Appunti di Fisiologia

Membrana cellulare e trasporti

Concetti fondamentali

La funzione dipende dalla struttura. Esempio a livello molecolare: il canale del K+ presenta in corrispondenza del poro una sequenza di aa che ricostruisce intorno allo ione K+ una rete di interazioni simile a quella che lo ione forma con le molecole di H₂O.

Esempi strutturali

A livello sopramolecolare: il sarcomero, l'unità strutturale del muscolo striato, è delimitato da due linee Z da cui originano i filamenti sottili di actina. Al centro del sarcomero si trova la linea M da cui si dipartono i filamenti spessi di miosina. Nella zona di sovrapposizione, le teste della miosina che si estendono dal filamento spesso formano, con il filamento sottile, legami (cross-bridges) responsabili della generazione di forza e di movimento. L'accorciamento del sarcomero è dovuto allo scorrimento dei filamenti in ogni emisarcomero, senza variazione della loro lunghezza (teoria dello scorrimento dei filamenti) e alla disposizione bipolare delle due schiere di teste e dei due emifilamenti di actina sovrapposti. Le teste di miosina sono generatori indipendenti di forza che agiscono in parallelo in ogni emisarcomero, sommando le loro forze (l'emisarcomero è l'unità funzionale del muscolo per la generazione di forza).

A livello di tessuto o organo: la disposizione dei muscoli scheletrici. La contrazione muscolare produce forza nella direzione dell'accorciamento. I muscoli possono muovere l'arto nelle due direzioni solo in quanto disposti in modo tra loro antagonista. La disposizione dei muscoli a cavallo dell'articolazione costituisce un sistema motore basato sul principio della leva di secondo genere (leva svantaggiosa).

• Contro: l'equilibrio è ottenuto con una forza esercitata dal muscolo 7 volte maggiore del peso.
• Pro: allo stesso tempo l'ampiezza e la velocità sono 7 volte quelle prodotte dal muscolo.

Omeostasi e feedback

Omeostasi: capacità degli organismi di mantenere una relativa stabilità interna. Esempio di feedback negativo: controllo della pressione. Le variazioni della pressione arteriosa sono registrate dai barocettori che inviano afferenze al centro cardiovascolare bulbare (sistema di controllo) dove avviene il confronto con il valore di riferimento e viene generato il segnale di errore che agisce sugli effettori autonomi che regolano cuore e vasi sanguigni.

Membrana cellulare

Doppio strato come condensatore. Dimostrazione sperimentale del doppio strato lipidico: esperimento di Gorter e Grendel (1925). Misurarono l'area occupata dal monostrato di fosfolipidi estratti da globuli rossi sottoposti a lisi osmotica dispersi sulla superficie dell'acqua e trovarono che, quando il monostrato era diventato compatto, la sua area corrispondeva al doppio dell'area calcolata dalle membrane dei globuli rossi da cui era stato estratto.

Misura elettrica dello spessore del doppio strato: la capacità elettrica (molto piccola) della membrana, 1 μF/cm², è quella attesa da un doppio strato lipidico dello spessore di 50 Å. Le proteine si muovono nel doppio strato lipidico: esperimento di recupero della fluorescenza in mioblasti trattati con una proteina fluorescente in grado di legarsi alle glicoproteine di membrana. La ricomparsa della fluorescenza in un’area circoscritta della membrana permette di definire la percentuale di glicoproteine mobili e la velocità con cui diffondono.

Funzioni delle proteine di membrana

• Stabilità strutturale: proteine strutturali (giunzioni, molecole di adesione, citoscheletro).
• Trasduzione di segnali: recettori di membrana.
• Attività enzimatica: enzimi.
• Trasporto: canali, trasportatori.

Trasporti passivi

La permeabilità è indipendente dalla misura della molecola. Ma: K+ (raggio atomico 1.33 Å, raggio idrato 1.88 Å), Na+ (raggio atomico 0.98 Å, raggio idrato 2.91 Å) quindi più lento. Trasporto facilitato: la pendenza è coefficiente di permeabilità. Velocità = A*P*DC.

Diffusione semplice

• Causata dal moto browniano delle molecole in soluzione.
• Il flusso netto (ds/dt) è proporzionale al gradiente di concentrazione (dc/dx) e all'area (A) della superficie attraverso cui la sostanza diffonde.

Legge di Fick: dove D = cm²/s è il coefficiente di diffusione. Nella membrana (spessore x = 50 Å) dc/dx assunto costante, per cui: dove b = C'/C è il coefficiente di ripartizione olio-acqua (ad esempio 0.3, cioè la molecola è meno solubile nella membrana che in acqua). Le sostanze possono attraversare le membrane mediante diffusione semplice se sono solubili nello strato lipidico e l'equazione di Fick diventa: dove P (= Db/x) = cm/s è il coefficiente di permeabilità della membrana.

