Biologia applicata - Appunti

Biologia generale

Scoperte fondamentali

1953 → Watson e Crick: struttura del DNA

1958 → Meselson e Stahl: replicazione del DNA semiconservativa

Griffith: 1928 → Streptococcus pneumoniae → forma patogena e innocua. I batteri uccisi dal calore sono incapaci di causare infezione. Batteri patogeni morti + batteri innocui vivi → il topo muore. I batteri patogeni "trasformano" quelli innocui in patogeni. Cambiamento ereditabile → il materiale di cui sono fatti i geni doveva essere il DNA.

Avery: 1930/1940 → "Principio trasformante è il DNA". Separano le varie componenti delle cellule virali e le inseriscono una ad una in colture diverse con batteri vivi non virulenti. Diventano virulenti solo quei batteri in cui vi era presente il DNA dei batteri morti virulenti.

Hersey e Chase: 1953 → Virus T2 infetta E.Coli. Marcano radioattivamente DNA e proteine e centrifugano i virus marcati con E.Coli. Cellule batteriche pesanti sul fondo, leggere sulla superficie. Scoprirono che il DNA radioattivo entrava nelle cellule batteriche mentre le proteine marcate rimanevano nelle teste virali vuote.

Struttura del DNA

Nucleotidi = Zucchero pentoso + uno o più gruppi fosfato + base azotata. Nel DNA lo zucchero è il deossiribosio e le basi sono Adenina e Guanina (purine), e Citosina e Timina (pirimidine). Il 2-desossiRiboso è uno zucchero a cinque atomi di carbonio che manca di un gruppo ossidrile (-OH) in posizione 2. C5 fuori dall’anello. C1---base. C5---H3PO4.

Due nucleotidi si legano tra loro tramite l’H3PO4 attraverso un legame fosfodiesterico tra il C3 e il C5. Distanza tra le basi: 0,34nm. L’alfa elica ha un diametro di 20 Å (2nm).

Regole di Chargaff

• A/T e C/G = 1
• A+T/C+G varia
• A+G/C+T = 1

Tra A e T si formano due legami a idrogeno, tra C e G tre. I filamenti dell’elica sono antiparalleli. Un’estremità della catena presenta una sporgenza (il fosfato 5’), l’altra una nicchia (l’ossidrile 3’). DNA + proteine = cromatina.

Cromosomi

Le cellule umane hanno tutte (tranne germinali e globuli rossi) due copie di ciascun cromosoma → cromosomi omologhi. Cariotipo = immagine del corredo completo dei 46 cromosomi umani. Gene = segmento di DNA che contiene le istruzioni per sintetizzare una certa proteina. Genoma = corredo completo di informazione contenuto nel DNA di un organismo. Nei batteri è organizzato nel nucleoide. Origine di replicazione = sito dove il DNA comincia a duplicarsi. Sempre molti nei cromosomi per assicurare che si replichi rapidamente.

Telomero = estremità del cromosoma. Centromero = zona del cromosoma in cui i cromatidi sono a contatto. Nucleolo = zona in cui si raggruppano i tratti di DNA che codificano gli RNA ribosomiali appartenenti a cromosomi diversi.

Nucleosomi e cromatina

Istoni = proteine attorno alle quali si avvolge il DNA. Nucleosomi = complessi di 8 molecole istoniche e un tratto di DNA lungo 147 nucleotidi che si avvolge intorno all’ottamero istonico. Cromatina = DNA + proteine.

Eucromatina = regioni cromosomiche trascritte in modo attivo, prive di sequenze ripetute. Eterocromatina = regioni cromosomiche che rimangono allo stato condensato e sono geni trascrizionalmente inattivi.

Replicazione del DNA

È detta semiconservativa perché ogni elica figlia contiene un filamento originale più uno completamente nuovo. Inizio: proteine iniziatrici si legano al DNA e rompono i legami a idrogeno in zone ricche di A e T perché hanno solo due legami tra loro. Origine di replicazione = porzione in cui il DNA comincia ad aprirsi. Forcelle replicative = In questi punti il DNA apre i due filamenti e li utilizza come stampo per formare un nuovo filamento. Ad ogni origine di replicazione si formano due forcelle replicative che scorrono in direzioni opposte.

Procarioti → 1 origine; 1 bolla di replicazione bidirezionale. Alla replicazione segue immediatamente la divisione cellulare. Eucarioti → molte bolle di replicazione. La replicazione avviene nella fase S del ciclo. La DNA polimerasi sintetizza il nuovo DNA usando come stampo uno dei due filamenti originali → aggiunge nucleotidi all’estremità 3’. Non si dissocia dal DNA ogni volta che aggiunge un nuovo nucleotide alla catena ma scorre lungo il filamento stampo. La replicazione può avvenire solo in direzione 5’ → 3’. Essendo i filamenti antiparalleli, quello che deve allungarsi all’estremità 5’ viene sintetizzato in modo discontinuo, in brevi tronconi detti frammenti di Okazaki.

