Appunti di Biologia molecolare applicata

KNOCK IN E KNOCK OUT

Con cellule trasformante però ho anche la possibilità di ottenere topi in cui è stato

inattivato/modificato in modo selettivo un gene, quindi è stato inserito in posizione specifica. Questo

processo facile in lievito, integrazione sito specifica avviene con alta frequenza, perché lievito ha

genoma piccolo e processi di ricombinazione efficienti. In mammiferi e piante frequenza di

ricombinazione omologa che consente modifica mirata di un locus è bassa, devo screenare migliaia di

cloni per ottenerne uno che va bene. Si pensò a sistema che consentisse di selezionare

positivamente gli eventi di ricombinazione omologa, se ho modo per cui trasfetto cellule

trasformate e posso selezionare positivamente cloni in cui è avvenuta ricombinazione omologa,

posso avere modelli. Si utilizza un doppio marcatore, voglio modificare un gene x di topo, gene di topi

dimensioni simili a quelle umane quindi non posso fare delezione dell’intero gene, per

modificarlo/inattivarlo devo eliminare solo un paio di esoni, se esone viene scelto bene la proteina

che si fa è troncata.

Come inserire al posto di uno o due esoni una sequenza diversa come il gene neo? Occorre avere un

costrutto con regioni omologhe molto grandi, perché così maggiore sarà la probabilità di avere

integrazione omologa, se ho ricombinazione omologa cromosoma si modifica: al posto di un esone, ci

sarà un gene neo con suo promotore e terminatore. Questo evento di ricombinazione omologa, però,

è molto raro. Si pensò così di aggiungere un altro marcatore: gene della timidilato chinasi, perché

questo gene può essere selezionato. Se ho integrazione omologa avverrà una ricombinazione e nel

cromosoma avrò solo il gene neo e il gene per la TK non c’è, se, invece, integrazione è casuale in

qualsiasi altra regione è probabile che si integri tutto il costrutto, quindi, avranno sia gene neo che TK.

Ora come seleziono? Posso selezionarne uno negativamente, perché quando viene inserito TK questo

è in grado di fosforilare Ganciclovir, se fosforilato, si trasforma in nt che viene inserito in DNA e blocca

la polimerasi, questo blocco avviene solo se c’è quel gene. Dopo transfezione, le cellule vengono

piastrate in un terreno con g418, seleziono tutti i cloni positivi (tutti e due i tipi), poi le cellule vengono

trattate con Ganciclovir, tutte quelle che hanno avuto integrazione casuale muoiono e rimangono vive

solo quelle che hanno avuto un’integrazione sito specifica. Dopo la trasfezione ho isolato 13 milioni

di cellule che hanno dato origine a 130000 colonie resistenti a g418, ma solo 81 di queste sono

resistenti anche a Ganciclovir. In realtà, la maggior parte di queste 81 controllando per Southern non

sono buone, solo 4 integrazione omologa, gli altri erano falsi positivi.

Questa tecnica non mi garantisce di isolare solo cloni positivi, ma tra quelli isolati è facile trovare clone

in cui è avvenuta ricombinazione omologa. Come si vede che cosa è successo? La tecnica migliore è

ibridazione. Dopo trattamento per cloni positivi resistenti a g418 e a Ganciclovir, si estrae DNA dai

cloni e si digerisce con enzimi di restrizione scelti in modo da sapere la dimensione dei frammenti,

dopo integrazione al posto di esone 8 dovrei avere gene neo, questa integrazione ha modificato la

struttura e la distanza tra i siti di restrizione, uso come probe regione a cavallo tra esone 7 e 8, in

cellule wt trovo banda 5.4, gene neo non contiene sito per bgl2 e ottengo banda da 6.4, ma contiene

gene eco e frammento più piccolo 8.3 (quelli a 6.4 e 8.3 non presenti in wt). L’integrazione è avvenuta

in eterozigosi perché è già raro che è avvenuto su uno, quindi, vedrò anche banda dell’altro

cromosoma wt. Southern è più informativa. Ottengo modelli animali in cui ho modificato locus

specifico fino ad ottenere topi knockout in cui un gene è stato inattivato, come? Cellule S di topo aguti

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trasfettate con liposomi, si fa selezione con g418 e Ganciclovir, si isolano cellule resistenti ai due

inibitori, cloni analizzati per Southern e si isolano cloni in cui è avvenuto evento positivo, cellule s

positive che presentano modificazione in eterozigosi vengono inserite in blastocisti di topi neri,

blastocisti trasferita in topo pseudogravida albina, se tutto va bene i topi chimerici neri e marroni.

Cellule s così hanno contribuito a formare tessuti animali. Bisogna fare test incrociando topi wt e topi

chimerici per vedere se la delezione è avvenuta a livello della linea germinale. Essendo aguti

dominante se li incrocio con neri si ottengono marroni non sono chimere, marrone si caratterizza e si

incrocia con altri topi. Linea transgenica è mantenuta in eterozigosi in modo che se quel gene è

importante per la vita del topo, comunque il wt sull’altro cromosoma rimane; se il gene non è

essenziale per lo sviluppo può essere anche knock out su entrambi i cromosomi e ottenere comunque

un topo vitale, risultato di doppio knockout a rischio se non conosco bene la funzione gene. Con

tecniche simili non necessariamente ottengo knock out, ma potrei fare anche modificazioni, in questo

caso il gene neo non a cavallo dell’esone, ma in un introne in modo che non modifica la sequenza, è

knock-in; oppure potrei inserire al posto di gene neo un gene reporter vedo quando gene è espresso

in eterozigosi.

