Appunti di genetica avanzata

SNP: Polimorfismi a singolo nucleotide

SNP, ossia dei polimorfismi a singolo nucleotide, che sono una frazione piccola del genoma. Tutt'oggi un modo per analizzare gli SNP è sia genomewide, sequenziare il genoma oppure utilizzare delle sonde su macroarrays che riconoscono più punti del genoma con SNP scoperti precedentemente sequenziando il genoma di alcuni individui e andando a vedere i punti dove si ibrida più o meno e quindi determinando il pannello di SNP genowide, su tutto il genoma. Un modo che è informativo comunque per una diagnosi è quello di andare a ricercare specifici SNP che so essere importanti per esempio diagnosi di malattia genetica/sensibilità a farmaci. Per far questo ci si può avvalere di pCR e sequenziamento zona amplificata o PCR realtime, sonda in taqman che identifica lo SNP. Di SNP ce ne sono una marea, ci fu un progetto che fu chiamato "HapMap", con lo scopo di mappare le mutazioni puntiformi sul genoma umano. Da un lato, si possonoutilizzare per individuare se quel campione è dell'individuo A o individuo B, altro aspetto è associare uno SNP a un fenotipo. Quindi, per esempio, a una malattia, se la malattia è monogenica e la malattia è legata a uno SNP allora io posso avere un marcatore diretto della malattia, quindi tipizzo la presenza di quello SNP e posso dire subito se quell'individuo è malato o sano ma se la malattia è poligenica, cioè è una malattia che è legata all'effetto di più geni, più zone del genoma, potrebbero essere anche promotori che collettivamente generano uno squilibrio in qualcosa, in un prodotto funzionale, via metabolica, che poi conferisce il fenotipo malato. A quel punto, allora la diagnosi, dovrebbe essere fatta sul pannello intero degli SNP, se sono concomitanti nello stesso tempo, se non ci sono tutti, la malattia è presente o meno. A questo punto le cose si complicano, perché sempre

più si passa dalla presenza/assenza di uno SNP o meglio potrei sviluppare quella malattia con una maggiore probabilità rispetto a qualche individuo che non abbia quello SNP. Questo è un po’ quello che si sta tentando in ambito biomedico, cioè identificare dei pannelli di SNP da poter utilizzare per associarli a dei fenotipi, fenotipi che vanno da malattie che hanno una base genetica ma non mendeliana, malattie poligeniche, ad esempio avere frequentemente attacchi cardiaci o più frequentemente la possibilità di insorgenza di diabete o di possibilità di sviluppare una infezione da coronavirus. Hapmap per mappare la diversità aplotipica umana, di per sé non è applicativo ma le ricadute sono enormi, perché permettono di avere un database su cui fare analisi statistiche. Quindi raggruppare poi individui in delle coorti sulla base di vari fattori, che si possono individuare per capire se c’è un pannello di

mutazioni che aumentano la predisposizione a certi fenotipi. RAPD Altra tecnica: tecnica molto vecchiotta (1990), basata su pcr, è stata la prima tecnica di scanning genomewide basata su PCR; è ormai molto raramente utilizzata perché si è dimostrata poco riproducibile. Il principio su cui si basa se hai primer corti (10 basi), (normalmente è 20 basi), non si disegnano perché loro annilano in una certa zona del genoma, sono pannelli di primer disegnati a caso di 10 basi e poi si fa una pcr con uno solo di questi primer. Vi mettete in delle condizioni così di pcr cosiddette di bassa stringenza, cioè il primer sintetizzato si può legare anche se c'è un po' di mixmatch perché si utilizza una temperatura così bassa che anche soltanto alcuni legami a ponte di idrogeno fra quelli possibili delle basi sono formati. Questa temperatura bassa di annealing a volte da e per aumentare quella instabilità.delprimer sullo stampo, c'è possibilità di stabilizzarlo in presenza di una enormità di mixmatch, si aumenta il magnesio cloruro nella miscela di pcr , magnesio cloruro che ha un effetto come sale aumentando la concentrazione stabilizza dei legami non perfetti tra basi adiacenti. Il primer può legarsi dappertutto. È plausibile che il primer possa annilarsi in punti diversi anche in orientamento opposto: nella zona 1. Si possono generare dei prodotti di amplificazione pcr, con un unico primer, perché basta che lui si attacchi in delle zone, non troppe volte non troppe poche. Tutte quelle che possono essere mutazioni a livello del genoma (delezioni, inserzioni etc..), traslocazioni, inversioni. Mutazioni puntiformi possono essere visualizzate con quest'approccio. Quindi è un marcatore di tipo dominante, se l'individuo fosse eterozigote questo profilo di bande non si capisce chi è cose.. Nel momento in cui ho una

presenza,se quella presenza è dovuta a due presenze, due allelici identici che migrano insieme posso avere una banda più luminosa ma non si riesce a discriminar granché. Se quella banda è generata da uno stampo o da un doppio stampo, io non lo posso sapere, non vedo eterozigoti e quindi il marcatore è dominante.

