Appunti di genetica avanzata

Genetica avanzata

La genetica studia l’effetto dei geni. Genetica inversa: io decido chi è il gene implicato in qualcosa. Chiaramente, dal gene poi il gene codifica un prodotto funzionale (RNA, proteina). Quindi poi, si entra nell’ambito della biologia molecolare. L’approccio genetico è quello di andare a indurre delle alterazioni a livello dei geni e vedere che effetto che fa, perché lo scopo è andare a vedere come siamo fatti. Non possiamo, però, manipolare tutti gli organismi, perché non tutti gli organismi si prestano a essere manipolati.

In alcuni casi, si utilizzano organismi modello. Un organismo modello permette di approcciare un problema in maniera sperimentale quando il problema è rilevante ma non in quel modello lì ma in un altro sistema nel quale non possiamo agire alla stessa maniera. Ad esempio, la ricerca di geni candidati malattia, che posso cercare in umano, posso associare probabilisticamente un gene a una malattia ma la conferma sperimentale io la posso ottenere con degli animali modello nei quali induco quella mutazione o che tratto con quell’agente e vedo la risposta. A quel punto, ho la prova che quei geni causano.

La genetica e i modelli teorici

C’è un’altra accezione del termine modello cioè un modello è una costruzione teorica, è uno schema teorico che deriva dai dati sperimentali, per esempio il modello dell’espressione genica. È il modello che dice che un fattore trascrizionale si lega a una zona che chiamiamo promotore, sito di legame del fattore trascrizionale, il quale questo legame del fattore trascrizionale permette a una RNA polimerasi o al complesso dell’RNA polimerasi (a seconda della tipologia di organismi), di conoscere meglio la zona del promotore (avere una affinità maggiore per la zona promotore) e, di conseguenza, far partire la trascrizione. Questo è il nostro modello, così come il modello di trascrizione del segnale con i secondi messaggeri o che preveda il calcio piuttosto che l’AMP ciclico o le cascate di fosforilazione o tutto insieme.

La modalità con cui la scienza procede è questo: hai dei dati, li raccogli, ti immagini come potrebbe essere insieme ad altri condizionato anche dal periodo storico. I dati forniscono idee, sono le intuizioni a dare un modello. Con nuovi dati o si confuta il modello precedente e se ne propone uno nuovo o si aggiungono dei dettagli al modello precedente.

Il dibattito nella filosofia delle scienze biologiche

Il dibattito nella filosofia delle scienze biologiche, come la genetica si rapporta agli organismi. Due modi classici, antitetici sono stati dalla filosofia greca in poi:

• Modalità riduzionista ossia il riduzionismo è il fatto che puoi studiare un sistema suddividendo il problema complesso in tanti problemi semplici affrontabili singolarmente, dalla soluzione dei quali scaturirà la comprensione del tutto. Quindi un problema biologico può essere riassunto in esempi e problematiche trattabili in ambito chimico e fisico. La biochimica è un esempio di questo.
• Modalità olista o system oriented (che vede la complessità biologica non spezzettata nelle singole parti ma come un tutto che dobbiamo trattare). Questo è sfociato nel vitalismo cioè che c’è un principio vitale o qualcosa all’interno degli elementi che non erano soltanto gli elementi lì ma c’era qualcos’altro. Visione attuale dell’olistica biologia dei sistemi.

Il dogma centrale della biologia

Il dogma centrale della biologia è dal DNA all’RNA alle proteine ma non è un dogma, perché dogma significa verità inviolabile e in scienza un dogma non è una parola che può esistere, può essere al massimo un modello. Questo dogma ha delle eccezioni, la trascrittasi inversa viola il dogma, perché si passa dall’RNA al DNA.

Storia dei geni

Fu soltanto, nell’anno 1900, che indipendentemente da Mendel, altri ricercatori cercando di capire come era fatta l’ereditarietà dei caratteri, nel 1900, si riscoprono le leggi di Mendel e non si capisce dove si trovano i geni. Si scopre che le cellule hanno un nucleo, che hanno delle strutture dentro al nucleo che si colorano in certe fasi del ciclo cellulare, queste strutture sono i cromosomi (corpiccioli che si colorano). I cromosomi si dividono in maniera equa nelle cellule figlie, durante la meiosi il numero cromosomico si dimezza, sembra che i cromosomi seguano quelle regoline che Mendel aveva scoperto.

Per capire se i geni stavano sui cromosomi, deve essere congegnato un esperimento, per cui si sceglie un altro organismo, più manipolabile, come la Drosophila. È un ottimo organismo modello, perché facilmente manipolabile. Inoltre, ha i caratteri dicotomici, da scegliere. Furono allevate Drosophila che presentavano caratteristiche dicotomiche: occhi bianchi/rossi, ali piccoli/grandi. Si scopre che i cromosomi non sono tutti uguali, ma alcuni cromosomi sono più riconoscibili, grazie anche a colorazioni biochimiche, al microscopio: cromosoma X e cromosoma Y.

Ci si accorge che ci sono degli individui di Drosophila che presentano alterazioni morfologiche nel cromosoma. Quando c’è un’alterazione citologica, osservabile dal microscopio, l’individuo che porta l’alterazione cromosomica ha anche un fenotipo diverso. A questo punto, Sturtevant prova a fare l’incrocio e vedere se c’è una cosegregazione (se il fenotipo particolare con il cromosoma più piccolo aberrante vanno insieme) e questa cosegregazione permette di ipotizzare che i geni stanno sui cromosomi. Questa fu la dimostrazione che i geni stanno sui cromosomi, che sono dei corpiccioli lineari e stanno in ordine lineare sui cromosomi, uno dietro l’altro.

Sturtevant scopre la ricombinazione genetica ossia che i geni stanno sui cromosomi, sono disposti in maniera lineare, uno dietro l’altro e gli alleli di uno stesso gene possono scambiarsi tra cromosomi omologhi. Ci si accorge che per alcuni caratteri la ricombinazione è frequente, per altri è più rara, caratteri che si trovano legati allo stesso cromosoma. Sturtevant scopre che ci sono diversi gruppi di linkage, cioè di collegamento di legame, il gruppo di linkage è quel gruppo di geni che non segrega indipendentemente, si trova sullo stesso cromosoma. Da lì formula l’ipotesi poi confermata, che l’entità della ricombinazione corrisponda alla distanza alla quale si trovano i geni che tra loro ricombinano, maggiore è la distanza sul cromosoma e più è probabile ci sia uno scambio fra frammenti cromosomici di un segmento cromosomico.

Se i geni sono molto vicini, la probabilità che lì nel mezzo a questi due geni avvenga la ricombinazione, è estremamente rara. Questa distanza tra i geni lungo il cromosoma non associata a nessuna molecola biologica, gli viene data un’unità di misura che è il centimorgan. Un centimorgan corrisponde alla frequenza di ricombinazione. Essendo una frequenza, è un numero di eventi diviso 100.

Il termine gene è stato inventato da Johansen poco dopo, un botanico, e fu utilizzato il termine gene riprendendo spunto da un termine che aveva utilizzato Darwin. Per il quale, la trasmissione dei caratteri era legata a dei pangeni, che venivano trasmessi tra i genitori all’atto della riproduzione e questi pangeni in realtà cambiavano anche nel tempo. In onore quindi di Darwin, Johansen decise di chiamare questo qualcosa che si trasmetteva dai genitori ai figli, nel quale risiedeva l’informazione che permetteva di avere un certo fenotipo, lo chiamò gene. Il gene è un qualcosa che viene preso a caso durante la formazione dei gameti ed è ciò che determina il fenotipo. Per cui, i geni sono i determinanti fenotipici.

Alla fine degli anni ’40 si arriva a capire che i geni stanno sui cromosomi e soltanto con l’avvento della biologia molecolare, si capisce che i geni vengono trascritti. Quindi i geni sono delle regioni del genoma, trascritte che determinano una proteina, perché sempre in quegli anni viene scoperto che i geni codificano per proteine, la teoria un gene-un enzima. Ci sono prime evidenze che alterazioni geniche in umano possono corrispondere a delle alterazioni biochimiche, Nel 1942 circa ad opera Beatle e Tatum, Beadle e Tatum uniscono l’analisi biochimica con la genetica. Loro cambiano anche organismo modello, usano come organismo modello un microrganismo, la neurospora crassa, muffa che si sviluppa sul pane. Utilizzando neurospora crassa e i suoi mutanti, si capisce che questi mutanti mancano di enzimi, si propone la teoria un gene un enzima.

