Appunti di Citologia e istologia (prof. Bacci, prof. Vanzi)

Citologia e istologia

CdL in Scienze biologiche, II semestre A.A.2014/2015, prof. Stefano Bacci

Livelli di organizzazione della materia vivente

La materia vivente è caratterizzata da 3 proprietà fondamentali che sono:

• Organizzazione secondo un piano strutturale
• Capacità di adattamento con l'ambiente
• Capacità di riprodursi

1) La materia vivente si presenta sotto forma di organismi limitati nello spazio. La capacità della materia vivente di mantenere costanti certe caratteristiche come la costituzione chimica o la temperatura è detta omeostasi.

2) L'adattabilità è la capacità di interagire con l'ambiente, modificando sia questo sia la materia vivente stessa in modo da garantire la continuità dei processi vitali. L'adattabilità deriva a sua volta da altre proprietà: l'irritabilità, la motilità, l'assorbimento, la secrezione, la capacità di realizzare reazioni chimiche, la variabilità e la capacità di realizzare fenomeni elettrici e luminosi.

3) La capacità di riprodursi indica la possibilità di dare origine a nuova materia vivente.

Strumenti di studio

La microscopia ottica si basa sull'impiego della luce, quella elettronica sull'utilizzo di elettroni.

• Microscopio ottico: basato sull'interazione tra un raggio luminoso e il campione in esame. È costituito dal condensatore, l'obiettivo ed un oculare montati sullo stesso asse ottico all'estremità di un tubo metallico. L'obiettivo è rappresentato da un doppio sistema di lenti convergenti che proietta l'immagine ingrandita ed invertita dell'oggetto sotto osservazione.
• Microscopio a fluorescenza: il preparato viene illuminato con luce ultravioletta e i suoi componenti vengono analizzati in base alla fluorescenza emessa. La fluorescenza è la proprietà di alcune sostanze di assorbire radiazioni ultraviolette ed emettere radiazioni visibili. Si può parlare di fluorescenza primaria o autofluorescenza quando i composti biologici emettono naturalmente fluorescenza; si parla di fluorescenza secondaria o indotta quando i componenti biologici emettono fluorescenza solo dopo marcatura con fluorocromi.
• Microscopio confocale: consente la visione di cellule e tessuti in vivo. Si differenzia da uno a fluorescenza per l'utilizzo di una sorgente luminosa laser, per la presenza di un sistema ottico ed elettronico che permette di effettuare la scansione di una sezione del campione osservato ricostruendo poi l'immagine ottenuta su un computer.
• Microscopio a campo oscuro: le cellule viventi prive di pigmenti non sono chiaramente visibili al microscopio "con uno sfondo chiaro" per la scarsa differenza di contrasto che esiste tra le cellule e l'acqua. Il microscopio a campo oscuro si ottiene facendo apparire le cellule del campione chiare su sfondo scuro.
• Microscopio a contrasto di fase: sfrutta l'interferenza tra la luce diretta proveniente dalla sorgente e quella deviata dal preparato. Viene usato spesso per i tessuti biologici perché ha il vantaggio di non dover ricorrere a coloranti consentendo così l'osservazione di preparati viventi.
• Microscopio polarizzatore: è un microscopio ottico modificato per usare luce polarizzata per l'osservazione dei campioni.
• Microscopio elettronico a trasmissione: Il campione in esame viene colpito da un fascio di elettroni. Questo microscopio comprende una sorgente di elettroni associati, una serie di lenti elettromagnetiche ed un dispositivo di visualizzazione degli elettroni. L'immagine è data dagli elettroni che hanno attraversato le zone elettrotrasparenti del preparato. Con la microscopia elettronica non si può osservare materia viva.

Unità di misura e potere di risoluzione

• 1 μm = 1/1000 mm
• 1 nm = 1/1000 μm
• 1° = 1710 nm
• Occhio umano: minima distanza percepita fra due oggetti 100 μm (0,1 mm)
• Microscopio ottico: minima distanza percepita fra due oggetti 200 nm (0,2 μm)
• Microscopio elettronico: minima distanza percepita fra due oggetti 1 nm

Sono isotrope le sostanze composte da molecole disposte in modo disordinato (vetro), sono anisotrope quelle costituite da elementi con una struttura ordinata periodica (cristalli).

