Appunti di Citologia

Citologia

La cellula

Cosa fa la biologia? La biologia studia tutto ciò che riguarda la vita e gli esseri viventi. Cosa significa vivere? Vivere sarebbe l’insieme delle funzioni che rendono un organismo animale o vegetale capace di conservarsi, svilupparsi, riprodursi e mettersi in contatto con l’ambiente esterno e gli altri organismi. Ogni essere vivente avrà un ordine di complessità legato direttamente al loro livello di organizzazione. Tutti gli organismi viventi sono costituiti da cellule, ovvero unità fondamentali ricoperte da membrana e in grado di svolgere le loro funzioni come riprodursi. Ogni componente è in stretta collaborazione con gli altri.

Le cellule dunque sono l'unità fondamentale della vita, esse sono piccole unità racchiuse da una membrana e piene di una soluzione acquosa concentrata di sostanze chimiche, capaci di crescere e dividersi creando loro copie. Nella cellula tutto è organizzato e nulla è lasciato al caso, pertanto ciò che avviene non è fine a se stesso ma ad altre reazioni. Le forme viventi più semplici sono quelle unicellulari (batteri, amebe, lieviti, microrganismi) mentre quelle più complesse sono quelle pluricellulari come l'essere vivente.

Gli organismi «superiori», compresa la specie umana, sono comunità di cellule derivate per crescita e divisione da una singola cellula fondatrice e sono costituiti da un numero variabile di cellule: da poche decine a 30 miliardi nell’uomo. Le specie viventi totali identificate sono attualmente circa 100 milioni ma ognuna di esse possiede cellule differenziate.

La dimensione delle cellule è molto piccola, tra 1 e 100 micrometri, in maniera tale da rendere più agevole determinate funzioni come quella della membrana di mantenere protezione e sostegno, scambio più facilitato dei nutrienti e sostanze sulla superficie, un’adeguata concentrazione interna di molecole coinvolte nei processi cellulari e per favorire lo spostamento delle stesse in un minor tempo. La superficie della cellula dipende dal quadrato del raggio, mentre il volume dal cubo del raggio (A= 4πr², V= 4πr³/3) mantenuti in proporzione per lo scambio di nutrienti.

Alcune eccezioni tra le comuni cellule sferiche sono il neurone che ha molte propagazioni, ma molto sottili quindi efficienti per il trasporto e lo scambio di sostanze, le alghe unicellulari; le uova, pur essendo talvolta enormi, sono in gran parte occupate da sostanze nutrienti di riserva la cui porzione metabolicamente attiva, è limitata ad una piccola e sottile area superficiale di poche decine di µm, mentre il resto è di supporto e protezione all’embrione. Inoltre alcune hanno più nuclei come i sincizi e i plasmoidi, cellule del muscolo scheletrico.

La legge di Driesch enuncia che le cellule devono rimanere piccole in ogni organismo per avere un buon funzionamento, variando però per forma, metabolismo (ossigeno, aria, acqua ecc) e specifiche funzioni (alcune sono motori, altre generatori elettrici). Le funzioni principali di una cellula sono di protezione (membrana), demolizione e trasformazione (organelli) e trasmissione dell’informazione (genoma). Theodor Schwann e Matthias Schleiden (1838), e successivamente Rudolf Virchow (1855) formularono la prima teoria cellulare che affermava che tutti gli organismi fossero costituiti da una o più cellule; identificarono la cellula come la più piccola entità vigente identificabile e autonoma; tutte le cellule derivano da cellule preesistenti.

Ad oggi ciò che permette ad una cellula di essere autonoma è il possesso di un genoma, la trasmissione dell'informazione contenuta in esso, l'utilizzazione dell'energia per formare componenti più complessi e la presenza di una membrana plasmatica che separi la cellula dall'ambiente. A ciò ovviamente vanno aggiunte eccezioni: esistono di tessuti con sostanze extracellulari e l'autonomia cellulare non è assoluta ma favorita da inibizioni tra cellule e da contatto.

Procarioti ed eucarioti

Gli organismi si distinguono in eucarioti e procarioti.

Procarioti: non hanno nucleo ma una porzione codificante circolare, non hanno organelli intracellulari, hanno la parete cellulare attorno la membrana plasmatica e non hanno il sistema di membrane, hanno forma sferica, elicoidale o a bastoncello. La loro dimensione è di 2 micrometri. Sono unicellulari ma spesso si organizzano a catenelle favorendo una crescita esponenziale, per riproduzione asessuata, in determinate condizioni ambientali, tanto da esistere circa 500 specie batteriche (eubatteri e archea); riescono a sopravvivere grazie all’utilizzo di sostanze organiche, carbonio e zolfo.