Parallelamente si scopre che il DNA è il materiale genetico, dove stanno questi geni Harvey e Mcleod. Si deve arrivare agli anni ’50 con Hersey e Chase che utilizzando gli isotopi radioattivi fosforo e zolfo che permettono di evidenziare che ciò che infetta la cellula è il fosforo e non lo zolfo, quindi il materiale genetico è legato al fosforo che non è presente nelle proteine ma negli acidi nucleici. Organismo modello un batterio, fago. Benzer, sviluppa il cistrone, il test di cis e trans e dopo averlo sviluppato, definisce che un gene codifica per un polipeptide, usando i batteriofagi come modello.

Tra gli anni ’70 e gli anni 2000 in cui viene fuori che prima di arrivare alla proteina, c’è un RNA chiamato RNA messaggero ma che non sempre è lo stesso, cioè la stessa regione del genoma può produrre più tipologie di RNA messaggero, splicing alternativo ma anche altre cose un po’ più esotiche come anche il trans-splicing (quando trascritti diversi si uniscono assieme), è una caratteristica del genoma di alcuni organelli (ad esempio in alcuni cloroplasti) ma c’è anche l’RNA editing (cambiamento specifico di una base azotata nell’RNA, che porta a una proteina diversa). Quindi, non sempre a una posizione fisica nel genoma corrisponde un solo trascritto e una sola proteina, perché c’è lo splicing alternativo.

Negli ultimi 20 anni, una grande parte di ciò che noi possiamo chiamare geni corrisponde a regioni del genoma che sono trascritte ma non tradotte e non sono solo i piccoli RNA, sono una categoria più ampia che si può chiamare noncoding RNA (ncRNA), che hanno il ruolo, ancora non chiarissimo, uno dei ruoli è di regolare l’espressione dei geni che poi portano alle proteine. Quindi, il gene non è solo un’entità fisica ma anche un concetto che è cambiato nel tempo, cambiato perché ci sono stati esperimenti che hanno permesso di creare dei nuovi modelli, aggiungendo dettagli a modelli preesistenti o confutando modelli precedenti esistenti, ad esempio. Mendel che usa la pianta di pisello, il motivo per cui usa quell’organismo modello e il primo nelle scienze naturali a scegliere un modello sperimentale con delle caratteristiche che sono le stesse con cui scegliamo modelli sperimentali oggi: modello sperimentale deve essere un organismo che ci permette di studiarlo, facilmente studiabile, spazio relativamente ristretto, costi contenuti, potendo ottenere più generazioni, potendolo incrociare, potendo ottenere dati per i propri esperimenti in tempi ragionevoli.

Progetto ENCODE

È esistito un progetto che si chiama ENCODE che sta per encyclopedia coding elements, che ha indagato gli elementi strutturali del genoma umano come modello. Questo progetto ebbe una prima tappa nel 2007 e poi la fine del progetto fu nel 2012. Il progetto ENCODE nasce su iniziativa del NIH (National Institute of Health) cioè l’istituto superiore di sanità americano. Ha l’obiettivo dopo aver sequenziato il genoma umano, di annotare, identificare gli elementi funzionali del genoma umano.

Da questo progetto si è scoperto che solo il 2% del genoma è codificante, circa 25.000-30.000 geni codificanti proteine poi c’è il resto che sono RNA. L’80% del genoma umano partecipa in almeno una reazione biochimica. Si stima intorno al 60-70% la frazione di genoma umano che è funzionale, cioè che o lega proteine (fattori trascrizionali), o viene trascritto oppure entrambe le cose. Il cui risultato è stato che gran parte del genoma è attivamente trascritto. Questo ha portato a fare un update, un aggiornamento della definizione di gene: il gene è una sequenza genomica di DNA (nel caso del Sars-cov-2 di RNA), che codifica per un prodotto funzionale. Esso può essere una proteina oppure un RNA. Ce n’è una discreta frazione che codifica per ciò che noi chiamiamo “unknown gene function”, geni che non so cosa fanno. Quando troviamo questo unknown function genes, la proteina ipotetica prodotta da questo unknown function gene, presente anche in altri organismi, allora si chiama conserved unknown gene, cioè gene sconosciuto ma conservato.

Evoluzione dei geni e genomica

Evoluzione dei geni e famiglie geniche

I geni codificano per proteine, o meglio, codificano per un prodotto funzionale che può essere una proteina o un polipeptide o un RNA. Le teorie più confermate, sono l’evoluzione dei geni da geni preesistenti ed l’evoluzione de novo dei geni cioè da un qualcosa che non è un gene. Quello che vediamo negli organismi è una enorme condivisione dei geni, cioè tanti di noi (organismi) condividiamo gli stessi geni ovverosia geni che sono più o meno imparentati, deduzione data dal fatto che sono molto simili tra loro. Più simili di quello che uno si aspetterebbe per puro e semplice caso. Quindi, verosimilmente sono originati dallo stesso gene ancestrale, che si è via via differenziato negli organismi.

