un effetto additivo

(considerando l’altezza per ogni allele grande

aggiunge 10 cm a un’altezza di base). Le classi

grandi con 10 cm in più sono A, B, C mentre quelle

piccole sono a, b, c. nella popolazione la frequenza

degli alleli è 0,5. Faccio in primis l’incrocio Aa x Aa

ottenendo le proporzioni ¼ AA e aa e ½ Aa. Con un

locus e due varianti ottengo tre classi fenotipiche.

Consideriamo due loci con B b, otteniamo cinque

classi fenotipiche dalle proporzioni: 0cm in più per

aabb, 10 per Aabb e aaBb, 20 per AAbb e AaBb e

aaBB, 30 per AABb e AaBB, e 40 per AABB. Quindi possono avere o 0 o 1 o 2 o 3 o 4 alleli grandi.

Aggiungendo un terzo locus possono ottenere 7 classi fenotipiche in cui possono avere 0 o 1 o 2 o

3 o 4 o 5 o 6 alleli grandi. Quindi nel grafico si dispongono i dati e vanno a ricordare una gaussiana.

Quindi tanto maggiori sono i geni o gli alleli tanto maggiori saranno le possibili classi e le similarità

alla continua variazione fenotipica. La quantità della variabilità umana si può spiegare con

ampliamenti della genetica mendeliana.

Esempio: al contrario abbiamo già la

gaussiana e ci chiediamo quali sono le basi

genetiche (2 geni con due alleli) per ottenere

le cinque classi diverse di colore degli occhi.

La risposa la vediamo nella tabella. Lo stesso

vale con il colore della pelle in cui abbiamo

tre geni ciascuno con due alleli. Spiega uno spettro di variazione in cui abbiamo 7 classi diverse.

Federico guglielmo di prussia era ossessionato da avere soldati altissimi quindi aveva favorito

matrimonio tra individui alti. Questo tipo di esperimento non è molto efficace perché gli alleli

avendo frequenza di 0,5 non tutti gli individui saranno omozigoti alleli grandi quindi

probabilmente gli individui grandi non saranno omozigoti per tutti i loci, saranno prevalentemente

eterozigoti anche perché i loci che interessano l’altezza sono più di cento. L’esito probabile di

questo tipo di matrimonio è la probabilità che i loci in omozigosi nei genitori diventino eterozigoti

nei figli, quindi saranno più bassi.

La prima regressione sull’ereditarietà della statura è stata fatta da Francis Galton il quale ha

introdotto che caratteri nei genitori non sono passati completamente alla loro progenie. Ma i

caratteri nei figli regrediscono verso il punto della media.

Regressione verso la Media nella popolazione:

Facendo la somma di tutti i fenotipi ottenuti per random

making nella popolazione ricostruisco la stessa

popolazione. Quindi la distribuzione dei figli è uguale a

quello delle madri. Per ogni classe fenotipica parentale, la

la progenie avrà fenotipo medio intermedio tra quello del

genitore considerato e il fenotipo medio della

popolazione. Per ogni classe fenotipica della progenie il

fenotipo medio del genitore è intermedio fra il valore del

figlio e la media della popolazione.

Troviamo anche dei caratteri Dicotomi in cui il fenotipo o

si presenta o non c’è. Ciò avviene nel caso di caratteri in cui servono un tot di alleli predisponenti

per avere il fenotipo (avviene nei caratteri malattia). Si

introduce un valore di soglia che se viene superata ci

permette di vedere il fenotipo. Considerando un individuo

che vive in una famiglia con un malato ha maggiore

probabilità di essere malato rispetto ad un individuo scelto

a caso nella popolazione. Queste malattie con alleli

predisponenti si sviluppano nelle famiglie. Infatti nel

grafico vedo come la soglia rimane la stessa ma nella

famiglia la probabilità di malattia è maggiore rispetto a

quella nella popolazione. Il threshold effect dice che solo

gli individui la cui suscettibilità supera una certa soglia

manifestano la malattia (con numero di alleli

predisponenti N>>x).