I procarioti si dividono in due:

• Batteri (eubatteri): maggior parte dei procarioti che si incontra nella vita di tutti i giorni (responsabili di malattie, nel suolo…).
• Archea (archeobatteri): vivono anche in habitat estremi (sorgenti vulcaniche, fondali marini, fanghi dei depuratori fognari, pozze coperte di ghiaccio dell’Antartide stomaco dei ruminanti…).

Un'eccezione alla teoria cellulare sono i virus (viroidi per vegetali), parassiti endocellulari obbligati, i quali fondono il proprio DNA virale con quello della cellula infettata, producendo diverse copie del virus; essi sono capaci di riprodursi ma al di fuori della cellula ospite sono inerti in quanto non hanno un metabolismo autonomo e non hanno un apparato per la sintesi proteica. Sono i responsabili dell'epatite C (virus di molecola di RNA a unico filamento) o dell'HIV (due copie di RNA). O il prione, una molecola proteica che in particolari condizioni modifica la propria configurazione acquisendo la capacità di trasmettere i propri caratteri alle molecole sane alterandone il significato biologico.

Eucarioti: includono gli organismi animali, piante, funghi, protisti unicellulari e pluricellulari. Nella cellula eucariota troviamo organelli intracellulari che cooperano al funzionamento della cellula. La cellula internamente è immersa da una sostanza fondamentale, il citoplasma, tra nucleo e membrana e include tutti gli organelli; la sua composizione è di citosol, enzimi, sali minerali e proteine solubili e non comprende gli organelli. Il nucleo racchiude il DNA ed è rivestito da un involucro nucleare a doppia membrana.

Troviamo un sistema di endomembrane dei vari organelli in relazione le une con le altre ovvero il reticolo endoplasmatico (liscio e rugoso), il Golgi, vescicole, membrana, lisosomi, involucro nucleare. Si riproducono per via sessuata ed asessuata e le dimensioni vanno da 10 a 100 micrometri. Gli eucarioti si sono originati da cellule procariotiche 1.5 miliardi di anni fa.

Le teorie di origine degli eucarioti dai procarioti sono tre: teoria della fusione tra cellule più piccole e cellule più grandi, teoria dell’invaginazione (l'invaginazione della membrana plasmatica dei procarioti ha dato origine agli organelli intracellulari ed al sistema di endomembrane) e teoria dell’inglobamento o endosimbionte (due organismi che vivono in stretta collaborazione, uno all’interno dell’altro, traendone reciproco vantaggio).

Metodi di studio della cellula

L’origine della citologia risale alla fine del 1500 con l’invenzione del microscopio ottico composto ad opera di Zacharias Janssen. Le cellule vennero scoperte grazie a macchinari, come il microscopio del 1655 di Hooke; a partire dallo studio del sughero vennero individuate porzioni microscopiche, le cellule, che vennero definite “celle”. A questo seguì la scoperta dei batteri e dei protozoi. I primi microscopi veri e propri nacquero nel 1800 a seguito dei quali si ebbero ulteriori scoperte come quella di Brown del 1833 che identificò il nucleo delle cellule di orchidea che definì "nocciolo" e nel ‘57 i primi mitocondri muscolari.

Si venne a formulare una teoria cellulare di base secondo la quale ogni organismo era costituito da cellule le quali inevitabilmente derivavano da precedenti. Theodor Schwann e Matthias Schleiden (1838), e successivamente Rudolf Virchow (1855) formularono la prima teoria cellulare.

Lo studio di una cellula può avvenire a livello morfologico, analizzando la sua composizione e organizzazione, o a livello biochimico scegliendo di concentrarsi sulle sue reazioni chimiche. L’utilizzo del microscopio permise di aumentare il livello di approfondimento degli studi aumentando la risoluzione rispetto ad una semplice osservazione umana. La risoluzione è la distanza minima in cui si possono riconoscere diversi elementi significativi. La risoluzione dell’occhio è di 200 micrometri, il microscopio elettronico arriva fino a 2 Amstrongs e quello ottico fino a 0,1 nanometri (2000 A) con un limite di ingrandimento utile fino a x1000 ovvero a livello del nucleo/cromosomi cellulari.

I principali microscopi in uso sono: microscopio ottico, microscopio elettronico, microscopio a fluorescenza e la tecnica F.T.I.R. di Fourier.