Il filamento sintetizzato in modo discontinuo viene detto filamento lento, l’altro filamento guida. Quando la DNA polimerasi “sbaglia” nell’accoppiare delle basi, si corregge in direzione 3’→5’. La DNA polimerasi è incapace di creare un filamento ex novo. La molecola in grado di farlo, unendo semplicemente due nucleotidi e facendo a meno di un terminale a doppio filamento, è la primasi.

Innesco e complesso d’inizio

Innesco (Primer) = Brevi tratti di RNA (uracile al posto di timina, ribosio al posto di deossiribosio) sintetizzati dalla primasi utilizzando il DNA come stampo. La primasi è un esempio di RNA polimerasi.

Complesso d’inizio = Primer + elicasi (che si incunea tra i due filamenti stampo e apre la forcella di replicazione) + proteine SSB (che sono capaci di legare i singoli filamenti di stampo e tenerli distesi) + topoisomerasi (che sono capaci di svolgere i superavvolgimenti positivi che si formano a valle della forcella di replicazione. Filamento guida → necessita di un solo innesco. Filamento lento → più inneschi.

Eliminazione degli inneschi

Per eliminare inneschi ad RNA e sostituire con DNA:

• Nucleasi → degrada RNA.
• Polimerasi riparativa → sostituisce DNA all’RNA.
• DNA ligasi → unisce il fosfato terminale 5’ di un frammento con l’ossidrile 3’ del seguente.

Morsetto scorrevole e telomerasi

Morsetto scorrevole = mantiene la DNA polimerasi ben salda sullo stampo durante la sintesi dei nuovi filamenti di DNA. Viene montato dal fissatore del morsetto. Sul filamento guida serve un solo evento di fissaggio per ogni ciclo replicativo; sul filamento lento invece il morsetto si sgancia dalla DNA polimerasi e si riaggancia ad ogni frammento di Okazaki.

Telomerasi → completano il cromosoma duplicato con dei nucleotidi sotto forma di sequenza ripetitiva terminale, questo perché quando la forcella replicativa sta per arrivare in fondo al cromosoma non c’è più spazio per l’innesco a RNA necessario per iniziare l’ultimo frammento di Okazaki.

DNA nei procarioti

DNA polimerasi I → rimuove il primer. DNA polimerasi II → capace di riempire i gap (buchi) di DNA, che hanno quindi una singola elica, senza bisogno di un primer a RNA. DNA polimerasi III → Attività 3’→5’ esonucleasica e correzione di bozze. Due molecole di DNA pol III che proseguono insieme → replisoma. Primosoma → primasi + elicasi.

Trascrizione RNA

Procarioti

La trascrizione avviene nel citoplasma. Trascrizione e traduzione sono contemporanee.

Eucarioti

La trascrizione avviene nel nucleo, la trascrizione e la traduzione non sono contemporanee.

Tipi di RNA

• mRNA (messaggero) → porta l’informazione precisa di come sarà costituita la proteina. Negli eucarioti codifica per una sola proteina, nei procarioti per molte.
• tRNA (di trasporto) → trasporta i diversi amminoacidi collocandoli in maniera opportuna sul ribosoma.
• rRNA (ribosomiale) → forma il nucleo base dei ribosomi.

Confronto tra replicazione e trascrizione

In comune:

• La trascrizione, come la replicazione, comincia con l’apertura e la despiralizzazione di un breve tratto della doppia elica del DNA in cui vengono esposte le basi presenti su ciascun filamento, uno dei quali farà poi da stampo per la sintesi dell’RNA. Il trascritto si allunga di un nucleotide alla volta e la sua sequenza è esattamente complementare a quella del filamento di DNA stampo.
• RNA polimerasi, come la DNA pol, catalizza la formazione di legami fosfodiesterici tra i nucleotidi.

Diversità:

• Il DNA rimane appaiato al DNA stampo, quello di RNA invece se ne distacca. Quindi le molecole di RNA prodotte nella trascrizione hanno un filamento unico, complementare a uno solo dei filamenti di DNA.
• Enzimi della trascrizione → RNA polimerasi.
• Sintesi RNA molto più veloce di quella di DNA.
• RNA polimerasi NON ha bisogno di un innesco.

Trascrizione nei procarioti

Promotore = sequenza specifica di nucleotidi che indica il punto di inizio per la sintesi di RNA. Sequenza ricca in T ed A detta Pribnobox. Riconosciuto dal fattore sigma. Segnale di terminazione = punto in cui l’RNA polimerasi si ferma. RNA polimerasi trascrive il filamento di DNA in direzione 5’ → 3’.

