Appunti di fisiologia cellulare: trasporti transmembrana

Trasporto attraverso la membrana cellulare

Diffusione semplice e facilitata; migrazione attraverso canali; trasporto attivo primario e secondario; trasporti transepiteliali; endocitosi; esocitosi.

Classificazione trasporti transmembranai

I trasporti di membrana vengono classificati in base a due criteri.

• Classificazione secondo lo stato della particella che attraversa la membrana, cioè come la molecola attraversa lo strato lipidico (in forma libera o con bisogno di aiuto); quindi esiste una prima suddivisione in trasporti in forma libera (diffusione semplice) e trasporti tramite proteine transmembranarie a loro volta suddivisi in migrazione attraverso canali e trasporti mediati.
• Classificazione secondo l'origine dell'energia che sostiene il moto della particella attraverso la membrana. In base a questo criterio si distinguono trasporti attivi e trasporti passivi. I passivi comprendono diffusione semplice, migrazione attraverso canali e diffusione facilitata (carrier); gli attivi comprendono trasporti attivi primari (diretti) e secondari (indiretti).

Diffusione semplice

La particella diffonde nella matrice fosfolipidica passivamente (secondo gradiente), senza bisogno di carrier. È un trasporto in forma libera. La capacità di attraversare la membrana cellulare per diffusione semplice è riservata a particelle o molecole altamente liposolubili.

Meccanismo: è possibile identificare due step.

1. Ingresso delle molecole nel bilayer (questa fase risulterà più facile quanto maggiore è il coefficiente di ripartizione kd).
2. Diffusione delle particelle nello spessore (costante) del bilayer fino a superarlo; questa fase dipende dalla mobilità della particella che dipende a sua volta da dimensione e temperatura. Quindi l'attraversamento sarà tanto veloce quanto maggiore è il coefficiente diffusionale della particella nel materiale costituito dalla matrice (prima legge di Fick).

Diffusione non ionica

Si tratta di un caso particolare di diffusione; inizialmente avviene come la diffusione semplice. Riguarda molecole che passano attraverso la membrana dalla forma indissociata (apolare e liposolubile) a quella dissociata (polare, idrosolubile) a causa di piccole variazioni di pH che possono in alcuni casi sussistere nei mezzi che bagnano i due lati della membrana plasmatica.

Il processo in toto è passivo e porta al totale trasferimento di una sostanza da un lato all'altro della membrana. Il flusso è unidirezionale. Es. consideriamo l'NH₃ che si forma dal metabolismo degli aminoacidi a livello delle cellule dei tubuli renali. L'ammoniaca all'interno della cellula del tubulo renale passa nel lume del tubulo in cui abbiamo un pH acido che fa si che essa guadagni un protone e diventi NH₄⁺. L'NH₃ protonata non può più rientrare nella cellula in quanto è ionizzata e non ha le caratteristiche per riattraversare il bilayer lipidico.

Un altro esempio è l'acido acetilsalicilico che viene assorbito nello stomaco trovandosi indissociato. Esso una volta passato dal lume all'interno della cellula (trovandosi ionizzato a pH fisiologico) non può tornare indietro.

Trasporto tramite proteine transmembrana

• Le proteine canali quando si assemblano vanno incontro ad una conformazione simile a quella di un canale che permette il passaggio. Si distingue un poro centrale permeabile a ioni e acqua; le sostanze che passano non hanno bisogno di un legame e non c'è un cambio conformazionale da parte della proteina al loro passaggio. Gli ioni interagiscono con interazioni elettrostatiche col poro. Il canale essendo sempre aperto non va incontro a saturazione come nei carrier e la velocità cresce linearmente.
• Proteine vettori o carrier premettono il passaggio di particelle liposolubili perché possiedono per queste siti di legame che presentano complementarietà di forma o carica (ogni particella presenta un carrier specifico). Una volta legatasi alla molecola, la proteina carrier cambia conformazione e va a rivoltare il proprio sito di legame nel versante opposto della membrana (il sito di legame si porta con sé la molecola); il cambio di conformazione permette di svolgere il trasporto. La velocità di trasporto all'inizio è piuttosto rapida, tende ad un valore massimo nel momento in cui le proteine carrier sono tutte impegnate nel legame. La velocità quindi dipende dalla rapidità con cui la proteina carrier effettua il proprio ciclo e dal numero di proteine presenti. Questo processo va incontro a saturazione.
• Il trasporto passivo avviene mediante gradiente di concentrazione o elettrochimico. Sfrutta come energia quella accumulata nel gradiente e viene definito processo esoergonico.
• Il trasporto attivo avviene contro gradiente di concentrazione e crea un ulteriore differenza di concentrazione ai lati della membrana. L'energia necessaria al trasporto deriva dall'idrolisi dell'ATP, e viene definito processo endoergonico.

Migrazione attraverso canali

I canali possono essere distinti in ionici e idrici; questi canali li troviamo a livello della membrana plasmatica ma anche in alcuni organuli.

