Lezioni: Appunti di Biologia molecolare

Biologia molecolare avanzata II

Katia Scotlandi-Grilli-Serra

Email: Katia.scotlandi@ior.it

Esame orale

Meccanismi molecolari alla base delle diverse patologie mono-o multi-geniche, con particolare riferimento al cancro

Tecniche diagnostiche

PCR, FISH

Analisi dei processi molecolari delle patologie

Mutazioni geniche:

• Aberrazioni cromosomiche

Mutazioni geniche

Per quanto riguarda le mutazioni a singolo gene queste derivano tutte da errori nella replicazione del DNA: questi sono errori spontanei che avvengono normalmente nella cellula e possono derivare da diversi processi:

• Reazione di deaminazione: uscita di un gruppo amminico da una molecola con conseguente fuoriuscita di una molecola di ammoniaca. La reazione necessita di una molecola di acqua ed è detta anche deaminazione ossidativa in quanto ossida il carbonio su cui era legato il gruppo amminico, sostituendovi un gruppo carbonilico. Questo tipo di reazione riguarda tre basi azotate: adenina che può essere trasformata in ipoxantina (A HX) oppure la citosina (C U e questo provoca una mutazione puntiforme che a livello del DNA può determinare l’instaurarsi di un codone di stop UAA da un codone CAA) e la 5-metilcitosina (5-metC T). Sono reazioni che possono avvenire sia a livello del DNA sia dell’RNA e nel caso in cui la trasformazione C U avvenga a livello dell’RNA può determinare un codone di stop e la comparsa della isoforma della proteina (non per forza una proteina non funzionale ma con funzionalità diversa). Se la reazione riguarda la 5-metilcitosina, siccome le basi metilate sono normalmente silenziate, se ho la deaminazione si provoca la trasformazione in timina e questo può provocare una riespressione della proteina.
• Reazione di depurinazione: porta la perdita di una base azotata purinica (A o G) per rottura del legame glicosidico. Lascia un sito apurinico/abasico e rimane solo lo scheletro dello zucchero/fosfato dell’acido nucleico e persa la base azotata. Può riguardare DNA/RNA. A differenza della reazione precedente, può avvenire sia spontaneamente sia essere indotta da esposizione ad agenti mutageni come le aflotossine B (contaminanti farina).
• Danni ossidativi: possono essere provocati dagli ossigeni reattivi.
• Errori compiuti dagli enzimi preposti alla replicazione del DNA: compiuti fondamentalmente dalle DNA polimerasi coinvolte nella replicazione del DNA. Ne esistono vari tipi, quelle che ci interessano sono la Polα, Polε e la Polδ. Sono enzimi che catalizzano la reazione che porta all’aggiunta del desossinucleotide al gruppo 3’OH del desossiribosio del nucleotide precedente. Lavorano sempre in direzione 5’3’ e hanno bisogno di uno stampo. Il reading strand viene sintetizzato in modo continuo, mentre il lagging strand è sintetizzato in modo frammentato attraverso i frammenti di Okazaki. Polε e Polδ sono dotate di attività esonucleasica quindi hanno capacità di recuperare e correggere errori. Attività esonucleasica sia in direzione 5’3’ sia 3’5’. Per quanto riguarda l’ultima si parla di attività esonucleasica di proofreading ed è un aspetto sfruttato dall’uomo nella formazione delle PCR ad alta fedeltà. Queste due Pol hanno elevata capacità di correggere i propri errori e il fatto che sono importanti nella correzione degli errori di replicazione e ci viene come informazione perché sono stati costruiti topi KO per queste Polδ muoiono in pochi mesi per insorgenza di tumore. Quindi importanza della DNA polimerasi e della attività esonucleasica nella prevenzione.
• Errori compiuti dagli enzimi preposti a riparo del DNA: esistono anche dei meccanismi di riparo del DNA. Sono coinvolti anche nei meccanismi di resistenza ai farmaci chemioterapici perché questi interagiscono col meccanismo di replicazione del DNA e vanno a bloccare la proliferazione aberrante delle cellule tumorali, quindi sono per definizione agenti mutageni quindi uno dei meccanismi che la cellula adotta per diventare resistente è attivare il meccanismo di riparo. Sono tre i meccanismi di riparo importanti diversi per il riconoscimento di diverse aberrazioni:
  • Base excision repair (BER): meccanismo che riguarda alterazioni a livello di una singola base che viene riconosciuta e rimossa da una DNA glicosilasi che è specifica a seconda delle diverse basi azotate. Si ha la formazione di un sito abasico che viene tagliato da una endonucleasi specifica e il gap che si crea viene colmato per azione di una DNA polimerasi Polβ quindi che interviene nel meccanismo di riparo del DNA e non ha altre funzioni. È un meccanismo di riparo usato dalla cellula per rispondere a danni provocati da diversi tipi di reazioni in particolare dall’ossigeno reattivo, da reazioni idrolitiche o da metilazioni o alterazioni portati da alcuni farmaci (agenti alchilanti).
  • Nucleotide excision repair (NER): meccanismo di riparo che riconosce addotti più ingombranti cioè alterazioni che comportano una distorsione della doppia elica del DNA. Sono tipicamente indotte dagli UV, dalle radiazioni e farmaci come il cisplatino. La regione distorta è riconosciuta da enzimi specifici, il pezzo viene tagliato da endonucleasi. Il frammento tagliato è più ampio rispetto al precedente quindi ci vuole una Pol che faccia una sintesi più estesa: Polδ e Polε.
  • Mismatch repair (MMR): viene attivato dalla cellula nel caso di appaiamento errato e sono coinvolti enzimi specializzati anche qui e si ha una rimozione di un frammento abbastanza lungo di DNA e quindi la DNA polimerasi coinvolta è la Polδ.