Trascrizione negli eucarioti

Tre tipi di RNA polimerasi:

• RNA polimerasi I → si trova nel nucleolo. Trascrive un filamento precursore 45S da cui vengono poi ritagliati i tre rRNA: 28S, 18S e 5,8S.
• RNA polimerasi II → si trova nel nucleo. Trascrive i diversi tRNA e rRNA 5S.
• RNA polimerasi III → si trova nel nucleo. Trascrive hnRNA che poi diventeranno mRNA dopo la maturazione.

RNA batterica dà inizio alla trascrizione per conto proprio, mentre l’RNA eucariotica ha bisogno dei fattori generali di trascrizione → si aggregano al promotore posizionando l’RNA polimerasi, aprono poi la doppia elica esponendo il filamento stampo e fanno partire l’enzima che comincia a trascrivere. Si vanno a legare alla sequenza TATA box del promotore.

Maturazione dell’RNA

L’estremità 5’ viene incappucciata con un nucleotide (7-metilguanosina) già molto prima che l’RNA polimerasi abbia trascritto tutto il gene. L’estremità 3’ viene invece corredata di una coda di poli-A. Introni = sequenze non codificanti dell’RNA. Esoni = sequenze codificanti. Introni = Esoni - 1. Splicing → processo attraverso cui gli introni vengono rimossi. snRNA = molecole di RNA che riconoscono il confine tra introni ed esoni. Si aggregano ad altre proteine a costituire le snRNPs. Spliceosoma = snRNA + snRNPs → aggregato che provvede a tagliare gli introni ed a ricucire gli esoni. Solo l’RNA maturo passerà attraverso i pori nucleari per essere tradotto, il resto viene degradato.

Struttura mRNA

Procarioti: Il filamento di mRNA inizia con la sequenza Leader che non viene tradotta in proteina, contenente la sequenza di Shine-Delgarno che si appaia durante la traduzione con l’RNA 16S. La sequenza codificante inizia sempre con la tripletta AUG e termina con una tripletta di STOP. Segue un tratto detto Trailer non codificante. I geni che codificano per proteine sono policistronici (ad un unico promotore seguono tutti i geni di una determinata via metabolica per cui vengono trascritti tutti di seguito).

Eucarioti: Simile ai procarioti ma, in aggiunta: - 5’ CAP (7-metilguanosina): che si legherà all’rRNA 18S durante la traduzione. - coda di poli-A al 3’. I geni che codificano per proteine sono monocistronici (ciascun gene ha il suo proprio promotore).

Struttura tRNA

Il filamento 5’ → 3’ assume una forma a trifoglio.

• Ansa D: vi si lega l’aminoacil-sintetasi (20, una per aminoacido) per legare un aminoacido al suo tRNA.
• Ansa dell’anticodone: contiene una tripletta complementare e antiparallela al codone che sull’mRNA codifica per un determinato aminoacido.
• Ansa del TpsiC: necessaria per il legame tra il tRNA e rRNA 5S presente nella subunità maggiore del ribosoma.
• Di sopra: codone CCA aggiunto post-trascrizionalmente a cui viene legato l’aminoacido specifico di quel tRNA.

Codice genetico

Tre basi specificano per un aminoacido → 4³ = 64 combinazioni per 20 aminoacidi. Ogni tripletta è detta codone. Triplette di STOP = UAG; UGA; UAA. → 64-3 = 61 triplette per 20 aminoacidi. Il codice è:

• Degenerato o ridondante → Gli aminoacidi sono specificati da più di un codone.
• Non ambiguo → Un determinato codone specifica per un solo aminoacido.
• Universale → Uguale per tutti gli esseri viventi.

Induttori e operoni

Induttori = composti che stimolano la sintesi di una proteina. Inducibili = proteine prodotte. Costitutive = proteine prodotte in una certa quantità in ogni momento. Operoni = unità di trascrizione dei procarioti.

I procarioti arrestano la trascrizione ponendo un ostacolo tra il promotore e i geni strutturali da esso controllati: qui si trova un segmento di DNA definito operatore a cui si lega un repressore per creare ostacolo. L’intera unità è l’operone.

Mutazioni

Transizione: da purina a purina, o da pirimidina a pirimidina. Trasversione: da purina a pirimidina o viceversa.

Conseguenze:

• Nessuna se ad essere colpita è la terza base di un codone e il nuovo codone codifica per lo stesso aminoacido.
• Cambio dell’aminoacido specificato dal codone ora mutato.
• Proteina più corta se un codone per l’aminoacido si tramuta in un codone di STOP.
• Proteina più lunga se da un codone di STOP per mutazione si passa ad un aminoacido qualsiasi.

Delezione o inserzione di una base: cambio del codice di lettura. Da quel nucleotide (deleto o inserito) la proteina sarà tutta diversa perché a codoni diversi corrisponderanno AA diversi.