All’interno del genoma poi troviamo geni che sono fra di loro simili e sono chiamati paraloghi e questi hanno un’origine da un gene ancestrale che era unico che poi si è diviso in due.

Già dagli anni ’30, J.B.S. Haldane, famoso evoluzionista dell’epoca, tra quelli che inventa genetica delle popolazioni. Haldane immagina, negli anni ’30, che i geni si originano da geni preesistenti accumulando delle mutazioni che ne fanno via via cambiare la funzione, fino ad avere funzioni completamente nuove. Un processo di tipo evoluzionistico Darwiniano, perché i geni che non servono spariranno, mentre i geni che servono (aumentano la fitness dell’individuo), vengono mantenuti.

Nel 1970, Susumu Ohno, giapponese, parla di evoluzione dei geni attraverso la duplicazione. Quindi, per un po’ di tempo viene accettata questa teoria secondo la quale tutti i geni derivano da un gene presistenti. François Jacob, colui che scoprì l’operone lattosio, nel 1977 affermò che “la probabilità che una proteina funzionante si origini da una sequenza non genica sono virtualmente 0”, che un gene si origini così di botto da una sequenza non genica sono virtualmente 0. Quindi, il problema dell’origine de novo dei geni viene accantonato, problema non si hanno nemmeno dati sperimentali.

Tra il 2006 e 2007, quando si iniziano ad accumulare diverse sequenze genomiche di organismi (emophylus influenzae 1995, saccharomyces cerevisiae 1996) e si inizia a vedere come son fatti i genomi, gli insieme di geni. Nel 1998 viene sequenziata la Drosophila melanogaster. Nel 2001, il genoma umano e contemporaneamente una marea di altra genomi microbici e si iniziano ad avere una serie di dati e si inizia a studiare il trascrittoma. Lo inventa Craig Vente il modo con cui si studia il trascrittoma con le invenzioni delle Ist, library di sequenze espresse. L’invenzione, nel 1995, dei DNA microarrays, dei sistemi di ibridazione su supporto solido che permette di vedere quali geni sono espressi in un certo momento, o meglio, quali sequenze di un genoma sono trascritte in RNA. Quindi nel 2000 si arriva ad avere le sequenze dei trascrittomi e dei genomi e ci si accorge che ci sono delle zone che in un organismo non sono mai trascritte, mentre in un altro sono trascritte e potenzialmente tradotte.

Ci si accorge che ci sono dei geni che possono emergere, possono formarsi, geni intesi come sequenze trascritte e, a cui se ci si lega un ribosoma, tradotte. Se non hanno una funzione si perdono, se hanno una funzione o non hanno una funzione negativa nei confronti della fitness dell’organismo, si manterranno.

De novo gene birth

Quindi, esiste la de novo gene birth, ossia la nascita di un gene de novo, da una zona non genica però sono eventi estremamente rari. Quando succede è una innovazione, che potenzialmente viene trasmessa alla progenie. Questa innovazione può avvenire perché sul genoma c’è una zona in cui si può legare la polimerasi, se la polimerasi si lega, la zona viene trascritta. Da un prodotto tossico, trascritto che interferisce con qualche gene essenziale, l’organismo muore. Quella mutazione non viene trasmessa alla progenie. È una mutazione, perché è la creazione di una zona di legame per l’RNA polimerasi e non è così difficile avere delle zone di legame per l’RNA polimerasi, perché l’RNA polimerasi non ha bisogno di sequenze altamente specifiche per il legame, la sequenza “consenso” (è una sequenza media dove si va a legare una proteina, dove c’è abbondanza di A da una parte e di C dall’altra), dell’RNA polimerasi basta che siano un po’ ricche di A e T (TATA box) e a monte ci siano delle basi che permettono il legame di fattori di trascrizione accessori. Sia nei batteri che negli eucarioti, non è una proteina altamente selettiva, cioè la probabilità di incontrare sequenze potenzialmente legabili dalla RNA polimerasi in un genoma è alta. Le sequenze di legame dell’RNA polimerasi ha un contenuto di informazioni bassa.