• P grande se passa velocemente (K+: 10^-6 cm/s, Na+: 10^-8 cm/s, H₂O: 10^-4 cm/s).
• Non mostra saturazione con l'aumentare del gradiente.
• Non c'è competizione tra sostanze diverse (flussi indipendenti).

Osmosi

Diffusione dell'acqua da una soluzione più diluita a una soluzione più concentrata (l'acqua segue il proprio gradiente di concentrazione). In presenza di un gradiente di acqua, il movimento dell'H₂O cambia il volume o la pressione intracellulare fino al raggiungimento dell'equilibrio osmotico.

• Cellule animali: Variazione di volume in relazione all'osmolarità del mezzo esterno.
• Cellule vegetali: La parete di cellulosa impedisce aumenti di volume; l'ipertonicità del protoplasma è bilanciata da aumento della pressione idrostatica.

Osmolarità: equivale al numero di particelle nell'unità di volume, non tiene conto delle caratteristiche di permeabilità della membrana.

Tonicità: tiene conto della effettiva permeabilità della membrana ai diversi soluti (può o no equivalere all'osmolarità). Una soluzione è isotonica con una data cellula quando ne mantiene invariato il volume, è ipotonica se il volume cellulare (Vcell) aumenta, è ipertonica se Vcell diminuisce.

• La soluzione extracellulare ha la stessa osmolarità del citosol, ma il glicerolo (che contribuisce per il 50% all'osmolarità extracellulare) è un soluto permeabile e non contribuisce alla tonicità extracellulare: la cellula si rigonfia e quindi la soluzione è ipotonica.
• Una soluzione salina 0.25 M ha lo stesso effetto della soluzione salina 0.25 M + 0.5 M di glicerolo. Un soluto a cui la membrana è permeabile non determina la tonicità del mezzo, ma ha solo effetti osmotici transitori.
• L'aggiunta di glicerolo 1 M alla soluzione extracellulare ne raddoppia l'osmolarità, ma non ne cambia la tonicità e determina solo una diminuzione transitoria del volume cellulare. La tonicità della soluzione è determinata dalla concentrazione dei soluti impermeabili.

Volume osmoticamente inerte

Citotoscheletro, compartimenti impermeabili. Occorre sottrarre il volume osmoticamente inerte per verificare che la cellula si comporta come uno smometro.

Effetti osmotici permanenti e transitori:

• 1M: volume 1.
• 2M: volume 0.65 (no 0.5 perché ho 0.15 inerte).

a) Etanolo: è più veloce dell'acqua (molto permeabile, tau piccola).

b) Xilosio, zucchero polare e grande (passa solo con i carrier perché è impermeabile, tau grande).

c) Glicerolo: a 20 sec l'acqua rientra lentamente perché entra glicerolo, è lui che misura la cinetica. Dall'andamento dell'acqua misuro quello del glicerolo. Tau = 8 min.

d) Urea (metabolita) tau = 20 min. Tau: quanto ci vuole a raggiungere il 63% del nostro equilibrio? Quanto rapidamente raggiunge l'equilibrio? Tau grande: processo lento. 1/tau = k = A*P/V. K grande: fa alla svelta ad entrare. Aumenta al diminuire del raggio.

Trasporto facilitato

• Permeabilità inaspettatamente elevata per la presenza di proteine carriers che permettono il passaggio di sostanze che non possono diffondere liberamente attraverso la membrana.
• Il movimento è secondo gradiente.
• Saturazione quando la sostanza raggiunge elevate concentrazioni a causa del numero finito di proteine carriers.
• L'interazione con il carrier è specifica (proteine integrali).
• Sostanze con caratteristiche affini competono per lo stesso carrier: K_M (D-glucosio) = 0.007M; (L-glucoso) = 7M; KM (D-arabinosio) = 1.5M. C'è una gerarchia: destrosi, esosi, pentosi, chetosi. La specificità dell'interazione degli zuccheri con il carrier è evidente dai valori di KM che sono minimi per il destrosio e crescono passando dagli aldoesosi (glucosio, mannosio, galattosio) agli aldopentosi (xilosio, arabinosio, ribosio, lixosio) e dalle forme D alle forme L. Il grado di inibizione reciproca dipende dall'affinità del carrier per lo zucchero, così in presenza di destrosio il trasporto di tutti gli zuccheri risulta fortemente inibito, mentre il trasporto di destrosio risulta fortemente inibito dal mannosio, inibito in misura minore da galattosio, xilosio e arabinosio e indifferente alla presenza dei due chetosi sorbosio e levulosio (fruttosio).