I sistemi di riparo sono vitali per la cellula: ogni giorno avviene un numero enorme di mutazioni che sarebbero incompatibili con la vita in assenza di questi meccanismi. Questo perché ogni volta che si crea un danno al DNA questo porta a due alterazioni fondamentali che sono alla base dello sviluppo dei tumori: una alterazione a carico dei meccanismi di controllo del ciclo cellulare (la cellula tende a perderli) e la attivazione dell’attività trascrizionale con espressione aberrante di diversi geni.

Quindi la cellula reagisce a questi effetti provocati dal danno al DNA attivando meccanismi di geni preposti a favorire il riparo: bloccano il ciclo cellulare per permettere di riparare il danno al DNA e se il danno è troppo elevato da essere riparato si attiva il processo di morte programmata e si va in apoptosi. Può attivarsi anche un terzo meccanismo che è il meccanismo di tolleranza al danno o sintesi del DNA translesionale: si attiva quando il danno provoca un blocco della forchetta di replicazione del DNA; il lagging strand continua a replicarsi mentre il reading strand è bloccato nella sua trascrizione in modo che questo sia stabile e sia oggetto di una rottura. Se avviene una rottura nel filamento di DNA questo porta inevitabilmente a una aberrazione grossolana quindi cromosomica e quindi la cellula cerca di riparare evitando un danno maggiore attraverso la sintesi del DNA translesionale che comporta il coinvolgimento della Polϒ che è normalmente associata a un antigene PCNA (proliferating nuclear antigen) che è associato al DNA. Quando c’è danno al DNA la PCNA viene ubiquitinata e degradata, a questo punto la Polϒ si trova già legata al DNA nei punti di replicazione e quindi può attivarsi e svolgere la sua funzione. Non ha riparazione esonucleasica ed è a bassa fedeltà perciò spesso questo processo di sintesi di DNA translesionale si traduce in una mutazione puntiforme (errato appaiamento a livello delle basi, soluzione migliore rispetto alla comparsa di una aberrazione cromosomica importante). Gli studi epidemiologici ci dicono che nei soggetti con mutazioni delle polimerasi coinvolte nella sintesi del DNA translesionale si ha elevata incidenza del tumore ereditario Xeroderma Pigmentoso.

Nel contesto del danno al DNA la cellula reagisce determinando:

• Da un lato il blocco del ciclo per poter riparare il danno efficacemente.
• Quando questo non è possibile la cellula è mandata in apoptosi.

La molecola che regola tutte e tre i meccanismi è p53.

P53

È una molecola di cui ancora oggi si conosce pochissimo. Quarant’anni di studio della molecola in cui i ricercatori hanno focalizzato l’attenzione su cose diverse. All’inizio si sono preoccupati di clonare la molecola e conoscerne la sequenza, e di attribuirle una funzione. Poi si è capito che funziona anche come fattore trascrizionale e da qui è stata vista come una molecola coinvolta nell’arresto del ciclo cellulare, nell’apoptosi e nella senescenza. La terza decade l’ha vista coinvolta in ruoli di alterazioni metaboliche della cellula e produzione di citochine quindi come regolatore del rapporto tra cellula-cellule circostanti e cellula-microambiente. L’ultima decade fino a oggi ha sfruttato le conoscenze per elaborare farmaci target-specifici.

