Appunti di Farmacogenomica, Prof. Tascedda

Farmacogenomica

Obiettivi

Approfondimento dei principali aspetti della farmacogenetica e della farmacogenomica. In particolare, si pone l’attenzione sui principi generali, le applicazioni cliniche, le relative tecniche, i meccanismi d’interferenza fra genoma, espressione genica e farmaci.

Requisiti richiesti

• Biochimica, fisiologia e patologia
• Meccanismo d’azione dei farmaci
• Determinazioni quantitative in farmacologia e interazione farmaco-recettore
• ADME
• Interazioni farmacologiche
• Ricerca e sviluppo di nuovi farmaci
• Aspetti tossicologici dell’azione dei farmaci
• Meccanismi biochimici e genetici responsabili dell’azione dei farmaci
• Meccanismi trascrizionali e post-trascrizionali
• Farmacogenetica e farmacogenomica

Materiale didattico

• Lezioni registrate
• Copia elettronica delle diapositive
• Aula virtuale
• Materiale per approfondimenti
• Siti web specifici

Testi consigliati

• Farmacologia, Rang, Dale, Ritter
• Farmacologia, Rossi, Cuomo
• Farmacologia generale e clinica, Katzung
• Farmacologia generale e molecolare, Clementi e Fumagalli (consigliato)
• Le basi farmacologiche della terapia, di Goodman e Gilman

Prova finale

Esame scritto, 32 domande a scelta multipla, 25 minuti di tempo. Tra 4 risposte, solo 1 è corretta. +1 punto per ogni risposta corretta, 0 punti per ogni risposta NON data, -0.25 per ogni risposta sbagliata.

Trasmissione GABAergica

Esistono molti modi per agire su un sistema neurotrasmettitoriale intervenendo:

• Direttamente sul neurotrasmettitore
• Sul recettore
• Sui meccanismi post-sinaptici

Negli anni abbiamo caratterizzato dal punto di vista genetico-molecolare e farmacologico il sistema gabaergico, che si contrappone a quello glutammatergico. Molto spesso, diversi sistemi di neurotrasmettitori possono essere usati in modo alternativo per trattare lo stesso fenomeno: posso trattare l’ansia agendo sui sistemi GABAergici ma anche sul sistema serotoninergico. NON esiste quindi una corrispondenza univoca tra sistema neurotrasmettoriale ed una patologia. Si può quindi agire in modo differenziato su diversi sistemi. Lo sbilanciamento di un sistema spesso determina una cascata che ne travolge anche altri, perché il nostro SN vive di equilibri: il più importante riguarda il bilanciamento continuo tra i sistemi inibitori e quelli eccitatori, che sono una neurotrasmissione mediata da amminoacidi.

• Inibitori: GABA (acido ammino butirrico) e glicina (ruolo ambivalente) rallentano l’attività dei neuroni che iperpolarizzano diventando refrattari.
• Eccitatori: glutammato, D-serina, le cellule depolarizzano tendendo a far insorgere dei PdA.

Il prevalere dell’iperpolarizzazione si ottiene o aumentando il tono GABAergico o riducendo il tono glutamatergico. Convulsioni: causate dalla prevalenza del tono eccitatorio oppure dalla riduzione di quello inibitorio. Coma: causate dalla prevalenza del tono inibitorio oppure dalla riduzione di quello eccitatorio.

Metabolismo del GABA

Il GABA è demolito dall’enzima GABA-transaminasi, producendo semialdeide succinica e poi acido succinico che entra nel ciclo dell’acido citrico, il quale è il serbatoio del neurotrasmettitore che per eccellenza si oppone al GABA: il glutammato. Glu è sintetizzato grazie all’azione di alcune transaminasi a partire dall’alfa-cheto-glutarato. Il GABA può essere sintetizzato direttamente a partire dal glutammato grazie alla GAD (enzima acido glutammico decarbossilasi). Quindi i principali neurotrasmettitori inibitorio ed eccitatorio appartengono alla stessa via metabolica di sintesi e di degradazione.

Il GABA è stato identificato precocemente: nel 1950 venne descritto da Roberts e Frankel questo aa che, quando rilasciato sulle sinapsi del SNC, tende ad iperpolarizzare le cellule.