L’Ereditabilità ci permette di capire quanto della varianza è attribuibile a fattori genetici e quanto a

fattori ambientali, data la distribuzione normale. In una distribuzione normale, gaussiana, si

2

calcola la varianza come s , allora anche l’ereditabilità potrà essere calcolata come un valore al

quadrato. Il modello ideale prevede dei gemelli monozigoti per sperimentare quant’è l’ereditarietà

cioè quale quota è dovuta da fattori genetici e da fattori ambientali. Così avrei uguale la

componente genetica e posso vedere quella ambientale, facendoli crescere in ambienti diversi.

2

h = Hereditability = Vg/Vg+Ve = Vg/Vp. L’ereditabilità

viene definita come varianza genetica sulla varianza

fenotipica (che è dato dalla componente genetica più

quella ambientale).

Esempio: due linee pure di fagioli incrociate tra loro.

Nella F1 la varianza del peso è 1,5. F1xF1=F2 ha una

varianza di 6,1. Cerca l’ereditabilità del carattere peso

per F2?

Ci sono due strade per mappare i QTL: una si basa su incroci che però nell’uomo non sono fattibili

e l’altra sono studi di associazione.

Vediamo in primis gli incroci con un esempio in cui si fa l’analisi

della quantità di tricomi su delle foglie. Abbiamo due linee pure

nella generazione parentale. Faccio l’incrocio e ottengo una F1 con

fenotipo intermedio e poi faccio più incroci F2xF2 per più

generazioni così riesco a ricreare nuove linee pure diverse l’una

dall’altra dato che ho rimescolato i pezzi dei cromosomi originali.

Posso prendere le linee con lo stesso fenotipo e mi posso chiedere

quale porzione di cromosoma è comune a tutte le piante con la

stessa caratteristica. La regione uguale per tutte conterrà un tratto

che influenza questo carattere.

L’approccio alternativo è dato dagli studi di associazione genome-wide: GWAS. Si basano

sull’associazione fenotipo con varianti alleliche presenti nei casi rispetto ai controlli (es. per i casi si

intende chi ha il diabete, mentre i controlli sono gli individui scelti che non ce l’hanno). Ciò

presuppone che io non so lungo il genoma dove si collochi la variante che contribuisce a quel dato

fenotipo, devo

interrogare tutto il

genoma. Quindi servono

dei marcatori che si

distribuiscono su tutto il

genoma e poi li interrogo

uno a uno. Mi chiedo se

sul cromosoma 1, la

variante 1 che ho più

presente o meno nei casi rispetto ai controlli, la differenza è significativa e lo faccio per tutti.

Inizialmente disegno la distribuzione casi e controlli per capire quali siano le varianti genetiche che

portano al determinato fenotipo. Per approdare ad una regione del genoma dobbiamo coprirlo

tutto con i marcatori quindi ne servono molti allora si usano gli SNP cioè i single nucleotide

polymorphisms. Il marcatore è usato quando non riusciamo a distinguere tra più varianti, quelli a

singolo nucleotide sono i più comuni. La variante ci porta in una regione la quale può contenere

più geni poi dopo dovrò capire quale sia. Posso creare un grafico in cui sulle ascisse trovo i

cromosomi e sulle ordinate la significatività statistica della differenza della loro frequenza nei casi

rispetto ai controlli, che mi da una soglia di

significatività.

Esempio: se la variante gialla è più presente nei casi

rispetto ai controlli. Vedo una differenza statistica nei

casi e nei controlli, questa è significativa. Quindi posso

pensare che la variante gialla sia più predisponente al

diabete I della variante rosa. Questo

processo lo si può usare per: diabete di tipo I e II, livelli

di emoglobina fetale, morbo di Crohn, altezza, valori di

LDL e HDL, degenerazione maculare. Ad esempio nella

macular degeneration sono stati trovati tre loci che da

soli spiegano il 50% dell’ereditabilità. Mentre per

l’altezza ho 180 loci che spiegano solo il 12%

dell’ereditabilità. A novembre 2020 è stato fatto uno

studio su 4 milioni di persone e sono stati trovati 10000 loci per l’altezza con ereditabilità all’80%.

