Appunti di Biologia molecolare applicata

Biologia molecolare applicata

Esame orale

Discussione di un lavoro scientifico e esame sul programma.

Tecniche per analizzare l'espressione dei singoli geni

In questo contesto si ha l'analisi con Northern Blot, il cui punto di partenza è analisi su RNA totale, quindi, solo i trascritti (non sono rRNA), all'interno di essi abbiamo una sottopopolazione: gli mRNA che danno origine alle proteine. L'analisi di Northern permette di dire se c'è o meno un trascritto e di determinarne il peso molecolare. Può essere anche un'analisi relativa: permette di dire che il trascritto c'è di più rispetto ad altri campioni o all'interno dello stesso campione, in quanto i trascritti variano a seconda del tessuto, delle condizioni, del trattamento... Abbiamo dei trascritti poco rappresentati, molto rari e altri abbondanti.

Poi, si ha la retrotrascrizione abbinata alla PCR, un'amplificazione (RT-PCR). Anche questa può essere c'è o non c'è un trascritto, offre dei vantaggi rispetto al Northern, quali di sensibilità, amplificando il segnale si aumenta la sensibilità, non la specificità, ma non prevede di stabilire il peso molecolare. Anche per la RT-PCR esiste quella relativa, che permette di dire che ci sono delle variazioni all'interno del trascritto.

C'è anche il concetto di PCR quantitativa, che non è quella convenzionale, la strutturale è analoga, ma si procede con un'amplificazione quantitativa, in modo tale che l'amplicone ossia quello che viene amplificato possa fornirci precise informazioni sul templato iniziale, questo può avvenire solamente se si seguono alcuni principi. Il concetto di PCR quantitativa è lo stesso che si ritrova nell'RT-PCR competitiva, che significa retrotrascrizione e PCR in presenza di un competitore, questa mi permette di avere misure assolute di quanto ce n'è. Lo stesso discorso di PCR quantitativa è alla base della real time PCR. RT-PCR ≠ real time PCR, ma retrotrascrizione abbinata alla PCR = RT-PCR, invece, real time PCR è una PCR in real time (non c'è un'abbreviazione). La real time PCR può essere relativa o assoluta, in questa si può vedere la cinetica di amplificazione, che non si vede nella PCR normale.

Abbiamo, poi, l'analisi trascrizionali quantitative relative di più trascritti simultaneamente. Un esempio sono i micro e i macro-array, in base alle dimensioni dei supporti. Ci sono quelli in spot dispenser e in chip.

Saggi di ibridazione standard e saggi inversi

Sia Northern che Southern che Array sono basati su un'ibridazione con una sonda e si hanno dei target o un target. Quella standard è Northern e Southern, inoltre, si ha quella inversa ossia quella legata agli array. Nella standard i target non sono marcati sul supporto (dopo aver estratto RNA o DNA, avete trasferito su un chip), ma la sonda, la probe, è marcata e sta in soluzione. Negli array, al contrario, la sonda non è marcata ed è legata al supporto, i target sono marcati e sono in soluzione.

Northern blot

RNA viene estratto da determinate cellule di determinati tessuti. Ci sono delle metodiche che:

