Biologia applicata - Appunti

VETTORI

Servono per isolare i geni. Sono "veicoli" per mantenere il DNA estraneo dentro la cellula batterica. Vengono inseriti così: si mette il DNA del vettore a incubare con una nucleasi di restrizione che lo taglia in un solo punto e il frammento di DNA che si vuole clonare viene inserito utilizzando la DNA ligasi. Questa molecola di DNA ricombinante viene poi inserita in un batterio che viene lasciato proliferare in un brodo nutriente. I frammenti di DNA che interessano sono poi estratti (dopo aver sottoposto i batteri a lisi) con un enzima di restrizione adatto e separandolo da questo con la tecnica dell'elettroforesi su gel.

I vettori possono essere:

1. PLASMIDI - Piccole molecole di DNA circolare. PLASMIDE ARTIFICIALE molto più piccolo di uno naturale. Ha un'origine di replicazione del DNA di tipo batterico cosicché il DNA può essere replicato dalla cellula ospite. Hanno un'origine di replicazione rilassata, cioè non...

Segue la divisione cellulare, in modo che possa replicarsi più frequentemente. Hanno siti di riconoscimento per una serie di enzimi di restrizione e un sito di clonaggio multiplo.

2) COSMIDI ---> Plasmidi con possibilità di contenere inserti di DNA più grandi dei normali plasmidi. λ

3) FAGI ---> BATTERIOFAGO è di gran lunga il più utilizzato. Sono modificati per essere resi inoffensivi. Sono utili in particolare per creare librerie genomiche o librerie di espressione di cDNA (vedi dopo). 55

CROMOSOMI ARTIFICIALI USATI COME VETTORI:

• BATTERICI (BAC) ---> frammenti da inserire 200-300 kb.
• DI LIEVITO (YAC) ---> frammenti fino a 500 kb.
• DI MAMMIFERI (MAC) ---> si possono inserire interi geni con sequenze codificanti. Però sono molto grandi e si recuperano solo in piccole quantità.

TRASFORMAZIONE E SELEZIONE DEI RICOMBINANTI

TRASFORMAZIONE ---> processo tramite cui la miscela (contenente sia DNA ricombinante che non) viene

Introdotta nelle cellule batteriche. Per far sì che ciò avvenga i batteri vengono prima trattati con SALI DI CALCIO per rendere le loro membrane e pareti più permeabili al DNA delle cellule normali. A questo punto i batteri trasformati vengono fatti crescere su superfici solide (PIASTRA DI AGAR) contenenti nutrienti che permettono alle cellule di proliferare. I plasmidi al loro interno si replicano e vengono trasmessi alla progenie.

Ora è necessario SELEZIONARE quali cellule hanno i plasmidi e quali hanno il plasmide di interesse. Se il plasmide contiene resistenza ad un determinato antibiotico, la piastra sarà impregnata di quell'antibiotico. Sulla piastra si avranno quindi solo CLONI RESISTENTI che contengono il plasmide, ma NON è detto che abbiano l'inserto. Un certo numero di cloni potrà poi essere analizzato (PCR) per valutare la presenza dell'inserto e successivamente i cloni positivi potranno essere amplificati.

Interessa il gene -gal viene interrotto e non potrà più sintetizzare la parte amminoterminale. Le colonie che si produrranno saranno in questo caso BIANCHE.

GENOTECA DI DNA 56

GENOTECA = collezione di cloni che raccoglie tutte le informazioni genetiche di un organismo.

LIBRERIA GENOMICA = collezione di cloni contenenti almeno una copia di ogni sequenza di DNA del genoma.

LIBRERIA CROMOSOMICA = collezione di cloni di frammenti di singoli cromosomi.

LIBRERIA DI cDNA = collezione di cloni contenenti almeno una copia di ogni sequenza di DNA espressa da una cellula (mRNA).

