Lezioni: Appunti di Biologia molecolare

HOTAIR. HOTAIR

Lega anche lui due mediatori epigenetici che sono PRC2 e LSD1. Il lncRNA è in grado di riconoscere sequenze

specifiche sul DNA. Quindi hanno un ruolo nella specificità della regolazione epigenetica proprio per questo,

nel senso che traghettano LSD1 o PRC2 a livello dei loci di DNA complementari quindi sono sicuramente

mediatori di specificità dei processi epigenetici.

lncRNA

Non fanno solo questo: agiscono da scaffold per numeose proteine e da decoys si a per proteine sia per RNA

e così facendo hanno un ruolo molteplice in quanto regolano numerose funzioni.

Infatti possono agire come scafold tra due proteine mettendo in comunicazione due proteine che non

presentano domini di interazione proteina-proteina. Possono interagire con fattori trascrizionali e quindi

andare a inibire un fattore trascrizionale impedendone l’attacco al promotore. Si è visto anche che possono

agire come decoy per miRNA normali quindi interagiscono con essi e impediscono che leghino gli RNA target

e regolano cosi indirettamente la sintesi proteica.

RUOLO DEI MIRNAs NELL’ONCOLOGIA

Il primo lavoro viene dal gruppo di Carlo Croce (ha clonato Bcr2, ha scoperto il cromosoma Philadelphia,

insomma un figo).

MiRNA

Piccoli RNA (18-24 nt, in genere 21), sono endogeni anche nei mammiferi quindi anche nell’uomo, mentre ad

esempio i siRNA nell’uomo non sono endogeni. Sono presenti nel genoma umano dove sono un po’

ovunque: dentro introni, dentro geni codificanti proteina, in alcuni casi hanno seq regolatorie indipendenti in

altri casi no quindi la loro espressione può dipendere o meno dal gene/introne in cui sono ospitati. Sono stati

trovati anche nelle regioni intergeniche in particolare sono molto presenti nelle regioni di DNA ripetuto, isole

CpG e quindi subiscono obiettivamente molto la regolazione epigenetica. Le isole CpG sono metilate nelle

cellule normali, demetilate nelle cellule tumorali, e questo fa capire che i microRNA subiscono importanti

modifiche nello stadio normale rispetto quello alterato.

Possono essere trascritti come mono microRNA o come cluster, quindi mono o poli-cistronici. Anche questo

è importante perché se il miRNA appartiene a un cluster è trascritto come policistronico e se troviamo in un

tumore alterato un solo miRNA (come spesso succede), è bene sapere se questo è trascritto in cluster con

altri miRNA, per poi andare a verificare se la alterazione è unica di quel miRNA o meno: spesso, se si trova in

un cluster, tutti i miRNA del cluster sono alterati.

I miRNA fino a pochi anni fa sembravano determinare nell’uomo inibizione della traduzione mentre nelle

piante anche degradazione dell’mRNA. Oggi non è più vero: si è visto anche nell’uomo che molti miRNA

determinano degradazione dell’mRNA e regolano i livelli di mRNA attraverso processi più complessi ovvero

regolando la stabilità del messaggero stesso. Quindi possiamo continuare ad affermare è che il fatto che il

miRNA degradi il mRNA o agisca inibendo la traduzione dell’mRNA dipende da quanto è perfetto

l’appaiamento con l’mRNA target. Si sa esistere una regione che è la seed region, in cui l’appaiamento è

sempre perfetto, i nt 10-11 non hanno complementarietà e il resto della regione, la seed match, ha

complementarietà variabile. Quando quest’ultima regione ha complementarietà molto alta il miRNA fa sì che

avvenga degradazione dell’mRNA, quando invece questo non succede il miRNA tende a privilegiare la strada

della inibizione della traduzione.

Quello importante dal pdv funzionale è che la funzione del miRNA dipende dal suo target. Questo non è così

banale poiché dicendo che i miRNA non si appaiano in modo perfetto, diciamo anche che i miRNA avranno

anche tanti target, con cui si appaieranno di più o di meno. In genere si pensa un centinaio di target per ogni

miRNA. L’altro aspetto di qeusto è che se tanti miRNA possono regolare lo stesso target, significa anche che

lo stesso target potrà essere regolato da tanti miRNA, quindi esiste un fenomeno di sinergia fra miRNA

diversi che possono concorrere a determinare lo stesso tipo di alterazione in quanto concorrono ad alterare

lo stesso tipo di target.

Come capire quali sono i target dei miRNA? Il primo passo è quello di farsi aiutare da programmi: ho un

target importante/un miRNA importante, i programmi si possono usare per entrambi, cioè troverà i target

più probabili x un miRNA o troverà i miRNA che possono regolare un mRNA.

Sono in genere 4 i programmi che tutti usano cioè

! miRanda

! DIANA-MicroT

! TargetScan

! PicTar

Hanno alcune regole comuni: tutti vanno a considerare

1. l’annealing tra mRNA e miRNA

2. la stabilità termodinamica del complesso

Alcuni prendono in considerazione quanto la sequenza 3’UTR è conservata, alcuni se il miRNA ha struttura

secondaria ecc. Ognuno quindi ha piccole differenze nel considerare con quanta probabilità un miRNA andrà

a interagire con un mRNA.

Consultando i quattro diversi programmi e inserendo un miRNA o un mRNA, la lista che otteniamo è sempre

diversa e questo fa sì che la regola comune sia quella di usare più algoritmi, in genere 3, e considerare come

buoni quei miRNA o quei target che sono considerati in tutti e tre (si comparano e si intersecano i loro

risultati così da ottenere delle liste più ristrette di geni).