Altre tecniche

Il criodecappaggio è una tecnica di laboratorio basata sulla possibilità di ottenere repliche ‘fedeli’ delle superfici di materiali biologici (cellule o tessuti) dopo averli congelati sottovuoto a bassissime temperature (in presenza di un criopreservante che non fa formare cristalli di ghiaccio), evitando l’uso di fissativi chimici. Quando l’oggetto è congelato viene tagliato da una lama, anche essa congelata, su piani preferenziali. La superficie fratturata viene sublimata per eliminare l’acqua in eccesso e poi viene stratificata con platino e carbonio in modo che si abbia una replica della superficie da analizzare al microscopio elettronico.

Studio della materia vivente

Le tappe principali dell’allestimento di un preparato microscopico sono:

• La fissazione
• La sezione
• La colorazione istologica

1- La fissazione consiste in un trattamento che stabilizzi la sostanza in condizioni più simili possibili a quelle dello stato vivente, in modo da impedirne l’alterazione. Un fissativo importante è l’aldeide formica al 4%. Per il microscopio ottico si usa la formalina al 10%.

2- La sezione permette invece di rendere il preparato attraversabile dalla luce (per il microscopio ottico) e dagli elettroni (per il microscopio elettronico).

3- La colorazione consiste nel trattamento del preparato con sostanze colorate (microscopio ottico) oppure opache agli elettroni (microscopio elettronico) e questo permette di rendere visibili le differenze tra le varie strutture. I coloranti si dividono in acidi e basici: Acidi sono quei coloranti in cui la parte che si attacca al tessuto e gli conferisce il colore è un anione (cioè ha carica elettrica negativa); Basici sono quelli in cui la parte responsabile della colorazione è un catione (carica elettrica positiva). Si parla di Basofilia per indicare l’affinità con coloranti basici, di acidofilia per indicare affinità con i coloranti acidi. La colorazione più usata è quella con ematossilina eosina (microscopio ottico), sono due coloranti che fanno apparire il nucleo, che è basofilo, di colore blu-violaceo e il citoplasma, che è acidifico, rosa.

L’azione dei coloranti dipende dall’affinità chimica tra i vari costituenti del tessuto e dei coloranti, dalla concentrazione dei vari costituenti e dalla loro permeabilità.

Tipologie di colorazione

L’ematossilina è una sostanza che si estrae dal legno e di per sé è incolore. Colora quando è ossidata ad ematina con l’aggiunta di un mordenzante. Questi coloranti colorano progressivamente e sono dette lacche alluminiche o ferriche a seconda del mordenzante usato. L’eosina è un colorante xantenico acido e quindi basofilo.

L’impregnazione argentica è possibile impartire un contrasto tra le varie parti del preparato anche mediante un trattamento con sali metallici che precipitano in certe aree e in altre no, le tecniche che si basano su questo sono dette impregnazioni. Con il termine Argyrofilia si indica l’affinità di un dato substrato organico a legare sali d’argento. Golgi ideò un metodo che consente di visualizzare interi neuroni in preparati fissato con bicromico di potassio e impregnati con nitrato di argento. Un altro metodo è quello di Cajal in cui i frammenti di tessuto dopo la fissazione vengono impregnati per molti giorni con una soluzione di nitrato di argento e poi vengono trattati con un agente chimico riducente.

Citochimica e istochimica

Queste tecniche usano metodi atti a localizzare (al microscopio ottico o elettronico) la presenza di determinate sostanze nella cellula e a risalire alla loro composizione chimica. Si tratta di metodi di analisi in situ.

Ci sono molti componenti della cellula che possono essere identificati con specificità: lipidi, polisaccaridi, proteine (enzimi) e acidi nucleici. La loro identificazione viene effettuata per mezzo di alcuni coloranti:

