Appunti di Biologia Cellulare per l'esame del corso di laurea triennale in Scienze Biologiche (Università Milano Bicocca)

Appunti del corso di biologia cellulare

Università di Milano-Bicocca

Anno accademico 2015-2016

I meccanismi generali della comunicazione

La comunicazione tra cellule è critica per la funzionalità e la sopravvivenza degli organismi viventi: regola lo sviluppo e l’organizzazione dei tessuti e coordina le diverse attività cellulari per il corretto funzionamento degli organi.

Nota: la comunicazione con messaggeri chimici intercellulari è, in genere, il metodo più usato.

La cellula segnalante

La cellula segnalante è il punto di partenza della comunicazione perché fa partire il suo messaggio rilasciando molecole dette segnali (ligandi). Queste molecole possono essere secrete nello spazio extracellulare, rilasciate per diffusione attraverso la membrana o possono rimanere attaccate alla superficie esterna della cellula segnalante.

La cellula bersaglio

La cellula bersaglio risponde al segnale attraverso un recettore che si lega in maniera specifica alla molecola segnale, permettendo così l’inizio di una risposta cellulare.

I recettori

I recettori sono macromolecole (proteine) che, in base alla localizzazione nella cellula bersaglio, si distinguono in intracellulari (nel nucleo o nel citoplasma) e di membrana. Ricorda: il corredo recettoriale di una cellula è dinamico perché, nel corso del suo ciclo vitale, la cellula può modificarlo sia in termini quantitativi che qualitativi.

L’interazione tra ligando e recettore avviene attraverso legami deboli, fondamentali per garantire la reversibilità dell’interazione. Inoltre, la stabilità è legata al numero di interazioni che si riescono a formare: tante più sono le interazioni e tanto più il legame sarà stabile.

I recettori intracellulari

Questi recettori si trovano nel nucleo o nel citoplasma della cellula bersaglio, associati a complessi proteici che li mantengono inattivi. I segnali che si legano a questi recettori sono piccole molecole idrofobiche (ormoni) che sono in grado di diffondere liberamente attraverso la membrana plasmatica e legarsi così ai recettori intracellulari che funzionano da fattori di trascrizione.

I recettori di membrana

Questi recettori si trovano nella membrana plasmatica della cellula bersaglio. Nella loro struttura si individuano sempre tre regioni:

• Un dominio di interazione con il ligando
• Un dominio intramembrana idrofobico (ruolo strutturale)
• Un dominio per la trasduzione del segnale (dominio intracitoplasmatico)

I ligandi sono molecole idrofiliche incapaci di diffondere attraverso la membrana.

La trasduzione del segnale

Il recettore rappresenta il primo stadio di un processo noto come trasduzione del segnale, il processo in cui il segnale molecolare viene convertito nella forma necessaria ad attivare la risposta cellulare (che può essere più o meno rapida). