Genetica II - Appunti

Silenziamneto di un gene

2a) RNA interference (RNAi)

Il meccanismo dell'RNAi è presente in tutte le cellule degli organismi multicellulari. Le molecole dsRNA sono processate in corti RNA a singolo filamento dal complesso enzimatico citoplasmatico DICER, che vengono indirizzati al RNA-induced silencing complex (RISC). RISC media il legame sequenza specifico del siRNA sulla sequenza complementare del mRNA bersaglio corrispondente, impedendone la traduzione attraverso 2 meccanismi. Quindi l'interazione con il microRNA che è stato generato può avere due esiti diversi: blocco della traduzione o degradazione dell'RNA. In entrambi i casi mi porta a ridurre il livello di proteine.

Quando il miRNA si appaia perfettamente alla sua sequenza target, l'mRNA è degradato mentre nel caso della complementarietà imperfetta si blocca la traduzione. Vent'anni fa è stato fatto l'esperimento in cui si era visto che era possibile usare

lato terapeutico, l'RNA interference può essere utilizzato per trattare malattie genetiche o per bloccare l'espressione di geni coinvolti nello sviluppo di patologie come il cancro. Inoltre, l'RNAi può essere utilizzato come strumento di ricerca per studiare la funzione dei geni e identificare nuovi bersagli terapeutici. L'RNA interference è un processo naturale che si verifica nelle cellule di mammifero e svolge un ruolo chiave nella regolazione dell'espressione genica. Questo meccanismo coinvolge l'interazione di diversi complessi proteici e molecole di RNA. Inizialmente, un doppio filamento di RNA (dsRNA) viene riconosciuto e tagliato in frammenti più piccoli da un enzima chiamato DICER. Questi frammenti di RNA a doppio filamento vengono poi caricati su un complesso chiamato RISC (RNA-induced silencing complex). Il complesso RISC si lega a un singolo filamento di RNA (ssRNA) complementare all'mRNA bersaglio. Questo legame tra l'RNAi e l'mRNA causa la degradazione dell'mRNA o blocca la sua traduzione in proteina. Di conseguenza, il gene corrispondente viene silenziato e la proteina non viene prodotta. Per confermare l'efficacia dell'RNAi nel silenziare un gene specifico, i ricercatori utilizzano tecniche come l'immunofluorescenza o il western blotting per rilevare la presenza o l'assenza della proteina bersaglio. L'uso dell'RNAi come potenziale terapia ha suscitato un grande interesse nella comunità scientifica. Gli scienziati stanno cercando di sviluppare RNAi stabili e specifici per bloccare l'espressione di proteine indesiderate. Inoltre, si sta lavorando per creare una libreria di RNAi che possa essere utilizzata per silenziare tutti i geni nel genoma, al fine di identificare nuovi bersagli terapeutici o studiare la funzione dei geni. In conclusione, l'RNA interference è un potente strumento per silenziare geni specifici e può essere utilizzato sia come strumento di ricerca che come potenziale terapia per diverse malattie.Caenorhabditis (nematode) era stata usata una library che era in grado di silenziare il 86% del suo genoma. È interessante vedere come la libreria era stata costruita su base batterica e il cibo del Caenorhabditis sono proprio i batteri. Creo una feeding library perché do da mangiare al nematode i batteri che portano i diversi RNAi. Seleziono i fenotipi che mi interessano e vedo quale RNAi ha mangiato in modo tale da ricollegare il fenotipo con il gene che è stato silenziato. Ciò mi permette di fare un'analisi sistematica per perdita di funzione di gene. Vedo quale gene controlla quale fenotipo. Per fare il knock-down di un gene posso usare il meccanismo dei microRNA. Ci interessa anche il significato e il ruolo del meccanismo endogeno generale. Era stata vista l'importanza dei miRNA per quanto riguarda l'espressione genica endogena. I miRNA sono codificati dal