P53 un oncogene?

Negli anni ‘90 l’attenzione era rivolta al fatto che ci fossero tumori indotti da virus a DNA e si cercava di caratterizzare tutte le molecole associate al virus stesso. Come si faceva questo studio? Usando anticorpi diretti contro gli antigeni virali e immunoprecipitando, per vedere quindi cosa era fisicamente associato al virus. È da qui che viene identificata p53 che ha un peso molecolare di 44 kDa e che è stata immunoprecipitata in cellule tumorali. La prima evidenza quindi era che questa molecola era presente in tutte le cellule tumorali e in quantità molto più elevata rispetto alle cellule normali: questo ha fatto pensare che p53 fosse un oncogene. Per avere la prova si è cercato di clonare la molecola in vari laboratori: in tanti hanno visto che mettendo questo gene in una cellula normale questa si trasforma quindi questo ha fatto pensare che p53 fosse un oncogene. Pochi lavori invece indicavano che p53 non era in grado di trasformare.

In realtà questa idea opposta è stata accettata quando hanno visto che un cDNA di p53 diverso da quelli usati fino a quel momento, trasfettato in una cellula leucemica senza p53, non era in grado di trasformarla. Andando a fare il confronto molecolare con questi diversi cDNA si sono resi conto che i cDNA clonati a partire dalle cellule tumorali negli anni precedenti erano in realtà cDNA di una p53 mutata, e non di p53 wt. Da qui è partita l’idea corretta che identifica p53 come la molecola rappresentativa della classe di oncosoppressori.

Come si definisce dal punto di vista sperimentale un oncosoppressore?

• Studi epidemiologici: in uomini con mutazioni di quel gene nelle cellule germinali si è visto che provoca la sindrome di Li Fraumeni associata a una maggiore incidenza di tumori.
• Si parte da topi KO dove p53 è deleta e trovo elevatissima incidenza ai tumori.

Reinterpretazione di come agiscono i virus a DNA

Tutto era partito dai virus: si doveva capire anche perché negli studi di immunoprecipitazione comunque la molecola era sempre co-immunoprecipitata con l’antigene. Questo succedeva perché ci sono due step successivi:

• Nel primo step ho il virus che altera i meccanismi di controllo della proliferazione cellulare. In particolare il virus SV40 inibisce la proteina RB, la fosforila e quindi determina il distacco del fattore trascrizionale E2F che permette l’attivazione della trascrizione e permette l’entrata della cellula in fase S (serve al virus per ottenere enzimi e supporto per la sua replicazione).
• P53 sente che la cellula affronta una fase S del ciclo cellulare anomala e quindi cerca di mandarla in apoptosi. Il virus reagisce legando p53 e bloccandola, per cui p53 è immunoprecipitata assieme all’antigene-T.

Questo è il meccanismo con cui agiscono i due Papillomavirus HPV16 e 18 per cui oggi c’è il vaccino perché sono responsabili con elevata incidenza di carcinomi all’utero.

I meccanismi di riparo non funzionano sempre, e possono fallire in alcuni casi quindi si ha la comparsa di una mutazione che può essere:

• Mutazione di transizione: reazione nell’ambito della stessa base azotata (purina vs purina; pirimidina vs pirimidina).
• Mutazione di trasversione: una base azotata è sostituita con una qualunque delle altre basi azotate.

Alterazione della sequenza di nucleotidi: mutazioni vs SNPs

Le mutazioni che riguardano la singola base azotata sono mutazioni puntiformi e quindi dal punto di vista molecolare non c’è differenza tra mutazione puntiforme e uno SNP (single-nucleotide polymorphism) che è la forma più comune di polimorfismo genetico. Dal punto di vista molecolare sono determinate dallo stesso tipo di evento che è la mutazione di senso in cui la mutazione dà luogo a un codone che codifica per un amminoacido diverso che può avere caratteristiche simili a quelle dell’amminoacido originale, oppure l’amminoacido può risiedere in una porzione della proteina che è non significativa per la funzionalità della proteina stessa, quindi risulta essere una mutazione neutra quindi si ha un risultato finale che non è la mutazione associata all’evento patologico, ma è invece uno SNP associato alla variabilità genetica. L’evento mutazionale quindi non sempre dà luogo a una patologia ma a una diversa sensibilità rispetto all’ambiente esterno.