Canale idrico: acquaporine

Si tratta di proteine transmembrana che permettono il passaggio di molecole di acqua e molecole di dimensioni simili a quelle dell'acqua (es. glicerolo). Non viene stabilito un legame con la proteina canale.

Struttura: 6 alfa-eliche transmembrana collegate da anse intra- ed extracellulari; 2 motivi NPA (N: asparagina, P: prolina, A: alanina) posizionati per creare una configurazione spaziale favorevole al passaggio di H₂O, formano uno stretto poro. I motivi sono posizionati in modo tale che quando la proteina si ripiega in struttura terziaria formano il poro per il passaggio della sostanze.

Esistono vari tipi di acquaporine distribuite nei diversi tessuti: AQP1 è ubiquitaria, AQP2-3-4 si trovano nei reni, AQP5 negli epiteli ghiandolari. La quantità di acqua che può entrare o uscire dalla cellula attraverso tali canali può essere modificata agendo sull'osmolarità. Le acquaporine si associano in membrana a formare omo- o etero-tetrameri. La variazione del pH può mediare l'apertura o la chiusura delle acquaporine.

Canale ionico

Il trasporto attraverso questi canali può avvenire passivamente secondo gradiente elettrochimico oppure tramite proteine transmembrana (una sorta di diffusione facilitata) con le quali gli ioni stabiliscono interazioni elettrostatiche. Il flusso di ioni che attraversano un canale, in funzione delle forze che agiscono sugli ioni stessi ai quali il canale è permeabile, è identificato come conduttanza del canale.

Struttura: proteine transmembrana con un poro centrale che consente il flusso passivo di ioni secondo il loro gradiente. Queste proteine possono essere: a subunità distinte (etero-oligomeri), ad unico tipo di subunità (omo-oligomeri), a pseudo subunità (unica catena polipeptidica).

Per quale motivo gli ioni, particelle molto piccole, non riescono ad attraversare il bilayer lipidico senza proteine canale?

Quando gli ioni si trovano in acqua, vengono circondati da molecole di solvente che formano un anello di solvatazione (idratazione). Questo anello che circonda in maniera appropriata gli ioni, ha uno spessore che è inversamente proporzionale alla dimensione dello ione stesso. Quanto più piccolo è lo ione, tanto più la sua carica è concentrata; ciò genera un forte campo elettrico che aumenta il suo stato di solvatazione. Quindi lo ione solvatato non è più tanto piccolo e acquista una dimensione tale da non poter passare il bilayer.

Selettività canali ionici

La selettività è conferita da una combinazione dei seguenti fattori:

• Presenza di cariche elettriche fisse sulla parete interna del canale di intensità e densità specifiche.
• Raggio anidro dello ione.
• Grado di idratazione dello ione.

Esistono:

• Canali ionici poco selettivi: distinzione tra anioni e cationi.
• Canali ionici molto selettivi: permeabili a una sola specie ionica.

Il filtro di selettività è presente nel poro centrale del canale. Spesso esso è composto da catene laterali di amminoacidi specifici, con una determinata carica. Si ritiene che per passare attraverso i canali selettivi, gli ioni debbano essere disidratati dal filtro di selettività, formato dalla giustapposizione di 4 regioni P (residui aminoacidici polari), i cui apici sono sede di carica parziale negativa, solitamente portata da residui carbossilici.

Per essere estremamente selettivo, il poro formato dagli apici delle regioni P dev’essere esattamente uguale al diametro dello ione anidro: se è più grande, la disidratazione non è completa e lo ione non passa. Ovviamente lo ione non passa nemmeno se il filtro è più piccolo.

Canali ionici poco selettivi: presenza di cariche elettriche fisse, disposte sulle pareti del canale. Selettività in base al segno della carica. Cariche negative nel filtro di selettività permettono il passaggio di cationi; cariche positive nel filtro di selettività permettono il passaggio di anioni. Nel passaggio attraverso il canale lo ione perde l'acqua di solvatazione grazie alle catene laterali cariche degli a.a.

Canali ionici molto selettivi: l'ipotesi di tale selettività si basa sulle dimensione dello ione solvatato. Tenendo conto che lo ione per passare deve spogliarsi dell'anello di solvatazione, il canale dovrà possedere una certa densità di carica per neutralizzare la solvatazione dello ione (canali del sodio densità di carica alta meno selettivi, canali del potassio densità di carica più bassa → più selettivi). L'alta selettività di tali canali tiene conto anche delle dimensioni dello ione nudo (anidro); infatti il diametro del canale è specifico per il passaggio di un determinato ione.

Es. Gli ioni K⁺, idrati in soluzione, perdono le molecole di H₂O quando passano attraverso il filtro di selettività e formano dei legami di coordinazione con quattro O di gruppi carbonilici C=O. Gli ioni Na⁺, essendo più piccoli, non possono coordinarsi perfettamente con questi O e quindi attraversano il canale solo raramente.