genoma, derivano da intermedi a doppio filamento che vengono poi processati e hanno un ruolo.fondamentale nella regolazione genica: alcuni sono evolutivamente conservati e alcuni sono tessuto-sviluppo specifici. I microRNA rappresentano circa 1-2% RNA totale, quindi una porzione elevata, e regolano circa 30% dei geni. La scoperta del microRNA ci introduce al sistema modello della genetica che è Caenorhabditis che è caratterizzato da quattro fasi di sviluppo larvale prima di quello adulto. Si studiò il passaggio dalla fase larvale L1 a L2 in cui la proteina LIN14 scompare, mentre un mRNA (LIN4) aumenta. Per vent'anni si è andata a cercare la proteina codificata da LIN4. Cerco di capire la regolazione tra LIN14 e LIN14 chiedendomi se la perdita di funzione di LIN14 ha lo stesso fenotipo dell'overespressione di LIN4 e viceversa: LIN4 reprime LIN14. Non si è trovata per anni la proteina codificata da LIN4, ma allo stesso tempo nella transizione tra L1 e L2 si vedeva che la proteina LIN14 (blu) scende, il miRNA di LIN4 sale e invece l'mRNAdiLIN14 rimane stabile. Quest'ultimo è strano in quanto mi aspetterei che l'mRNA scenda insieme alla sua proteina. Vuol dire che c'è una regolazione post-trascrizionale sull'mRNA quindi ho un miRNA LIN4 che regola l'RNA di LIN14. A questo punto vado a vedere se c'è qualche informazione nelle sequenze che mi possa suggerire un possibile meccanismo di regolazione e vedo che LIN4 codifica per un RNA di 63 nucleotidi che viene processato a dare un ventiduimero che si appaia con l'RNA di LIN14 a meno di una sequenza. Capisco che LIN4 può bloccare la traduzione di LIN14, agisce dopo il riconoscimento dell'mRNA di LIN14. Non serve più capire la proteina di LIN4, capisco che dato che si appaiano il miRNA e l'mRNA di LIN14 che è un meccanismo basato solo sugli RNA. Da questo meccanismo capisco che un miRNA può regolare più geni contemporaneamente basta che abbia una sequenza che venga riconosciuta. Siscoprì che nel nematode tutto il suo sviluppo èregolato da una serie di miRNA che sono espressi in stadi precisi e fanno sincronizzare e avvenire tutte queste transizioni. LIN4 reprime LIN14 e LIN28. Andando avanti passo a L2 in cui viene trascritto Let7 che reprime LIN41 e quindi si progredisce allo stadio successivo. È un meccanismo di regolazione post-trascrizionale sull'RNA. Questo meccanismo è stato poi provato su altri organismi e si è visto che avveniva anche in essi. Per quanto riguarda l'uomo inizierei vedendo la comparazione delle sequenze. Posso vedere se trovo dei geni che sono deputativi target sulla base della presenza di sequenze complementari sul loro mRNA a quelle del miRNA. Quindi, dopo aver ricercato l'omologia, predetto i geni target, posso fare degli studi funzionali anche sui miRNA (overespressione o silenziamento). I miRNA sono coinvolti in numerosi processi cellulari, inclusi sviluppo, differenziamento, proliferazione.apoptosie risposta a stress ambientali. È stato visto in topo che Let7 è conservato e presumibilmente anche gli altri e che hanno funzionitessuto-specifiche, quindi fungono da selettori. Faccio un sistema reporter dove nell'UTR metto le sequenze target di Let7. Se nelle cellule in cui Let7 è presente, miRNA si legherà alle sue sequenze target, allora verrà impedita la produzione della proteina e quindi non avrò la colorazione blu, ma quella bianca. Mentre se il miRNA non c'è, ci sarà la produzione della beta-galattosidasi e otterrò il colore blu. Dimostrò che Let7 ha un omologo nei mammiferi e vedo che espresso negli abbozzi degli arti quindi posso calcolare la regolazione dei miRNA e dei loro target. La regolazione dei miRNA è: on/off di un target, regolazione fine di un target e può controllare più geni contemporaneamente (differenziamento e processi di sviluppo).