Traduzione

Ribosoma = RNA ribosomici (rRNA) + proteine. Composti da:

• Subunità grande → catalizza la formazione dei legami peptidici che uniscono gli amminoacidi tra loro.
• Subunità piccola → accoppia i tRNA ai codoni dell’mRNA.

Ogni ribosoma contiene:

• Un sito di legame per una molecola di mRNA.
• Tre siti di legame (A, P, E) per le molecole di tRNA.

Processo:

La traduzione procede dall’estremità N-terminale all’estremità C-terminale del polipeptide. La traduzione ha sempre inizio con Formil-metionina nei procarioti e Metionina in eucarioti.

L’mRNA si lega alla subunità piccola e al tRNAmet grazie a fattori di inizio. L’mRNA in procarioti si lega con la sequenza Shine-Dalgarno al 16S rRNA; mentre in eucarioti l’mRNA si lega con il cappuccio al 18S rRNA.

Si assembla la subunità grande contenente i siti A e P per accogliere i tRNA. Il secondo tRNA con l’amminoacido corrispondente si lega all’mRNA nel sito A grazie a 2 fattori di allungamento ed a una molecola di GTP. I due AA sono così vicini da legarsi attraverso il COOH della metionina e l’NH2 del secondo AA. Legame che avviene ad opera della peptidil-transferasi.

Il primo AA, scarico della metionina, si stacca → traslocazione: l’mRNA scivola di un codone trascinandosi il secondo tRNA che passa dal sito A al sito P, lasciando libero il sito A per l’arrivo di un terzo amminoacido. Traslocazione permessa da un fattore di traslocazione e da una molecola di GTP. Quando sul sito A si trova un codone di STOP la sintesi si arresta. Fattori di rilascio impediscono l’attacco a qualsiasi AA nel sito A → forzano la peptidil transferasi ad aggiungere una molecola di acqua al peptidil-tRNA. Idrolasi permette la separazione della catena polipeptidica dal tRNA. Le due subunità ribosomiali si diassemblano.

Proteine

Polimeri di aminoacidi.

• Struttura primaria: rappresentata dalla sequenza lineare di aminoacidi.
• Struttura secondaria: struttura ad alfa-elica o beta-foglietto. Strutture date da legami a idrogeno che si instaurano tra differenti gruppi peptidici.
• Struttura terziaria: struttura secondaria che si piega su se stessa.
• Struttura quaternaria: associazione di più catene polipeptidiche.

Divisione cellulare

Mitosi = divisione nucleare. Citochinesi = divisione cellulare. Ciclo cellulare diviso in interfase e fase M (mitosi+citochinesi). L’interfase è a sua volta divisa in:

• Fase G1 → la cellula si accresce.
• Fase S → il DNA si duplica.
• Fase G2 → la cellula si accresce.

Il primo segno visibile che una cellula sta per entrare nella fase M è la progressiva condensazione dei suoi cromosomi.

Sistema di controllo del ciclo cellulare

Si assicura che le cellule replichino tutto il DNA e gli organelli prima di dividersi.

Punti di controllo:

• In G1 → Entrare in fase S solo con ambiente favorevole.
• In G2 → Per entrare in mitosi DNA deve essere completamente replicato ed eventuali danni al DNA riparati.
• In mitosi → Per separare i cromosomi fratelli i cromosomi devono essere correttamente legati al fuso mitotico.

Chinasi = proteine del sistema di controllo. Si attivano solo in determinati momenti in seguito a uno stimolo da parte di un altro tipo di proteine: le cicline. Per questo vengono chiamate chinasi ciclina-dipendenti.

Mitosi

Processo di divisione cellulare che garantisce la conservazione e la distribuzione dello stesso numero di cromosomi da una cellula madre alla due cellule figlie.

Il materiale cromosomico si raddoppia una volta e la cellula si divide una volta.

Interfase

Fondamentale la duplicazione del centrosoma, il principale centro organizzatore dei microtubuli della cellula.

Fasi della mitosi

Profase: Cromosomi si condensano. I centrosomi cominciano ad allontanarsi.

Metafase: L’involucro nucleare si disgrega e i cromosomi si schierano all’equatore del fuso.

Anafase: I cromatidi fratelli di tutti i cromosomi si separano e vengono tirati verso il polo del fuso al quale sono collegati.

Telofase: I gruppi di cromosomi raggiungono i poli del fuso. Il citoplasma comincia a dividersi. La cellula viene separata da un anello contrattile di actina e miosina. Cinetocori → zona del cromosoma che si lega al fuso mitotico. Apoptosi → morte programmata delle cellule.

Meiosi

Processo di divisione cellulare che porta alla produzione di cellule aploidi. Il materiale cromosomico si raddoppia una volta e la cellula si divide due volte.

Profase I = Cromatina si condensa. I cromosomi...