Cinetica

La velocità con cui il glucosio viene trasportato dal carrier specifico segue una cinetica di saturazione descritta dall'equazione di Michaelis Menten, in cui V_max è il trasporto massimo e K_M, la concentrazione di glucosio alla quale la velocità di trasporto è 1/2 V_max, è una stima dell'affinità del carrier per il glucosio. Ad esempio, l'arabinosio è meno affine, ci vuole più concentrazione per raggiungere V_o/2 → Molto affine = Km piccola.

Km = [substrato]*[enzima]/[concentrazione complesso es/sa] = [totale A_o - quello occupato sa/es ] *[s]/[es] (infatti è la stessa cinetica di un enzima). Velocità massimale → saturazione! È per tutti uguale.

k è una costante che dipende dal tipo di trasformazione che avviene nella membrana.

Quando v = vmax/2 → Km = [s]

• Se [s] << Km → v = vmax [s]/km e sappiamo che vmax/km è il coefficiente della retta. Somiglia a una cinetica di primo ordine.
• Se [s] >> Km → v = vmax.

Inibizione competitiva

• Sia i carriers, sia gli enzimi.
• Il valore di Vmax non cambia. Cambia Km, aumenta perché si riduce l'affinità.

Inibizione non competitiva

Si abbassa Vmax (ovvero si riduce la concentrazione dell'enzima) ma non si modifica la Km. Esempio: veleno che danneggia i carriers.

Modello del carrier mobile

Le molecole carrier si legano alla molecola da trasportare su un versante della membrana, migrano sul versante opposto, dove liberano la molecola trasportata. Non può essere valido con proteine integrali.

Modello del flip-flop

La proteina trasportatrice, ancorata alla membrana, ha un carattere bistabile, esiste cioè in due stati in cui i siti di legame per la molecola da trasportare sono esposti alternativamente sui due versanti opposti della membrana.

Trasporto del glucosio

Le diverse isoforme delle glucosio-permeasi sono adattate alla funzione delle cellule: l'isoforma presente nelle cellule nervose (Glut3) ha una KM bassa (1.8 mM): nell'ambito fisiologico della glicemia il trasporto di glucosio nelle cellule nervose è sempre vicino al massimo, le cellule nervose non devono essere sensibili alle variazioni della glicemia; l'isoforma delle cellule beta del pancreas (Glut2) ha una KM elevata (7 mM): nell'ambito fisiologico della glicemia il trasporto di glucosio varia significativamente, le cellule beta secernono insulina (ormone ipoglicemizzante) in funzione della concentrazione intracellulare di glucosio, che dipende strettamente da quella extracellulare. L'insulina abbassa il livello ematico di glucosio in quanto riduce la KM della glucoso-permeasi (Glut 4) di cellule muscolari e adipose e favorisce la glicogeno sintesi endocellulare.

Isoforme con diversa affinità (KM)

• [Glucosio] >> Km
• Se c'è insulina le cellule portano via il glucosio più velocemente. Feedback negativo per l'omeostasi della glicemia.

Trasporto attivo primario

• Le proteine agiscono come pompe che trasportano i soluti contro gradiente, dalla soluzione meno concentrata alla più concentrata.
• Utilizza energia cellulare, di solito sotto forma di ATP (ΔG=11kC/M = 46 kJ/M = 74 zJ/mol per [ATP] fisiologica).
• Saturazione.
• Esempio: pompa Na-K: trasporto accoppiato 3:2, flussi dipendenti, effetto dei glicosidi cardiaci.

Come mantengo questo stato stazionario? Il sodio tende a entrare (passivo) ed è buttato fuori insieme al potassio che è buttato dentro (attivo).

Stato stazionario: flusso netto di sodio (interno+ esterno/attivo) = 0 ; Flusso = Forza / Resistenza (I=V/R).

La concentrazione intracellulare di Na+ diminuiva ad una velocità 1.5 volte più grande della velocità con cui la concentrazione intracellulare di K+ aumentava.

L'efflusso del Na+ dall'assone di calamaro ha le caratteristiche di un trasporto attivo:

• 1) È contro il gradiente elettrochimico;
• 2) È sensibile ai veleni metabolici; dipende dall'ATP; i veleni metabolici danneggiano il sistema di sintesi dell'ATP; inibizione competitiva.
• 3) Dipende dal K+ esterno; è accoppiato, altrimenti -30%.
• 4) Ha un Q₁₀ > 3. Q10 = V_t / V_t -10 gradi. È un parametro della velocità che dipende dalla temperatura. Flusso interno: q10 = 1.05 ; flusso esterno: q10 = 5.