2) COME SI STUDIA IL GENOMA/GENE

Bisogna definire la struttura, funzione

e regolazione. A partire dal genoma

possiamo capire la sua sequenze,

studiarne la funzione, oppure cercare

di capire l’evoluzione della specie,

prevedere malattie geniche e come

contrastarle, posso vedere cosa

succede con l’overespressione di un

gene o un gene knockout o il rescuing

di un gene.

Il sequenziamento e l’analisi di interi

genomi si sviluppa con l’integrazione

di: mappature geniche attraverso la

linkage analysis cioè la localizzazione

di un gene su un cromosoma,

relativamente ad altri geni, usando incroci e genealogie e l’approccio bioinformatico per analizzare

il genoma degli organismi.

1. Genomica strutturale – genetica e mappaggio fisico dei genomi

2. Genomica funzionale – analisi delle funzioni geniche/regolative (annotazione del genoma)

3. Genomica comparativa – confronto dei genomi di diverse specie, storia evolutiva dei

genomi > Genomica evoluzionistica

4. Genomica medica- polimorfismi, geni malattia, variabilità genetica, farmacogenomica

Esempio: progetto di sequenziamento del genoma umano (1990-

2003)

Sono stati usati due approcci logici diversi:

→ Mappatura sequenziale per allineamento progressive dei

frammenti sequenziati

È lento ma abbastanza accurato (Consorzio pubblico).

Nella mappatura si ha la divisione del genoma in segmenti e il

consorzio aveva poi dato alle diverse nazioni delle parti di

cromosomi. Si fa il clonaggio in vettori e vengono sequenziati. Le

sequenze sono state assemblate sulle mappe con enzimi di

restrizione e sulla sequenza in sé. Dove ci sono dei buchi vengono

risequenziati e quindi si rifinisce la mappa.

→ “Shotgun”: rottura casuale del genoma, sequenziamento e

allineamento al computer delle sequenze dei

frammenti ottenuti

è più veloce ma imprecise: problema sequenza

ripetute, che si trovano in tutto il genoma (Celera

corporation, Craig Venter).

Rompo meccanicamente il genoma e lo faccio correre

su un gel di agarosio e isolo frammenti con circa la

stessa lunghezza che può essere facilmente

sequenziata. Vengono assemblate e sovrapposte le

sequenze. Ma si potrebbero fare errori con le

sequenze ripetute. Ma il

genoma

umano non

è mai stato

sequenziato completamente. Quella del 2003 è stato il

primo draft di sequenziamento. Subito dopo di questo è

partito il progetto 1000 genoma che deriva dal

confronto delle sequenze di diversi individui che hanno

portato al catalogo della variazione umana. Si pensa che nel 2025 le nozioni di genetica saranno

maggiori dei tre maggiori produttori di informazioni: twitter, youtube, astronomia.

Per maneggiare la mole di dati è usata la bioinformatica che è data da

matematica+genetica/computer. È usata per: Identifica geni entro la sequenza completa del DNA,

allinea e confronta sequenze geniche in un database per determinare la funzione, predice

struttura e funzioni dei prodotti genici, descrive interazioni tra geni e prodotti genici e stima

relazioni filogenetiche e di popolazioni. Ha permesso di capire che ogni circa 300bp c’è una

variazione. Il genoma un singolo individuo è unico (tranne quello dei gemelli monozigoti e degli

organismi clonati).

Ad esempio su PubMed troviamo: la struttura del genoma, contenuto di DNA e numero di geni

(anche a confronto con quello di altri organismi), gli elementi non-codificanti conservati (sequenze

regolative, promotori..), non-coding RNA, idea della trascrizione e variazione genomica e la storia

genetica della nostra specie (pelle chiara è recente data dalle popolazioni che si sono trasferiti al

nord dove c’è meno sole).