• Sfruttano le caratteristiche chimiche e fisiche che differenziano le macromolecole: RNA, DNA e proteine, le quali hanno diversi comportamenti in presenza di soda o di acidi. In alcuni casi è prevista la purificazione sul RNA totale dell'mRNA, sfruttando la coda di poliA, lunga circa 200-250A. Ci sono metodiche che sfruttano l'affinità, che messe su colonnine, resine. Un esempio di separazione è la cromatografia su matrici di oligo-dt, ci sono gli oligo-dt, facendo passare l'RNA totale, in opportune condizioni, rimarranno attaccati soltanto gli RNA con la coda, il resto sarà eluito, successivamente, variando la forza ionica si recuperano gli mRNA.
• Sia l'RNA totale che l'mRNA è separato su un gel di agarosio, denaturante, in quanto si devono separare solo in funzione del peso molecolare, non sulla loro conformazione, che è l'altro elemento che influenza la migrazione. NON ESISTE GELELETTROFORETICO, ma gel di agarosio. Si usa il gel con la formaldeide e la formammide. Prima di fare ciò, si deve fare il dosaggio allo spettrofotometro, leggendo a 260 nm, nell'UV (ripassare spettri, UV il primo colore nel visibile è il violetto, infrarossi…) si sfrutta l'assorbanza delle basi azotate, effetto ipercromico. Le letture possono essere svolte anche a 240 o a 280 nm, dipende dalla qualità del materiale estratto. A 280 nm si leggono le proteine, si sfruttano gli anelli aromatici di alcuni amminoacidi. Separazione su gel di agarosio in condizioni denaturanti e migrazione in base al peso molecolare, con una precisa relazione, in funzione del peso: inversamente al logaritmo del peso molecolare (a pH 8, per farla migrare al polo positivo, mantenendo una certa carica).
• Visualizzazione di ciò che è stato caricato, alla fine della corsa, con intercalante oppure colorazione del gel con intercalante, si usano etidio, bromuro, che sono specifici per l'acido nucleico. Hanno, inoltre, un'altra proprietà: formano dei legami stechiometrici, in funzione della quantità. Questo intercalante non si userà per fare Real time, anche se è stechiometrico. Quando si carica un RNA totale, si ha anche la bontà della preparazione, in quanto sul gel si vedono le bande del RNA ribosomiale, sono presenti ad alti livelli, permettono di dare delle bande discrete. Si intercalano a livello stechiometrico ossia le subunità ribosomiali nella cellula sono 1:1, quindi, ci sono le stesse quantità, di conseguenza, devono dare lo stesso segnale, però, essendo stechiometrico oltre alla quantità, anche lunghezza, tanto più lungo tanto più si intercala. Le bande A parità di quantità, le bande più alte sono sempre le più intense di quelle basse. Questo ci dice la bontà, c'è la stessa quantità, ma essendo più corte devono essere meno intense, se ci sono le cose bilanciate c'è qualcosa che non va. Nel momento in cui si purifica del RNA messaggero non si vede più nulla, perché i trascritti messaggeri sono presenti in quantità diversa, dimensione diversa, ma non in quantità tale da dare delle bande definite, discrete, in funzione della sensibilità di quello che noi stiamo usano per vedere ossia l'etidio. C'è qualcosa di evanescente sul fondo. Se ci sono delle bande, significa che non abbiamo purificato e si valuta anche in questo modo la bontà. Alla fine, il gel viene trasferito su una nitrocellulosa o di nylon, purché sia carico positivamente. Il trasferimento, in generale, avviene in questo modo: in una vaschetta si mette il tampone, un supporto su cui si mette della carta, si fa un ponte con la carta, poi, si appoggia il gel e sul gel si mette la nitrocellulosa, poi, si mettono dei fogli di carta asciutta. Per capillarità l'acqua sale, portando con sé l'acido nucleico che rimane sulla nitrocellulosa, ma non è fissato, in quanto i legami non sono ancora covalenti. Il filtro viene fissato agli UV, si cross linka, si ha la formazione dei legami covalenti tra acidi nucleici e il supporto. Non ci sono trattamenti denaturanti, a differenza della Southern, in quanto l'RNA è già a single strand.

Si ibrida: facendo una Northern normale o relativa.

Sonde

Lo stesso discorso, fatto precedente, vale sia per la Northern (RNA) e Southern relativa (DNA). A questo punto, si necessita di una sonda, che verrà marcata e messa in soluzione. N sonde = n possibilità di fare sonde, non sono intercambiabili, il materiale di partenza dipende da quello che stiamo facendo, si possono fare sonde a RNA e a DNA o sonde con oligo sintetizzati chimicamente, tutto ciò è in funzione delle informazioni di partenza che si hanno. La cosa importante è la sensibilità della sonda, soprattutto per la Northern, si hanno bisogno di sonde altamente sensibili, messaggeri molto rari = sonde molto sensibili. Il discorso è soprattutto sensibilità, che dipende da quello che stiamo cercando. Le sonde possono essere marcate in modo indiretto o con radioattività. In linea di massima, non sempre, l'utilizzo di traccianti radioattivi rende, a parità di tipologia, diverse sonde con diversa sensibilità, il sistema più sensibile. Si marca e si usa una sonda di sintesi, sintetizziamo del DNA, la sonda per eccellenza è la random primer. Se stiamo sintetizzando significa che si ha una polimerasi, che deve incorporare dei nucleotidi, in questo caso sono marcati in modo radioattivo, la radioattività deve rimanere su quello sintetizzato. Nel nostro caso, la polimerasi incorpora e forma un legame fosfodiesterico, avendo la formazione di due fosfati. La marcatura è in α, ci sono tre fosfati α32β e γ. Non si sta modificando il nucleotide, semplicemente si ha il fosfato radioattivo, si usa il P. In altre marcature, si marca il γ che è quello che viene traferito sul substrato.