• Identificazione dei lipidi: come il Sudan nero B, Sudan III, Solfato di blu Nilo etc tutti liposolubili. Tali coloranti si sciolgono nei grassi contenuti nelle cellule grazie alla maggiore affinità verso i grassi rispetto al solvente in cui sono disciolti, solitamente alcool etilico.
• Identificazione dei polisaccaridi: Il metodo più classico per evidenziarli è la reazione PAS (Acido Periodico-Schiff), serve soprattutto per mettere in evidenza i polisaccaridi neutri (glicogeno, mucina, amido). I gruppi ossidrilici (OH) degli zuccheri sono ossidati dall’acido periodico con la formazione di gruppi aldeidi (CHO). Il reattivo di Schiff è incolore ma reagisce con tali gruppi virando a rosso-magenta. I polisaccaridi acidi vengono evidenziati con coloranti come Alcian Blu, inoltre sono basofili e metacromatici. Alcuni coloranti basici colorano certi componenti tissutali con un colore differente dal proprio: questo si chiama Metacromasia. La Metacromasia è un fenomeno per cui alcuni coloranti colorano i tessuti con un colore diverso dal proprio (Blu di toluidina), si verifica con sostanze come i proteoglicani ed è in relazione con la disposizione ed il numero di molecole dei radicali anionici che sporgono sul contorno delle molecole. Quando i radicali sono pochi e distanziati la colorazione risulta bluastra. Quando i radicali sono molti e vicini tra loro la colorazione è rosso-violetto.
• Identificazione delle proteine: con la colorazione istochimica si può osservare il prodotto della reazione substrato/enzima ma non l’enzima.
• Identificazione degli acidi nucleici: il DNA è in grado di legare il reattivo di Shiff formando un composto colorato dopo una idrolisi acida ottenuta con acido cloridrico. Questa idrolisi separa le basi azotate dallo zucchero il cui gruppo aldeidi è libero di reagire con il reattivo di Schiff. Alcune altre sostanze fluorescenti colorano il DNA legandosi alle coppie di basi: Adenina-Timina (quinacrina e DAPI) oppure Guanina-Citosina (cromomicina A3).

Altre tecniche

Citochimica di affinità: sono un insieme di tecniche che sfruttano il legame specifico tra un ligando e un sito di legame.

• Ligando: molecola estranea ad un compartimento della materia vivente, capace di legati in modo specifico ad una molecola di tale compartimento.
• Sito di legame: molecola di un compartimento della materia vivente capace di legarsi in modo specifico ad un ligando. L’unione tra ligando e sito di legame è garantita da una serie di legami deboli ma efficaci poiché numerosi.
• Recettore: sito di legame tale per cui alla sua unione con il ligando segue una risposta da parte del compartimento della materia vivente in cui si trova il recettore stesso.

Immunoistochimica: è una tecnica in grado di individuare specifiche molecole o strutture dei compartimenti intra o extracellulari basandosi sulla specificità della reazione antigene/anticorpo. Ogni antigene è caratterizzato da uno o più siti specifici detti epitopi; nel caso degli antigeni proteici ogni epitopo consta di un segmento di circa 10 amminoacidi. Gli anticorpi constano di una porzione capace di legarsi all’ aptene e di una porzione costante per gli anticorpi di una stessa classe tanto da essere cristallizzabile. La reazione antigene/anticorpo avviene grazie a legami deboli che sono efficaci perché numerosi. Da questo deriva l’importanza per caratterizzare l’epitopo, non solo della presenza in esso di vari gruppi chimici ma anche della sua forma nello spazio.

Ibridazione in situ: consente la localizzazione di specifiche sequenze di DNA o RNA su cellule o tessuti. Si basa sul principio che sequenze di nucleotidi complementari sono in grado di appaiarsi fra loro in particolari condizioni sperimentali, la marcatura di una delle due sequenze permette di localizzare la sequenza bersaglio a cui si appaia.

Analisi di immagine: L’analisi di immagine consente di calcolare, partendo da un’immagine simile a quella elaborata dal nostro sistema visivo, parametri come forma, numero e densità ottica di ogni parte identificabile dell’immagine di partenza. L’analisi di immagine consiste nella manipolazione ed analisi di informazioni scientifiche rappresentate come immagini. Per fare ciò occorre una strumentazione di base costituita da un computer munito di un dispositivo in grado di catturare immagini (telecamera) collegato ad una scheda che traduce le immagini in digitale, cioè in forma leggibile e interpretabile dal computer.

Istoautoradiografia: è una tecnica attraverso la quale è possibile rilevare una struttura (o anche un gruppo di molecole) all'interno di un campione. Questo procedimento è utilizzato nelle analisi istochimiche, ad esempio per ricercare specifiche classi organiche o strutture cellulari. Il principio si basa sulla capacità di opportune molecole, marcate radioattivamente, di incorporarsi nelle strutture biologiche. Le molecole marcate possono essere rilevate, successivamente, attraverso differenti metodi, la maggior parte dei quali prevede l'utilizzo di supporti simili a lastre fotografiche.

È un metodo che serve per fare esperimenti su cellule e organismi viventi. Serve inoltre per studiare sintesi e traslocazione di prodotti tramite un precursore che è assorbibile, specifico di un ciclo metabolico e radioattivo per la presenza nella molecola di un atomo radioattivo (preferibilmente emittente beta a bassa energia). Serve anche per studiare l’assorbimento e la traslocazione di macromolecole, rese radioattive in via biosintetica o coniugate con sostanze radioattive.