Come misuro il flusso in entrata e uscita? Con flussi unidirezionali misurati tramite la tecnica degli isotopi radioattivi. H₂O radioattiva → come cambia nel tempo → velocità del flusso.

Trasporto attivo secondario

Trasporto attivo → gradiente elettrochimico Na 10 volte tanto del K. Non c'entrano più le permeabilità (a differenza del passivo).

• È un trasporto mediato che avviene contro gradiente.
• L'energia non deriva direttamente dall'ATP.
• È un trasporto accoppiato (cotrasporto): il gradiente di un soluto permette il trasporto contro gradiente del soluto accoppiato.

Simporto: i soluti si muovono nello stesso verso.

Antiporto: i soluti attraversano la membrana in verso opposto.

Scambiatore Na-Ca (membrana dei neuroni, antiporto, stechiometria 3Na : 1Ca) mantiene la concentrazione del calcio bassa nella cellula (meccanismo efficiente di segnalazione).

Esperimento di misura di [Ca²⁺]_in con equorina (dà luminescenza → intensità luminosa → corrente). Riduco il Na fuori e il calcio interno aumenta = sfrutta l'energia libera del Na, no ATP.

[Ca²⁺]_i dipende da [Ca²⁺]₀, quindi la membrana è permeabile al Ca; [Ca²⁺]_in dipende da [Na⁺]₀ quindi il trasporto è accoppiato (3 Na : 1 Ca).

Stechiometria determinata anche attraverso bilancio energetico: neurone di vertebrato con V_m = -77 mV, [Na⁺]_i= 12 mM, [Na⁺]_e= 120 mM, T = 20 °C.

ΔG_Ca = 8.314 x 293 x ln(2/0.0001) + 2 x 96500 x (0.077) = 39 kJ/mol energia per pompare fuori il Ca (positiva = controgradiente); 1 mole chimico + 1 mole elettrico (valenza x carica x ddp).

ΔG_Na = 8.314 x 293 x ln(12/120) + 1 x 96500 x (-0.077) = -13 kJ/mol, l'entrata di 3 moli di Na implica ΔG = -39 kJ/mol → pompa Na/K = questa proteina può fare il contrario (energia libera che vince).

Bilancio energetico dello scambiatore Na-Ca determina la direzione del trasporto di Ca. DG=0 quando: ΔG_Na + ΔG_Ca = 0 energia = carica per ddp.

Usando il gradiente elettrochimico come forza generalizzata: 3*F(V_m - E_Na) - 2*F(V_m - E_Ca) = 0 quindi → V_m = 3E_Na - 2E_Ca.

Neurone di vertebrato: con [Ca²⁺]_i = 0.1 μM, [Ca²⁺]_e = 2 mM, [Na⁺]_i = 12 mM, [Na⁺]_e = 120 mM, T = 20 °C. E_Na = 58 mV e E_Ca = 125 mV → V_m = -76 mV.

Lo scambio è elettrogenico (cariche: 3:2), di conseguenza:

• (1) L'iperpolarizzazione della membrana favorisce l'espulsione di Ca; la depolarizzazione favorisce l'entrata di Ca;
• (2) L'aumento di Ca intracellulare riduce E_ca e accelera lo scambiatore, inducendo depolarizzazione;
• (3) L'aumento di Na intracellulare (per esempio per inibizione della pompa Na-K) riduce E_Na e quindi decelera lo scambiatore, inducendo iperpolarizzazione.
• (4) La direzione del trasporto dipende dal senso della riduzione dell'energia.

Simporto Na-aminoacidi

Lato luminale dell'epitelio assorbente intestinale. L'ingresso di alanina (come di altri aa) dipende dalla concentrazione extracellulare di Na+! In assenza di Na+, il trasporto di alanina avviene per trasporto facilitato: la massima [alanina]_i è uguale a quella extracellulare (linea tratteggiata in A). In presenza di Na+, il trasporto di alanina nella cellula è un trasporto attivo secondario: l’alanina viene accumulata dentro il citosol in cui raggiunge concentrazioni >> di quella extracellulare. A concentrazione infinita di alanina, la velocità di trasporto è indipendente dal Na+ come indicato dallo stesso valore di Vmax.

Trasporto transepiteliale

• Il trasporto transcellulare è composto da trasporto passivo o attivo secondario sulla membrana apicale (o luminale) e trasporto attivo primario e altri tipi di trasporto passivo e attivo secondario sulla membrana basolaterale (epitelio intestinale e renale).
• Il trasporto di cationi è tipicamente accompagnato dal trasporto di anioni (e viceversa) per minimizzare la generazione di potenziali elettrici.
• La via paracellulare è una via di corto circuito (riduzione della resistenza → contatto diretto).