Chiedo se ci sono delle evidenze genetiche che i microRNA influenzano il fenotipo. Una mutazione nel miRNA non riconosce più i suoi target, ma magari ne riconosce degli altri, regola dei geni che non sono i suoi target fisiologici. Invece, se si ha la mutazione di una sequenza target di un miRNA dentro l'mRNA, un gene potrebbe sfuggire alla repressione oppure la repressione di un altro gene.

Correlazione miRNA e fenotipo, esempi:

1. Pecora Texel -> mutazione che crea un nuovo target (target "illegittimo" per un miRNA) -> muscolatura dei glutei. È una QTL, le varianti dei loci influenzano quantitativamente il fenotipo. Incrocio le Texel con le Romanoff (carnosità normale) e ottengo una F1. Le F0 sono omozigoti per due diverse varianti (AAxaa) e ottengo eterozigoti Aa nella F1 che avranno un fenotipo intermedio. Riincrociando le F1 si riottennero nella F2 i fenotipi omozigoti AA e aa. Devo ristabilizzare il carattere quindi faccio molti incroci.

Per ottenere le linee ricombinanti pure, posso vedere quale è la regione omozigote in comune nei cromosomi. Il crossing over avviene in maniera casuale e quindi porterà a più assetti diversi, quindi posso vedere quali sono le regioni in comune in omozigosi del cromosoma delle pecore con il fenotipo texel. Vedo delle varianti di una regione sul cromosoma 2 in omozigosi delle pecore texel che è assente nelle romanoff. In questa regione c'è il gene per la miostatina che controlla la dimensione del muscolo (blocca la crescita). Mi aspetto che il gene sia inibito nelle pecore texel, non avendo il blocco aumenta il muscolo. A questo punto faccio un confronto con altri organismi e se ci sono mutazioni o varianti. Esistono le mucche di razza piemontese. Poi faccio la prova del nove col topo normale e quello knock-out per il gene della miostatina. Per capire molecolarmente confronto le sequenze della parte codificante tra quelle della pecora romanoff e texel.

Ma non avendole devo controllare nelle sequenze regolative. In questo caso è stata presa la sequenza in cui c'è il gene della miostatina e vado a vedere se ci sono varianti, SNP che sono proprietari della variante texel e assenti nelle altre varianti. All'intorno del gene della miostatina ho 20 SNP/varianti, 18 le escludo perché sono presenti in razze che in omozigosi non presentano il carattere meatness. Delle due rimanenti, una si trova a 2,5 kilobasi dal sito di inizio della trascrizione (potrebbe essere una regione regolativa). Vedo che questa casistica si trova nel 98% delle texel e nell'11% delle romanoff, quindi non è molto esclusiva. Invece l'ultimo SNP si trova nel 3'-UTR che è presente nel 99% delle texel e nell'1% delle romanoff. È texel specifico. Vuol dire che per silenziare la miostatina interviene un miRNA che riconosce una sequenza detta target illegittimo. Lo SNP ha creato un sito di legame per un legame.che non ci doveva essere, per cui illegittimamente, il miRNA controlla la miostatina. Per provare la mia ipotesi vado a vedere quali sono i miRNA complementari alla sequenza del sito di interesse, mi concentro su quelli complementari nel tessuto muscolare. Ottengo il miRNA1 è espresso ad alto livello nel muscolo ed è conservato (come seq. ed espressione) in specie diverse. Si crea un sito target di miRNA che riduce il livello di miostatina. Creo un gene reporter e metto nel 3'-UTR la sequenza che è target del miRNA per entrambe le varianti. Vedo che nelle texel viene silenziata dal miRNA1. ii) Forme sordità nell'uomo -> mutazione nel miRNA che riconosce nuovi targets "illegittimi". Posso fare uno studio di associazione genome-wide in famiglie in cui è presente sordità, escludendo tutti i geni già noti. Interrogo il genoma per ogni SNP nella coorte dei sordi/casi rispetto ai controlli. Vedo che lo SNP giallo potrebbe avere a

Che fare col fenotipo sordità essendo più significativo tra i sordi. Vado