• È un amminoacido
• È un neurotrasmettitore inibitorio
• Il 35-40% delle sinapsi presenti a livello centrale sono GABAergiche.
• Negli anni, tramite una deduzione farmacologica abbiamo potuto dimostrare che regolando i livelli dell’attività del recettore GABAergico permette di migliorare la fisiopatologia dell’ansia e dell’epilessia. Questo NON significa che l’epilessia e l’ansia siano dovute ad una disfunzione del recettore del GABA.

Nel SNC il GABA è presente in quasi tutte le regioni cerebrali, ma in alcune è particolarmente abbondante controllando diverse funzioni: nella sostanza nera e nel globo pallido contribuisce alla nostra capacità di controllare il movimento, nella corteccia cerebrale ha altre funzioni e nel cervelletto controlla sempre il movimento ed altri aspetti.

Recettori per il GABA

• GABA_A : recettori canale permeabili allo ione Cl^-
• GABA_B : recettori accoppiati a proteine G inibitorie. Hanno 7 eliche TM, la regione N-term forma il sito di legame per il neurotrasmettitore e il dominio C-term intracellulare con sequenze di consenso per la fosforilazione (necessaria per regolare l’attività del recettore).

Sono entrambi recettori inibitori che legano il GABA, ma sono estremamente diversi. Le tossine possono essere usate per classificare come questi recettori si comportano dal punto di vista fisiologico e farmacologico. Per studiare il recettore GABA_B usiamo il baclofene (agonista di sintesi). Per studiare il recettore GABA_A usiamo 2 tossine naturali che agiscono sulla subunità β di GABA_A:

• Muscimolo: agonista estratto dal fungo tossico Amanita muscaria, da cui si ottengono anche la muscarina (agonista dei recettori muscarinici dell’acetilcolina) e l’acido ibotenico (agonista dei recettori NMDA del glutammato).
• Bicucullina: antagonista identificata nel 1930 ed estratta da un’alga.

Agonisti del GABA

Baclofene: rilassante muscolare, usato nei casi di lesione cerebrale per ridurre la spasticità.

Antagonisti

Phaclofen: in studio; si pensa migliori le performance cognitive.

Recettore GABA_A

Meccanismo d’azione

1. Legame del GABA al proprio recettore
2. Distorsione del recettore e apertura del canale al cloro: il cloro segue il suo gradiente elettrochimico ed entra nella cellula
3. Iperpolarizzazione
4. Inibizione

Struttura

Strutturalmente, sono recettori ionotropi; formano un grosso complesso molecolare costituito da subunità diverse: 2 subunità α, 2 subunità β, spesso una subunità accessoria γ. Ciascuna di queste subunità è formata da singole proteine con 4 eliche TM (quindi sia N-term sia C-term sono esposti nell’ambiente extracellulare). Tra TM3 e TM4 c’è un grande loop intracellulare, responsabile dell’interazione con il neurotrasmettitore. Quindi se si vuole studiare la funzionalità di un agonista, basta clonare il loop TM3-TM4. Il neurotrasmettitore, quindi il GABA, lega la coppia di subunità β; servono 2 molecole di GABA per attivare un recettore GABA_A. Le benzodiazepine NON legano le subunità β, ma la coppia di subunità α; anche in questo caso servono 2 molecole di BDZ per attivare GABA_A.

Nel SNC esistono centinaia di recettori GABAergici tutti diversi tra loro a seconda delle subunità di cui sono formati, perché il cervello dei mammiferi si è evoluto in modo tale da duplicare continuamente queste subunità. Sono state identificate:

• α₆
• β₄
• γ₃
• δ₁
• ε₁

Se combiniamo queste subunità otteniamo decine di configurazioni diverse, ciascuna con caratteristiche chimico-fisiche, farmacologiche e patologiche diverse: quindi ogni sottopopolazione di recettori controlla funzioni diverse. Ad esempio, il recettore α₂-β-γ₂ è legato con alta affinità dalle benzodiazepine. Le β-carboline sono agonisti inversi dei recettori GABA_A. Il recettore α₆-β-γ₂ è invece insensibile a tutti i ligandi per i recettori che legano le benzodiazepine, che NON risultano più efficaci. Se i neuroni, anziché α₂, producono α₆, i recettori perdono l’affinità alle benzodiazepine.

Quindi:

• Le subunità β sono legate dal GABA (endogeno), dal muscimolo e dalla bicucullina.
• Le subunità α sono legate da farmaci quali benzodiazepine, imidazopiridine, rirazolopirimidine, barbiturici (ma hanno un utilizzo ristretto perché poco selettivi; sono utilizzati per indurre coma farmacologico e per anestesia in operazioni chirurgiche).
• La subunità γ è modulata dall’etanolo.