Perché non può essere completamente affidabile questa predizione?

1. Non sappiamo a tutt’oggi quanti miRNA ci sono e quanti sono veri: in realtà da un calcolo probabilistico,

considerando i 25 000 geni, si arriverebbe ad un numero di 678 miRNA. Consultando i miRNA depositati

sono molto di più

2. Nel 2010 è stato fatto uno studio di sequenzialmente di miRNA in diversi tessuti di topo si è visto che

solo 398 miRNA confermavano quelli che erano stati annotati, questo studio ha identificato 108 miRNA

che non erano stati mai considerati e non ha trovato 150 miRNA precedentemente annotati.

I database su cui si basano i programmi non viene aggiornato ogni secondo perciò alcuni programmi

lavorano su database di due/tre anni fa perciò non considerano tutti i miRNA che continuamente vengono

annotati. Non è poi detto che tutti questi miRNA siano reali o esistano o abbiamo una funzione reale. Questo

fa sì che ci sia un margine di incertezza. In più questi database sono stati costruiti con l’idea che il miRNA

avesse esclusivamente un ruolo repressivo sull’RNA marketing, quindi che andasse a legare la regione 3’UTR

e poi portasse o degradazione dell’mRNA o inibizione della produzione di proteina. Invece esistono miRNA

che hanno funzione attivatoria. Questo aspetto non è onsiderato nei database.

Quindi si parte consultando programmi che daranno dei candidati, dopodichè la prima cosa da fare è la

validazione del bersaglio predetto. Questa si può fare in due modi (metodi in vitro) che sono in realtà

complementari, quindi oggi si tende ad effettuarli entrambi:

1. Metodo più usato che si basa su un plasmide con un gene reporter (una luciferasi) a cui viene attaccato

la sequenza 3’UTR dell’mRNA target candidato. Si fa un altro plasmide con la sequenza mutata del 3’UTR

e un plasmide vuoto di controllo. Questi 3 plasmidi separatamente sono trasfettati in una cellula che si

suppone produca il miRNA. Per rendere più certa la situazione è possibile aggiungere al mezzo di coltura

dell’altro miRNA esogeno in modo da potenziare questo aspetto. Se la cellula produce miRNA questo

legherà la seq 3’UTR e determinerà una diminuita espressione del gene reporter quindi. Quindi se

abbiamo usato la luciferasi possiamo verificare la interazione miRNA-mRNA andando a misurare con

ELISA o luminometro la quantità di luciferasi presente nella cellula. Se c’è la interazione la luciferasi sarà

più bassa e questa sarà ulteriormente diminuita se abbiamo inserito un miRNA, mentre tornerà ai livelli

di controllo quando abbiamo la sequenza mutata.

2. Trasfezione delle cellule con o il miRNA mimetico o l’antagoMIR. Se è il miRNA mimetico potenzierà

l’azione del miRNA che abbiamo nella cellula. Se è l’antagoMIR lo andrà a spegnere, e poi andiamo a

verificare direttamente con un western blot se vogliamo guardare la proteina o con una real-time se

vogliamo guardare l’RNA, che il target sia effettivamente diminuito se gli abbiamo messo dentro il

mimetico o aumentato se li abbiamo messo l’antago.

Questi sono i due metodi normalmente usati: non dicono la stessa cosa in realtà perché mentre il primo ci

dice che c’è l’interazione diretta, il metodo della trasfezione non esclude che l’effetto sia mediato da un

terzo miRNA.

Usando il secondo metodo si va a guardare l’effetto dopo circa 24 ore per dare modo alle cellule di

bypassare i problemi che vengono dalla trasfezione stessa. In 24 ore non possiamo però affermare che

l’effetto sulla proteina sia proprio dovuto a quel miRNA perché può essere che si riattivi o moduli il

mediatore su questo processo.

L’inserimento del MIR mimetico o dell’antagoMIR può essere fatto o tramite una trasfezione transiente

dando il MIR mimetico e la lipofectamin quindi favorire i ribosomi che quindi favoriscono l’entrata del MIR

mimetico nella cellula oppure si può mettere il mimetico o l’antagoMIR nel plasmide per fare una trasfezione

stabile.

La funzione del microRNA dipende dai loro target. Quindi siccome nel cancro i geni si dividono in

oncogeni/oncooppressori, allo stesso modo vengono definiti i microRNA. Quindi avremo microRNA

oncosoppressori che vanno a inibire gli oncogeni e dei microRNA oncogeni che vanno a inibire gli

oncosoppressori.

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RB importante oncosoppressore. Se abbiamo miRNA che vanno ad inibire RB vengono chiamati oncoMIR

quindi sono oncogeni.

Viceversa se abbiamo un potente oncogene che opera con MYC, il microRNA che inibisce RAS o MYC è

classificato come miRNA oncosoppressore, quindi è l’opposto perché la funzione del miRNA dipende dalla

funzione del target.

Quindi quando analizziamo i diversi tumori ci saranno i miRNA sovraespressi e i miRNA che saranno

sottoespressi rispetto al tessuto normale che abbiamo come riferimento. Ci saranno anche miRNA che

risultano sottoespressi/sovraespressi in un tumore e non in un altro e dipende da quale oncogene

/oncosoppressore era importante nel determinare la specifica alterazione patologica.

La situazione è ancora più complicata perché ci sono miRNA che agiscono da oncosoppressore nel tumore

del polmone e da oncoMIR nel tumore del colon, quindi anche questo dipende dall