Si parla di mutazione quando è molto rara (<1% degli individui) ed è sempre associata ad una malattia. Dal punto di vista molecolare le mutazioni si distinguono in mutazioni silenti, neutrali, di senso e nonsenso.

• Mutazione silente: la mutazione c’è ma nessuno se ne accorge perché per la degenerazione del codice genetico la tripletta forma lo stesso amminoacido, quindi non c’è nessuna variazione dal punto di vista della proteina.
• Mutazione di senso: si ha la sostituzione di un amminoacido con un altro ma comunque si ha la formazione della proteina in cui l’impatto della mutazione sarà diverso a seconda di che amminoacido viene sostituito e della sua posizione nella proteina.
• Mutazione non senso: si ha sempre la formazione di una proteina alterata perché si viene a creare un codone di stop e quindi si ha la formazione sempre di una proteina degenerata.
• Mutazione frameshift: mutazione per scorrimento del modulo di lettura. Deriva dalla inserzione o dalla delezione di una coppia di basi azotate e quindi da quel momento tutte le basi azotate sono alterate e quindi la molecola è modificata.
• Mutazione dei siti di splicing: il sito di splicing viene riconosciuto dagli enzimi preposti ed è determinato da sequenze nucleotidiche ben precise. Se queste vengono alterate possiamo perdere il riconoscimento del sito di splicing e si avrà sempre formazione di una RNA alterato che sarà o privo di un esone o con un introne. La mutazione può creare anche un sito di splicing dentro un introne quindi ho la formazione nella maggior parte dei casi di molecole di RNA con un frammento intronico. Quindi la mutazione a carico dei siti di splicing porta praticamente sempre ad una molecola di RNA maturo molto modificata.

Come sono rappresentate le mutazioni: si dà l’informazione sia dell’amminoacido che viene sostituito sia della posizione in cui questo amminoacido è localizzato. Si può avere sia informazioni della base azotata o una scrittura in cui viene indicato l’amminoacido, per mutazioni di senso e nonsenso. In mutazioni per scorrimento si dà sempre indicazione delle basi azotate delete/inserite e in che posizione. Nelle mutazioni di splicing si ha indicazione sia del tipo di base azotata sostituita sia della posizione.

Reversione e soppressione

Può succedere che le mutazioni avvengano ma non si abbia nessuna manifestazione fenotipica perché esistono i fenomeni di reversione e soppressione della mutazione.

• Reversione: mutazione che avviene nello stesso codone che era stato mutato e che quindi viene riportato alla sua situazione originale e si parla di retro-mutazione, oppure si può avere una mutazione che modifica di nuovo la tripletta ma che la porta a una tripletta che dà lo stesso amminoacido della struttura originale e si parla di reversione di sito ma in entrambi i casi è una proteina.
• Soppressione: può essere interna o esterna. Se è interna avviene dentro lo stesso codone e riguarda in genere le mutazioni di slittamento (inserimento/delezione di una coppia basi che viene quindi ripristinata); se è esterna riguarda l’anticodone dell’RNA transfert e riporta all’inserimento dell’amminoacido.

Quindi non sempre una mutazione si manifesta: oggi si sa che tutta parte del DNA che non veniva considerata che era il “DNA spazzatura” ha acquistato una importanza nuova (microRNA, sequenze regolatorie dei geni ecc), quindi non possiamo dire che una mutazione che non avviene nei geni strutturali non ha importanza perché se le mutazioni avvengono nelle regioni regolatorie sono importanti nell’andare ad alterare i legami tra miRNA e gene e quindi avere un impatto notevole. È vero però che in quest’ambito gli studi sono ancora limitati.

Le mutazioni si differenziano in

• Mutazioni somatiche: riguardano cellule somatiche e sono quelle che riguardano patologie come il cancro. Sono mutazioni che vengono trasferite alle cellule figlie.
• Mutazioni della linea germinale: riguardano i gameti e saranno trasferite alla generazione successiva e sono coinvolte nelle malattie genetiche ereditarie (tumori ereditari).

L’efficacia della mutazione, sia positiva che negativa, dipende dal tipo di allele mutato creato. Questo potrà essere dominante o recessivo.

La maggior parte delle mutazioni ha effetto recessivo e solo negli individui omozigoti recessivi. Gli eterozigoti sono portatori. Esempio di malattie genetiche autosomiche recessive sono la fibrosi cistica, l’anemia a cellule falciformi, le β-talassemie e la fenilchetonuria. I geni mutanti per di...