Quindi: il canale è selettivo per il rispetto perché gli ioni formano legami più forti col filtro di selettività, compensando la perdita di energia dovuta alla deidratazione.

I canali ionici posseggono varie caratteristiche: possono essere sempre aperti (non gated) consentendo un flusso continuo di ioni, oppure posseggono un'apertura regolata da ligando (gates). In genere i canali ionici sempre aperti sono quelli molto selettivi; essi determinano la permeabilità di base della membrana. I canali ionici ad apertura regolata sono quelli che una volta aperti modificano la permeabilità di base. Gli stimoli che determinano l'apertura di suddetti canali sono di 3 tipi: stimolo elettrico, chimico, meccanico.

I canali sensibili agli stimoli elettrici vengono detti voltaggio-dipendenti; quando varia il potenziale di membrana essi si aprono. I canali sensibili agli stimoli chimici vengono detti ligando-dipendenti; quando una molecola endogena o xenobiotica o uno ione stesso si lega al canale, esso cambia conformazione e si apre. Il canale presenta uno specifico dominio intra- o extracellulare dove è presente il sito di legame per il ligando. Il legame in genere è debole e reversibile. Quando il ligando è extracellulare si può parlare di recettore canale.

I canali sensibili a stimoli meccanici vengono detti canali meccano-dipendenti; quando avviene una trazione o una deformazione della membrana, suddetti canali collegati al citoscheletro corticale actinico e alla membrana, si aprono. I modelli di apertura e chiusura dei canali sono diversi: possiamo avere un cambio di conformazione in una zona specifica del canale, un'estesa modificazione conformazionale che interessa il canale in toto, o una particella sul versante intracellulare che oscillando apre o chiude il canale.

Refrattarietà canali ionici

Alcuni canali ionici (ma non tutti) oltre ai classici stati aperto e chiuso, possono presentare lo stato refrattario. Inattivazione e desensitizzazione rappresentano lo stato refrattario rispettivamente di canali voltaggio-dipendenti e ligando-dipendenti. La persistenza di uno stimolo fa sì che un canale cambi ulteriormente conformazione diventando refrattario, che è un po' come averlo chiuso in quanto non permette il passaggio di ioni, ma tale conformazione è diversa da quella chiusa in quanto sembra che ci siano parti del canale sensibili in maniera differente allo stimolo (si ritiene che la refrattarietà dei canali Na e K voltaggio dipendente sia dovuta ad un cambio di conformazione sotto il controllo di una subunità diversa da quella che determina la loro attivazione). Dallo stato refrattario non è possibile passare alla conformazione aperta, ma se lo stimolo cessa si può passare alla conformazione chiusa (percorso obbligato). Un canale che possiede uno stato refrattario ha due conformazioni differenti che però sortiscono lo stesso effetto (di canale chiuso). Lo stato refrattario è importante perché rappresenta una sorta di protezione alla continua stimolazione.

Lo studio della funzione dei canali ionici è possibile tramite la tecnica del PATCH-CLAMP, che permette di studiare le correnti ioniche dell'intera cellula o di un singolo canale. Si utilizza una pipetta a contatto con la membrana cellulare e viene applicata una suzione così che parte della membrana viene aspirata all'interno del capillare.

Patologie dei canali ionici: canalopatie, mutazione di un singolo a.a. che compone la proteina canale, la permeabilità del canale viene alterata e il tutto sfocia in epilessia, sindrome del QT lungo, atassia, ipertermia maligna.

Trasporti mediati (tramite proteine carrier)

Trasporti transmembrana tramite proteine canale. Caratteristiche generali:

• Specificità per la sostanza o per un gruppo di sostanze simili (il sito di legame è localizzato in uno o più domini e possiede una complementarietà per la molecola da legare).
• Saturazione (l'intensità del flusso tende ad un limite massimo).
• Competizione per sostanze simili (il più concentrato riesce a legarsi).
• Inibizione da molecole dissimili che si possono legare al trasportatore riducendo l'affinità per la particella da trasportare. Modulazione allosterica: la proteina carrier presenta diversi siti di legame a cui si legano molecole particolari in grado di aumentare o diminuire l'affinità del carrier per la particella da trasportare (sito allosterico = sito regolatorio, diverso dal sito di legame a cui si lega la sostanza da trasportare).
• Possono essere sia attivi che passivi.

Trasporto mediato passivo

In base all'origine dell'energia, le proteine carrier si comportano in maniera diversa. Nel caso del trasporto passivo la molecola viene trasportata da una parte all'altra della membrana secondo gradiente di concentrazione. Il trasporto netto avverrà dal lato in cui essa è più concentrata verso quello dove è a minore concentrazione. L'affinità del carrier per la particella è la stessa ai due lati della membrana anche quando la proteina cambia conformazione. Infatti ciò che guida il trasporto, il formarsi e lo scindersi del complesso carrier-particella, è la concentrazione (nella parte più concentrata abbiamo più possibilità di legame; il legame e il distacco della particella dal carrier avviene per differente ...