Microscopio ottico

Può essere convenzionale colorando i tessuti per mettere in evidenza le strutture; a contrasto di fase prevedendo un’osservazione a fresco senza l’utilizzo di coloranti, utile per conteggiare; a fluorescenza per la localizzazione delle strutture della cellula, grazie ad anticorpi con cui il campione viene colorato coniugati con fluorocromi che reagiscono alla luce di una certa lunghezza d’onda emettendo così una radiazione blu, rossa o verde. Vengono utilizzati diversi anticorpi per evidenziare diverse porzioni; infine confocale: permette di mettere a fuoco piani diversi per ottenere immagini 3D con angolature e profondità, senza l’utilizzo di sezioni ma grazie alla ricostruzione in toto a partire da singole immagini.

Un cellula al microscopio è scarsamente visibile, in quanto trasparente e praticamente incolore. Occorre utilizzare coloranti per aumentare contrasto tra le varie componenti della cellula. Esistono i coloranti vitali grazie ai quali le cellule possono essere colorate senza fissazione e sono quindi solo minimamente alterate dal trattamento. Oggi vengono utilizzati coloranti fluorescenti per colorare selettivamente strutture cellulari diverse.

Nei coloranti che richiedono fissazione le cellule devono essere disidratate prima della colorazione, con possibile alterazione delle strutture cellulari e della forma delle cellule. La fissazione prevede l’utilizzo di un campione morto che verrà fissato con il congelamento oppure chimicamente.

Allestimento del campione

Le dimensioni del campione devono essere di almeno 1cm³ per evitare che siano artefatti; quando si utilizzano campioni biologici come tessuti occorre che essi siano sottoposti a fissazione chimica o fisica per evitare l’azione di enzimi litici che lo porterebbero al suo degrado. La fissazione chimica si effettua grazie a fissativi (formaldeide) sottoposti al campione per circa 24h. La fissazione fisica prevede il congelamento a -80°C del campione per evitare il decadimento del tessuto.

Successivamente si creerà una scala degli alcoli a partire dal 70/75% per effettuare la disidratazione e si utilizzerà la paraffina fusa, con all’interno il campione, in maniera tale da avere una sorta di blocco che permetterà di sezionare il campione. Il blocchetto con campione fissato e paraffina verrà messo nel microtomo (1-10 micrometri) che provvederà a creare sezioni sottili poste sul vetrino per essere studiate al microscopio. In alternativa si può utilizzare il criotomo (5-20 micrometri) a -20°C per tagliare il campione o il vibratomo per il suo taglio a fresco senza fissazione (20-50 micrometri). Il taglio può essere: sagittale, trasversale o frontale e viene determinato in base alla tipologia di campione che si sta studiando, prima che la paraffina solidifichi.

Per rendere visibile i vari compartimenti cellulari effettuando lo studio morfologico, occorre sottoporli a colorazione: i coloranti per eccellenza sono l’ematossilina, in genere blu porpora, utilizzata per campioni con cariche negative come il DNA (basofile), l’eosina, di colore rosso-arancio per cariche positive come proteine del citosol (acidofile).

Tra i coloranti basofili c'è la fucsina acida che colora strutture acidofile: il citoplasma, le fibre di collagene i mitocondri ed i lisosomi. Altri coloranti acidofile invece sono il blu di metilene/ blu di toluidina che colorano strutture basofile come nucleo e reticolo endoplasmatico rugoso.

Altri coloranti:

• Impregnazione argentica: ideata da Camillo Golgi (premio Nobel 1906) che permise di studiare l’anatomia microscopica dell’intero sistema nervoso.
• PAS: Acido Periodico – Reattivo di Schiff. Colorazioni di specifiche dei polisaccaridi e glicogeno.
• Alcian blu: per colorazioni di specifiche componenti extracellulari come il muco.
• Sudan III, sudan nero o solfato di blu Nilo: coloranti liposolubili per i lipidi poiché il campione non può essere trattato con alcool. La loro fissazione avviene tramite congelamento e taglio al criostato poiché si sciolgono nei solventi.

I fluidi come il sangue e la linfa presenti nei tessuti o negli spazi interstiziali non si colorano e si riconoscono grazie ad ampi spazi bianchi; lo stesso caso avviene nei lipidi che non si colorano.