Ogni subunità ha le sue caratteristiche funzionali. Quindi abbiamo farmacologie diverse a seconda delle diverse subunità: α (farmacologia delle subunità α: benzodiazepine, imidazopiridine, rirazolopirimidine, barbiturici) e β (farmacologia delle subunità β: GABA, muscimolo e bicucullina). Il recettore delle BDZ è localizzato sulla subunità α di GABA_A; conosciamo meno la farmacologia delle subunità accessorie. Le BDZ sono modulatori allosterici positivi del GABA_A; per esplicare la loro attività farmacologica le BDZ devono legare le 2 subunità α, ma è necessario che il GABA sia contemporaneamente legato alla subunità β. Il Flumazenil è un antagonista competitivo del sito di legame delle BDZ, quindi NON agisce sulle sinapsi GABAergiche in assenza di BDZ; il Flumazenil è l’antidoto per l’avvelenamento da BDZ.

NON si conosce la natura della molecola endogena che lega la subunità α del recettore GABA_A. La glutammina è trasformata in glutammato che viene poi attaccato dalla GAD a generare GABA, che viene rilasciato tramite le vescicole e agisce in modo diverso sui recettori GABA_A e GABA_B. Il segnale GABAergico è spento tramite l’attività di trasportatori di membrana (GAT) localizzati sul terminale pre-sinaptico ma anche sulle cellule della glia (NON sono neuroni). Il segnale è interrotto poiché il neurotrasmettitore, nelle cellule della glia, è attaccato dall’enzima GABA-transaminasi trasformandosi in glutammina (meno carica, quindi può essere scambiata velocemente tra le cellule, e NON attiva sui recettori GABAergici). La Gln è ripresa dal terminale pre-sinaptico e trasformata in Glu per ricominciare il meccanismo. Ciascuna tappa rappresenta un punto di attacco farmacologico.

Riassorbimento dei liquidi

Il riassorbimento dei liquidi a livello renale è sotto controllo ormonale con sede primaria nell’ipotalamo, il controllo della volemia e della pressione arteriosa subiscono un controllo centrale. La sinapsi GABAergica: sito d’azione dei farmaci ansiolitici e ipnotici. La sinapsi è una struttura complessa con molti protagonisti; la conoscenza del funzionamento delle sinapsi è chiave per poter regolare un sistema neurotrasmettitoriale mediante la farmacologia.

• Il terminale pre-sinaptico contiene il neurotrasmettitore: con sinapsi GABAergica o glutamatergica si intende il neurone pre-sinaptico.
• Il neurone post-sinaptico possiede invece i recettori per il GABA.

Ma i recettori per i neurotrasmettitori hanno almeno una duplice localizzazione: sono classicamente sul terminale post-sinaptico, ma anche su quello pre-sinaptico fungendo da autorecettori; normalmente sono recettori inibitori che tendono a spegnere il segnale di quel neurotrasmettitore. Guardando una sinapsi GABAergica, normalmente classifichiamo i neuroni NON tanto per la presenza di GABA ma per l’enzima GAD che attaccando il glutammato genera il GABA.

Il GABA è rilasciato sotto stimolo calcio-dipendente e potenziale-dipendente. Sul terminale post-sinaptico il recettore per il GABA_A fa entrare cloro e il GABA cambia conformazione regolando l’apertura di altri canali, ad esempio del potassio. Per regolare il sistema nel modo corretto, l’attività del neurotrasmettitore normalmente deve essere spenta. L’attività del GABA è spenta da 2 meccanismi: attivazione di trasportatori neuronali e attivazione di trasportatori gliali che rimuovono il GABA dalle sinapsi spegnendone il segnale. Dal punto di vista farmacologico, la sintesi del GABA e l’attività dei trasportatori sono regolabili. Se si vuole ridurre la quantità di GABA presente nel sistema si può usare l’acido 3-mercaptopropionico: inibizione dell’enzima GAD e riduzione della quantità di GABA.