COSTRUIRE UNA GENOTECA DI cDNA:

1. Si lisano le cellule e si purifica l'mRNA.
2. Si ibrida con un innesco di POLI(T), poiché all'estremità dell'mRNA vi è una sequenza di POLI(A).
3. Si fa una copia a DNA con la TRANSCRITTASI INVERSA.
4. Si degrada l'RNA con l'RNasi H.
5. Si sintetizza un filamento di DNA complementare (cDNA) con la DNA polimerasi.

polimerasi: l'estremità 5' dell'mRNA originale funge da innesco.

SCREENING DI UNA GENOTECA

1. Si STAMPA per contatto, con una leggera pressione, una copia della piastra su una membrana di NITROCELLULOSA a cui si appiccicano un po' di batteri di ciascun clone nella stessa posizione della piastra madre.
2. Si lisano i batteri sulla membrana. Questi rilasciano il DNA, che viene DENATURATO E FISSATO alla membrana sempre nella stessa posizione, per trattamento al calore o con raggi UV.
3. Si introduce la SONDA MARCATA RADIOATTIVAMENTE che andrà ad attaccarsi ai frammenti ad essa complementari.
4. Si lava la membrana in modo da eliminare le sonde radioattive.
5. Si espone la membrana su una LASTRA FOTOGRAFICA.
6. Dopo lo sviluppo si vedono sulla lastra delle macchie scure corrispondenti ai cloni positivi che possono essere rintracciati facendo combaciare la lastra radiografica alla piastra di partenza.

REAZIONE POLIMERASICA A CATENA (PCR)

Serve per:

• amplificare il

DNA.- isolare dei geni.- analisi dell'espressione genica.- analisi di medicina legale.- diagnosi per malattie genetiche.Avviene completamente IN VITRO.Visto che la PCR amplifica il DNA, la quantità di DNA richiesta è veramente minuscola (anche una sola molecola). 57Richiede i seguenti ingredienti:

1. Un DNA stampo.
2. Un 3'-OH libero su cui inserire nucleotidi.
3. Nucleotidi trifosfato.
4. Una DNA polimerasi termostabile.
5. Un tampone salino di reazione opportuno.

FASI PCR:Tre fasi che vengono ripetute 25-30 volte ottenendo un massimo di 2^25 - 2^30 molecole di DNA amplificato.TERMOCICLATORE = strumento in grado di scaldare e raffreddare rapidamente delle provette di reazione.

1. DENATURAZIONE: Il DNA a doppio filamento è scaldato e i due filamenti si dissociano.
2. IBRIDAZIONE: Il DNA viene raffreddato fino alla temperatura ottimale che permette l'ibridazione con i primer oligonucleotidici.
3. ESTENSIONE: In presenza di IONI MAGNESIO e NUCLEOTIDI TRIFOSFATO,

laDNA polimerasi termostabile sintetizza a partire dal 3’-OH libero dei primer un filamento di DNA complementare allo stampo a cui si è appaiato il primer.

SOUTHERN BLOT

SCOPO PRINCIPALE = individuare una specifica sequenza di DNA dalle molte bande spesso presenti in una separazione elettroforetica di una miscela di DNA.

ALTRI SCOPI:

• identificare frammenti sovrapposti di DNA clonato
• identificare differenze strutturali tra genomi analizzando i RFLP (vedi dopo)
• nel caso di animali e vegetali per determinare se un gene estraneo alla specie è presente e fa parte del genoma dell’ospite.

FASI:

1. DIGESTIONE DEL DNA GENOMICO con una ENDONUCLEASI
2. DNA viene sottoposto ad ELETTROFORESI
3. I frammenti separati sono DENATURATI ad elevato pH per ottenere DNA a singolo filamento.
4. Il DNA viene trasferito su MEMBRANE DI NITROCELLULOSA.
5. IBRIDAZIONE con sonde specifiche per individuare i frammenti di interesse.

RFLP

RFLP = POLIMORFISMI DEI FRAMMENTI DI RESTRIZIONE

Un RFLP è