Microscopio elettronico

Può essere a trasmissione (TEM) e a scansione (SEM). Il microscopio elettronico a trasmissione ha un limite di risoluzione di 0,2 nanometri e prevede l’utilizzo di un fascio di elettroni con lunghezza d'onda corta, che permette immagini più dettagliate. Il campione morto viene sottoposto a fissazione con glutaraldeide o tetrossido di osmio, a disidratazione e intrappolato in resine epossidiche, in maniera da avere sezioni molto sottili di 50-100 nanometri. Come colorante si utilizzano coloranti elettronici ovvero sostanze dense agli elettroni come sali di piombo, capaci di legarsi alla cellula in maniera selettiva. Lo scopo è di dare contrasto o per marcare anticorpi.

Il SEM si utilizza per lo studio delle superfici cellulari e prevede (dopo il trattamento con glutaraldeide o tetrossido di osmio) la loro copertura con sottili strati di metalli pesanti come oro fuso posto in camera e che permetterà al detector di ricostruire l’immagine grazie al fascio di elettroni rifratti che varieranno per quantità ed energia. La risoluzione è minore rispetto a quella del TEM.

FTIR di Fourier

Questa tecnica accoppia la microscopia alla mappa chimica del campione e prevede l’utilizzo di un macchinario specifico ad uso bellico poco prodotto. Fornisce informazioni dettagliate rispetto ad una semplice osservazione grazie alla mappa chimica, a falsi colori dei caratteri, che permette di analizzare i rapporti su stress ossidativo e fornisce informazioni riguardo lo spettro di assorbimento e la distribuzione degli elementi e la loro concentrazione e composizione biochimica, permettendo ad esempio l’individuazione delle cellule tumorali. Ogni immagine è in pixel.

Modelli sperimentali

La sperimentazione animale risale al tempo classico. Nel 18esimo secolo avvennero i primi veri e propri esperimenti arrivando fino ad oggi i quali avvengono su specifici modelli con costi e vantaggi propri per determinate ricerche (organo vs intero organismo). I modelli vengono utilizzati poiché presentano il vantaggio di ricondurre caratteristiche specifiche a livello generale.

I modelli maggiormente in uso sono:

• Escherichia coli: cellula batterica utilizzata per replicazione di DNA e traduzione degli RNA in proteine. Vive nell'intestino umano ma anche nelle colture.
• Lievito di birra (Saccharomyces cerevisiae): utilizzato per la divisione cellulare. È un fungo.
• Erbetta selvatica (Arabidopsis thaliana): utilizzata per l’evoluzione di piante a fiore e lo studio della fisiologia delle piante. Produce migliaia di discendenti nel giro di 8 settimane.
• Moscerino della frutta (Drosophila melanogaster): utilizzato per malattie umane e genetica classica. Ha permesso di dimostrare la trasmissibilità dei geni e i meccanismi genetici alla base dello sviluppo embrionale.
• Verme del suolo (Caenorhabditis elegans): utilizzato per il suo alto numero di mutanti, ha permesso di chiarire il processo dell'apoptosi, grazie alla sua morte pulita.
• Zebrafish (Danio rerio): è un pesce osseo, utilizzato perché è un basso vertebrato e di facile mantenimento. In 90 giorni è già adulto e quindi permette di compiere esperimenti su tutta la vita, presentando inoltre l’85% del suo genoma in comune con quello umano. I suoi embrioni sono trasparenti e mutanti.
• Nothobranchius furzeri: ha una vita molto breve a causa della siccità poiché africano edunque viene usato per lo studio dell’invecchiamento. Il maschio ogni giorno sceglie la femmina e si riproducono fecondando embrioni che si incistano ovvero cadono sul fondale secco. Lo sviluppo avviene man mano che ci sono precipitazioni piovose e le schiuse sono alternate per evitare di mettere a rischio tutta la progenie (prima ambiente acido poi rimessi in acqua quando ci sarà il giusto momento). Hanno una doppia regolazione per la schiusa: sia determinata dai movimenti, sia da regolazioni enzimatiche grazie all’intervento di pre-enzimi; a contribuire per la schiusa è la presenza del sole, essendo fotosensibili.
• Homo sapiens: utilizzato per sperimentazioni sull’effetto di ormoni, fattori di crescita, inquinamento e lo studio avviene grazie a colture cellulari.
• Topo (Mus muscolo): permette di generalizzare e rendere comuni gli studi con l’organismo dell’uomo grazie all'omologia con i geni umani.

In Europa la legge 2014 regola le sperimentazioni su animali vivi per i ricercatori. Per effettuare queste ultime occorre avere determinati stabulari e tutto il corredo per la sperimentazione in norma con ciò che la Costituzione prevede. Prima di tutto occorre compilare un modulo che descriva l’esperimento e il numero di campioni in uso da sottoporre ad analisi.