Le DNA polimerasi sintetizzano in un verso di polimerizzazione 5’→3’. Ha bisogno di un innesco che è rappresentato dal 3 OH, in direzione 5’→3’ copiano quello che c’è sotto sul substrato, single strand; questo vale per tutte le polimerasi, tranne per la terminal transferasi, la quale ha tutto tranne che non copia, polimerizza 5’→3’, ha bisogno di un innesco 3 OH, che solitamente è dato dal primer, ma aggiunge quello che noi abbiamo in soluzione. Se mettiamo tutti i nucleotidi C, in soluzione, costruisce alle estremità 3 OH code poliC, la cui lunghezza è in funzione di quanti nucleotidi presenti in soluzione e del tempo in cui si lascia agire la terminal transferasi. Non abbiamo ancora modificato, ad oggi, le polimerasi in modo che vadano nell’altro senso.

Le polimerasi hanno associate anche delle altre attività, che sono delle attività esonucleasiche. La nucleasi è la reazione uguale e contraria della polimerasi, ossia idrolizzano i legami fosfodiesterici. Ci sono delle DNA polimerasi e RNA polimerasi, ossia hanno una specificità di substrato di sintesi, allo stesso modo ci sono delle nucleasi in funzione della specificità di substrato: DNA nucleasi (DNAasi specifica per il DNA) e RNA nucleasi (RNAasi specifica per il RNA), RNAasi H, H = ibrido, RNAasi specifica per un ibrido, riconosce soltanto quando c’è un ibrido e codifica soltanto per l’RNA che sta nell’ibrido. Le nucleasi possono essere eso, idrolizzano a partire dalle estremità, e endo, idrolizzano all’interno.

Le polimerasi hanno in diversi gradi attività esonucleasiche, ossia tolgono un nucleotide per volta a partire dalle estremità, in direzione 5’→3’, nello stesso verso in cui stanno polimerizzando e questa è l’attività tipica della DNA polimerasi I di E. coli, che si chiama attività di Nick translation, c’è un nick davanti e lo rimuovo poco per volta, togliendo l’elica che si trovano davanti, fanno replacement. Questa attività è stata sfruttata per ideare la prima sonda marcata mediante nick translation, che, però, attualmente, non è usata, in quanto ha una sensibilità inferiore al random primer.

L’altra attività è Prouf reading è un’attività eso, va dietro, 3’→5’, la correzione delle bozze, per cui la polimerasi si accorge se ha sbagliato a introdurre un nucleotide, idrolizza e lo rimuove, poi prosegue. Anche i correttori di bozze si differenziano per il grado di capacità di correggere. La scelta è in funzione di quello che si deve fare. Per random primer, si usa una polimerasi che manca totalmente dell’attività eso 5’→3’, ossia la nick translation, la polimerasi è il frammento di Klenow, ottenuta dalla polimerasi di coli, per una digestione enzimatica, eliminando l’altra attività, in quanto la polimerasi ha dei domini di attività. Non fa displace, se si trova qualcosa davanti si ferma. La processività è un’altra caratteristica delle polimerasi, quanto si staccano nell’unità di tempo dal templato e la loro efficienza ossia quanto a lungo sono in grado di polimerasi; la Klenow è poco processiva, sintetizza corti frammenti.