Esperimento in cui è usato knockout per capire la funzionalità di un oncogene. Abl è un oncogene

associato al retrovirus che causa leucemia nel topo. L’oncogene codifica per la tirosina chinasi

nucleare. Questa proteina viene espressa in tutti i tessuti, ma in modo particolare in timo e milza,

quindi, è coinvolta nella proliferazione cellulare per la produzione di anticorpi. Esiste, però, una forma

specifica espressa solo nel testicolo che si trova nelle cellule germinali, non si capisce a che cosa serve

questa variante. Si è cercato di capire la funzione di Abl nel topo, facendo modello knockout. Il vettore

usato è un plasmide con gene neo, inserisco dentro le regioni che devono fiancheggiare l’inserzione,

sono state isolate regioni di DNA genomiche in modo da fiancheggiare l’inserzione. L’integrazione è

caratterizzata digerendo DNA con enzimi di restrizione, ottenuti topi knockout. In eterozigosi stanno

bene perché gli basta un gene funzionante. Incrociando eterozigoti ottengo omozigoti, nascono, ma

hanno problema di sviluppo nel sistema immunitario, vanno incontro a delle patologie, la

sopravvivenza dopo la nascita è scarsa, ma qualcuno in condizioni di sterilità sopravvive fino all’età

riproduttiva, i suoi gameti sono normali nonostante il difetto in Abl. Questo succede perché spesso

c’è ridondanza perché magari c’è un’altra chinasi simile.

I mammiferi contengono 3 geni ras, sono H N K, originano 3 proteine simili, cambia solo una piccola

regione carbossi-terminale. Le tre forme nell’adulto sono espresse in modo diverse, H espressa

nell’embrione, in adulto solo in cervello e cuore, in altri tessuti molto espressa K, N in sistema nervoso.

Si è cercato di usare tecnica del knockout per capire a che cosa servono queste 3 diverse isoforme.

Inattivando uno qualunque di questi geni, il topo sta bene. Se elimino H ras le altre varianti cambiano

funzione. Piccolo difetto associato ad H ras c’è, difetto di apprendimento, correlato al fatto che H

espresso in neuroni. Inattivando gli altri non succede niente. Se li inattivo tutti insieme, muore alle

prime divisioni cellulari perché ras è importante. Il modello knockout è utile, ma spesso si hanno

risultati ambigui.

È possibile ovviare al fatto che gene è essenziale e se non c’è organismo non si sviluppo? Si può fare

cercando di far avvenire delezione non in tutti gli organi, ma solo in alcuni, un knockout differenziale

o nel tempo o nello spazio. Sono KO condizionali, inventato nel 1995, utilizzano un sistema che

richiede una specifica ricombinasi Cre e specifiche sequenze Lox. Queste sequenze, le ricombinasi,

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sono prodotto di ricombinazioni naturali ad opera di un fago P1 infettante E. coli. Si è visto che la

ricombinasi se espressa in mammifero funziona bene, e, se ci sono siti lox, ci sono eventi di

ricombinazione. Il sito lox è un sito piccolo, sono due regioni palindromiche di 16 bp separate da 8 nt,

la ricombinasi taglia tra le due regioni. Dopo che la ricombinasi ha tagliato se i siti lox sono messi in

tandem e orientati nella stessa direzione la ricombinasi elimina la porzione centrale come molecola

circolare e viene persa, è delezione. Se, invece, i siti lox sono orientati in modo opposto la ricombinasi

ha un effetto diverso, inverte la sequenza, ma questa rimane, non viene persa. Di solito si mettono

due siti lox ai lati della sequenza che voglio eliminare, faccio esprimere la ricombinasi ed elimino la

sequenza in mezzo. Faccio una linea trangenica di topi che esprimono la proteina cre fatta con

iniezione (espressione dipende dal promotore, come tet-o, funziona solo con tetraciclina; oppure gli

metto davanti una regione enhancer che mi permette l’espressione tessuto specifica, quindi, solo

quando c’è tetraciclina e solo in un certo tessuto). Per fare questo, devo anche preparare del

substrato, inserire in un’altra linea di topi la sequenza target da eliminare fiancheggiata dai siti lox e

di solito si mette a valle anche un gene che codifica per GFP senza promotore, normalmente il gene

per GFP non viene espresso, quando viene eliminata la porzione si elimina stop e ora viene espressa,

serve per controllare, se la ricombinazione avviene, c’è l’emissione di fluorescenza. In questo caso,

ottengo un topo normale in cui ho una regione modificata in cui ho solo inserito lox, si ha fenotipo

normale. Per fare knock out condizionale devo incrociare i due ceppi ossia topo che esprime cre con

topo che ha lox, dopo incrocio isolo animali cre-lox mouse che conterranno sia siti bersaglio che gene

che esprime ricombinasi, se la ricombinasi è sotto il controllo di promotore inducibile si avranno topi

normali, se dò doxiciclina e attivo l’espressione di cre ho risultato desiderato. Devo però far sì che cre

sia espresso solo in alcuni particolari tessuti, così studio l’effetto della mutazione localizzata. È un

sistema efficiente, in più ho il controllo della GFP. Con Southern vedo il locus wt, quando induco

espressione si ha la delezione e vedo il locus modificato.

Posso vedere che cosa succede facendo esprimere un gene potenzialmente tossico, posso far sì che

gene inizialmente non sia espresso, attivando sistema posso togliere porzione e esprimere il gene.

Molte possibilità di utilizzo.

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