AFLP, ampflied fragment lenght polymorphism, uscandaglia il polimorfismo su tutto il genoma e funziona in maniera buona, cioè è abbastanza riproducibile. È utilizzato per la genotipizzazione di piante e quindi per fare della genomica di popolazione di piante, in assenza del genoma sequenziato di quelle specie:

• Si prende il dna e si frammenta con enzimi di restrizione, dopodiché si avrà una marea di frammenti digeriti, si selezionano alcuni.
• Selezionare alcuni frammenti a caso, ipotizzando che, in questa selezione, qualche frammento polimorfico ci tocchi.
• Si selezionano attraverso adattatori che vengono

ligati sui siti di restrizione e sugli adattatori si disegnano dei primer, primer che sporgono dall'adattatore verso il frammento che noi non conosciamo per qualche base, tipo tre basi TCA. Questi primer amplificheranno soltanto quei frammenti che ai lati dei siti di restrizione hanno la sequenza TCA. Amplificando con questi primer, si seleziona poi una sottopopolazione di frammenti digeriti casualmente, selezionando quelli che iniziano con quella sequenza corta. Questo permette di ottenere un numero leggibile di bande, da una decina a qualche centinaio, che si separano attraverso un'elettroforesi. Si sequenziano tramite il sequenziatore automatico, cioè il sistema con la policriammide, quindi si fa migrare il nostro amplificato PCR e si fa il sizing. Per poterlo vedere, è necessario che un marker sia collegato a un fluorocromo. In questa maniera si ottiene un profilo di bande, confrontando questo profilo di bande tra individui diversi, si trova che questi.

profili sono differenti. Tante più bande saranno a comune tra due individui tanto più saranno genomicamente simili per zone che sono anonime, non sono amplificate.

Tecnica robusta, ad alta astringenza, marker fanno annealing a 60 gradi e quindi è anche riproducibile.

Stesso cromatogramma dei minisatelliti, con la differenza che in quello ci si aspetta due picchi su ogni locus, i due alleli dei due genitori, che stanno sui cromosomi omologhi. Se si fa una corsa su più loci, ci si aspetteranno tante bande per quanti loci si sono analizzate al massimo moltiplicate per due se ogni locus è eterozigote.

RADSEQ

La variante NGS dell'aflp è il RaDseq, ed è abbastanza utilizzato in chi si occupa di studio della variabilità genomica in organismi non modello, quella che si chiama ecologia molecolare. Quindi per fare uno scanning in cui mentre nell'AFLP, non si sa questi picchi a cosa corrispondono, nel RADseq si ha la sequenza di

Un frammento, avere la sequenza del frammento può significare identificare che geni possono essere presenti in quel frammento. Quindi, si può conoscere in che posizione del genoma, a carico di quali geni può esserci il polimorfismo, perché il polimorfismo può essere neutrale selettivamente, cioè siamo diversi perché la polimerasi e il sistema di ricombinazione genetica creano variabilità. Nel radseq:

• il genoma viene tagliato da enzimi di restrizione,
• dopodiché si liga il frammento digerito con degli adattatori.

Quindi la ligazione viene fatta con degli adattatori che sono diversi per ogni campione, cioè che hanno sia una porzione che si lega al campione sia una porzione diversa per ogni sequenza che viene utilizzata che distingue un barcode molecolare. Quindi se si sequenziano insieme 10 campioni, si avranno 10 tipi di adattatori diversi che hanno 10 barcode diversi. Quindi si lega il frammento digerito a questi.

uso di tag html per formattare il testo:

Adattatori che permettono il sequenziamento. A quel punto si effettua il sequenziamento.

Dopo aver effettuato il sequenziamento si ottengono delle reads che si vanno a confrontare e si otterranno reads in cui non si ha solo un'informazione di presenza/assenza di una banda ma anche di tipo genetico molecolare, so quali geni sono nella zona polimorfica. Si possono utilizzare enzimi di restrizione canonici R1, bam H1 ma si possono anche misurare in questa maniera la modifica di tipo epigenomico sul genoma, perché si possono utilizzare isoschizometri, enzimi di restrizione che tagliano lo stesso sito ma che possono avere differente capacità di taglio a seconda che il sito sia metilato in citosina oppure no.

Quindi una tecnica che ha diverse potenzialità non soltanto sul polimorfismo genetico, anche sugli studi di carattere epigenotipo. È più interessante fare questo tipo di sequenziamento che il sequenziamento di un genoma completo, perché qui si fa uso di adattatori che permettono il sequenziamento.

Non tutto il genoma ma soltanto quei frammenti che hanno i siti di restrizione abbastanza vicini da permettere un sequenziamento illumina. Sono quei siti che sono vicini non più di 300 basi, limite nel sequenziamenti Illumina. Saranno pochi relativamente. Vantaggio dell'amplicon sequencing, sequenziamento degli ampliconi anziché del genoma completo. Sequenziare ampliconi corti costa meno, perché si sequenzia meno DNA.

Diversità genetica

Quando si utilizzano queste tecniche, ci possono servire perché si è curiosi di sapere le popolazioni, le specie a chi sono imparentate, da dove sono venute fuori, dove si sono evolute e quali rotte di migrazione hanno seguito, quindi la storia naturale, studi di coorte (sano-malato), identificare la base genetica di differenze fenotipiche, cioè base genetica di malattie. Se si ha un test diagnostico, si può identificare il fingerprinting, su individui su razze e ceppi, aspetti applicati di diagnostica.

di laboratorio. Luigi Luca Cavalli-Sforza è tra i fondatori della genetica umana. Si è interessato di geni e del fatto che c'è un fenotipo che noi portiamo addosso, con caratteristiche lamarckiane ed è