Per studiare la struttura del gene è necessario ottenere la sequenza di DNA che lo contiene. Per

isolarlo si usano le librerie a DNA che è una collezione di frammenti di DNA che è rappresentativo

della cellula che vogliamo studiare. Per costruire la libreria devo scegliere il vettore di clonaggio

che voglio usate ed è definito come una piccola molecola di sequenza nota, con replicazione

indipendente dalla cellula nota, marcatori che permettono il riconoscimento della cellula

trasformata e presenti in più copie per cellula (alto o basso numero). La scelta del vettore deriva

dalla considerazione della lunghezza che questi vettori possono ospitare, in ordine crescente:

,

plasmidi (10 kb), Fago cosmidi, YACs (Yeast artificial chromosomes) e BACs (Bacterial artificial

chromosomes). Supponendo di voler clonare un gene umano, si cerca di capire la dimensione

media di un gene cioè circa 50 kilobasi. Se uso un plasmide che contiene massimo 10kb, il gene

viene spezzettato e lo dovrò dopo ricostruire. Se uso BAC che contiene 500kb, oltre al mio gene

avrà altre sequenze e dopo aver isolato il clone dovrò fare un lavoro di sub-clonaggio per isolare di



nuovo la sequenza che mi interessa. Per la costruzione di libreria vengono spesso usate le Fago

che contiene circa 15kb.

Il plasmide ha l’origine di replicazione per la loro

moltiplicazione nei batteri, poi un marcatore di selezione

che da

resistenza

all’antibiotico,

il sito di clonaggio è il multiple cloning site. C’è anche la

selezione colore in cui se non c’è inserto, il gene intatto

LacZ è intatto e può metabolizzare il substrato X-gal a

dare un composto blu in presenza dell’induttore IPTG

originando Colonie Blu mentre se c’è l’inserto, il gene

LacZ è interrotto e si ottengono Colonie Bianche. Così

dovrò cercare di isolare i cloni che contengono il mio

gene di interesse.

Abbiamo però detto

che per le librerie

genetiche viene preferito il Fago lambda, un virus batteriofago. È

usato come vettore perché nella sua vita è in grado di svolgere

due cicli: ciclo litico in cui si ha l’infezione e lisi della cellula

batterica con il rilascio di nuove particelle fagiche e il ciclo

lisogenico in cui si ha l’integrazione del genoma del fago nel DNA

della cellula ospite. I geni che controllano il ciclo lisogenico (circa

15kb) possono essere rimossi (non essenziali per la sopravvivenza

di lambda) e sostituiti con l’inserto di interesse. Tanto tolgo e

tanto riesco a rimettere, infatti il Fago è in grado di scegliere

frammenti di genoma di una lunghezza tale da riempirlo.

Fago lambda e il DNA che deve essere clonato vengono digeriti con lo

stesso enzima di restrizione, in questo caso EcoRI. Si separa lambda

in due braccia e vengono eliminati i geni del ciclo lisogenico che non

servono alla replicazione e all’interno di lambda vengono clonati i

frammenti dal genoma di interesse. Così ricostruisco un frammento

di DNA con circa le dimensioni originarie di quelle del fago lamba e

verrà inserito nel capside virale della testa del fago e produrrà

nuove particelle virali. Il sistema funziona perché all’estremità delle

due anse del fago ci sono le sequenze COS, sono sequenze coesive che mediano

l’introduzione del DNA all’interno del fago, sono riconosciute dal sistema

di impaccamento nel capside. Nell’esperimento in vivo si forma uno

strato uniforme di batteri e su questo si formano le placche di lisi (particella virale

che porta un diverso inserto) su cui il fago agisce.

I Cosmidi plasmidi artificiali in cui sono inseriti frammenti di DNA di

lambda, contenenti le sequenze «cos» (cohesive). Poi ci sono i BAC, PAC e

infine YAC.

Il cDNA è il DNA che è stato retrotrascritto a partire dall’RNA grazie alla

trascrittasi inversa. La libreria di cDNA è una collezione di frammenti di

cDNA clonato (DNA complementare) inserito nei vettori, rappresentativo

del trascrittoma della cellula data. La libreria di cDNA è l’immagine del

trascrittoma di qualla cellula in quel dato momento dello sviluppo. Sono

differenti le librerie di cDNA prese in due momenti diversi dello sviluppo.

Il cDNA deriva dall’mRNA quindi ogni cellula esprime un proprio

repertorio di mRNA diverso tra le varie cellule. Quindi il cDNA varia da

tessuto a tessuto e a seconda del momento nello sviluppo. Il process