Se invece si vuole potenziare il sistema GABAergico si agisce sui trasportatori: la tiagabina inibisce il trasportatore GAT-1, così che il GABA rimanga più a lungo sulla sinapsi. L’attività del sistema è regolata anche dai recettori pre-sinaptici (autorecettori): quando il GABA lega questi recettori, si riduce il rilascio del neurotrasmettitore stesso. L’enzima GAT (GABA-transaminasi) è presente anche sulle cellule della glia che rimuovono il neurotrasmettitore dalla sinapsi; l’attività della GAT distrugge il GABA e genera glutammina che è un intermedio sia del glutammato sia del GABA ed è molto diffusibile tra le membrane biologiche e NON ha attività né sui recettori GABA né sui recettori del glutammato: il Vigabatrin inibisce il funzionamento della GABA-transaminasi, impedendo la generazione di glutammina diminuendo la funzionalità del sistema. Il modo migliore per attaccare la sinapsi del GABA è agire sui recettori GABA_A sul recettore pre-sinaptico.

Quando il GABA è rilasciato sulle sinapsi si hanno 2 risposte:

• Risposta molto veloce dei GABA_A: caratteristica dei recettori canale; in pochi millisecondi (15 ms) il recettore GABA_A risponde aprendosi e facendo entrare cariche negative nel terminale post-sinaptico.
• La sinapsi ha un secondo picco di risposta legata al recettore GABA_B: meccanismo più lento ma più duraturo nel tempo.

Le 2 risposte si distanziano nel tempo ma si sommano. Quando aggiungiamo una benzodiazepina (modulatore allosterico positivo che potenzia le correnti al cloro) abbiamo un aumento violento della risposta alla prima fase; la seconda parte rimane inalterata.

Per misurare questi effetti è fondamentale la tecnica del patch clamp (ideata da Neher e Sakmann), che permette di dividere le risposte generate dai neurotrasmettitori e dai farmaci stessi su un sistema complesso come la sinapsi. Si tratta di studi soprattutto di correnti su singolo canale. Le informazioni ottenute vanno unite e utilizzate per descrivere come un farmaco agisce sulla sinapsi.

Tecniche di elettrofisiologia

Le tecniche di elettrofisiologia permettono di capire:

• Il numero di stati in cui un recettore può esistere: i recettori NON sono sempre aperti o sempre chiusi; possono essere aperti, chiusi o refrattari e NON tutti contemporaneamente.
• Il tempo medio di permanenza in ciascuno stato
• La probabilità che un canale ha di trovarsi in quello stato
• Le velocità di transizione tra gli stati

La farmacologia ricerca molecole capaci di riconoscere NON solo il canale, ma se possibile anche lo stato funzionale di quel canale. Mettendo i tracciati nella sinapsi GABAergica otteniamo questo tipo di informazione:

1. In 15 msec, dopo aver fornito GABA, si ha apertura dei canali GABA_A risposta inibitoria rapida. Ogni spike rappresenta l’apertura dei canali e l’ingresso di ioni cloro: dal tracciato si capisce che NON tutti i canali sono aperti contemporaneamente, ma si aprono alternativamente passando da stato aperto a chiuso e viceversa. Il neurotrasmettitore spinge lo stato funzionale del canale verso la sua forma aperta; i neuroni post-sinaptici iperpolarizzano.
2. Se si aggiunge una benzodiazepina (nell’esempio Flunitrazepam, antagonista del sito di legame delle benzodiazepine molto potente ed efficace) oltre al GABA, gli spike aumentano enormemente, perché aumenta il numero dei canali GABAergici che fanno entrare cloro rispetto a quelli chiusi, aumentando la frequenza di apertura di canali al cloro che hanno già legato sulla subunità β 2 molecole di GABA. L’equilibrio si sposta verso il canale aperto. La benzodiazepina da sola NON funziona.

Se si fornisce GABA si misura una corrente al cloro, di circa 2 mA. Se si fornisce la benzodiazepina senza GABA, NON ho alcuna corrente al cloro sulla sinapsi. Se oltre alla benzodiazepina si fornisce GABA, allora si ha una maggiore apertura dei canali al cloro, che si aprono più frequentemente e rimangono aperti più a lungo. Sulla sinapsi misuriamo la corrente al cloro quando si aumenta la concentrazione di GABA: ad una certa concentrazione il GABA ha una sua risposta massima. La benzodiazepina NON cambia né la risposta massima né l’efficacia del GABA: aumenta la potenza del GABA; ottengo una risposta maggiore ad una concentrazione minore di GABA. La benzodiazepina agisce solo su sinapsi già attivate dal GABA.