Il punto di partenza per la random è il DNA a double strand, che può essere amplificato per PCR, ma di cui non si conosce la sequenza, nella PCR si conoscono solo le estremità. Si hanno, quindi, i nucleotidi marcati in α, abbiamo bisogno dei primer, sono lunghi 6, sono una miscela di 6 esanucleotidi, perché ci sono tutte le possibili combinazioni a quattro basi →4 significa che se aggiungo questa miscela, non c’è un appaiamento casuale (il termine random è fuorviante), ma è specifico perché si hanno tutte le possibili combinazioni delle quattro basi, esiste la probabilità x che fra tutte le combinazioni che qualche primer si annila in modo specifico ai due strand che sono stati denaturati. Le probabilità dipendono dalla lunghezza e dalle combinazioni. La polimerasi polimerizza e incorpora il radioattivo, a partire dai primer, entrambi. Non avendo attività eso 5’→3’, quando arriva davanti al primer si ferma. Non si fa nessuna ligation, abbiamo una miscela di frammenti radioattivi rappresentativi del templato. Nelle sonde radioattive si misura l’attività specifica, che è data dal rapporto radioattivo/non radioattivo rispetto al templato. Si misura, poi, la radioattività tramite dei strumenti, quale l’oscillatore e si fa il rapporto tra quello marcato e il templato e si ottiene un certo valore di attività specifica, che determina la sensibilità. Tramite l’emissione della radiazione, si ottiene un segnale che deve essere rilevato. Tanto più radioattivo si ha tanto più aumenta la sensibilità. È elevata, se la si confronta con marcature, ad esempio, con cui marco, avendo lo stesso DNA di partenza, la stessa quantità, lo stesso double strand, posso marcare le estremità e ottengo una sonda marcata. Se si ha una sonda con una sola marcatura e una che ha incorporato tutto lungo la sintesi, è ovvio che la quantità di radioattivo rispetto al templato a parità è maggiore, hanno, perciò, un’attività specifica superiore. Non si liga, non si usa la ligasi, anche se è in grado di formare legami fosfodiesterici e otterrei una sonda marcata con lo stesso radioattivo. Non si usa la ligasi, si aumenta la probabilità che si leghino. Si ha un substrato fisso e c’è una cosa in soluzione, la sonda deve incontrare il substrato, se ho una molecola sola con un solo target, se questa è divisa in 50 pezzetti la probabilità di reazione aumenta. Indirettamente aumenta la fortuna di avere il segnale che è ciò che ci interessa. Si usa questa miscela, che deve essere a single strand, denaturato, su un substrato, che nel caso della Northern è a single strand.

L’altra sonda ad alta attività specifica è sempre una sonda di sintesi, ma si sintetizza in vitro RNA. Questa marcatura serve perché, quando si marca i target nel gene chip, si usa questa metodica, per marcare il target. Se si deve fare sintesi di RNA, si ha bisogno di un templato, di una RNA polimerasi, ribonucleotidi marcati in α, il magnesio, ma le RNA polimerasi hanno anche bisogno del promotore. La scelta tra tutte le RNA polimerasi esistenti è legata al fatto di essere più efficiente e processive, non sono quelle di coli, ma quelle migliori sono quelle dei fagi. Si usano SP6, T3 o T7. È fondamentale avere il promotore che è riconosciuto dall’RNA polimerasi corrispondente. Si deve costruire un sistema che permette di clonare il DNA che devo trascrivere da un stram a un promotore corrispondente. Ci sono una serie di plasmidi di coli che vengono amplificati, in cui ai lati del sito di inserzione multipla dove si clonano i frammenti di interessi, c’è la sequenza relativa al promotore. Essendo di coli, hanno anche le caratteristiche proprie di coli ossia la resistenza all’ampicillina e l’α complementazione. il frammento di interesse viene clonato. A seconda del promotore che si usa, si può fare l’RNA di uno strand o dell’altro. Ho un inizio di trascrizione determinato dal promotore, ci sono dei terminatori di trascrizioni, che qui non ci sono, non si ha un terminatore, ma abbiamo clonato dei pezzetti di DNA, per evitare che trascrivi contro l’ampicillina…, allora, si è ideato di tagliare esattamente dalla parte opposta, non è necessario fornire il corretto terminatore di trascrizione, la polimerasi si trova nel vuoto, fisicamente va giù, e termina la sua trascrizione. Si può clonare sia un DNA che un cDNA, si deve definire quale promotore e quale promotore usare, in funzione di quello tagliare con un enzima di restrizione dalla parte opposta di quello clonato (si deve fare una mappa di restrizione), si ottiene una cosa lineare. Si aggiunge magnesio e si ottiene RNA a single strand. Se 100 molecole di templato, non ottengo 100 molecole di DNA: c’è un processo di amplificazione, 1 a 100. Dal punto di vista di attività specifica, se si misura il radioattivo alla fine di questa trascrizione, rispetto al DNA che si aveva nella random, l’attività specifica è molto più elevata. Si chiama RNA se ho clonato DNA, se ho clonato un cDNA avrò un cRNA. Nel gene chip, nelle marcature, si avrà il cDNA. In questo sistema, a differenza del random primer, dove nella mia sonda non posso eliminare il DNA marcato da quello non marcato, li uso in miscela, non hanno differenze tali da poter separarli, in questo caso, invece, dopo aver fatto...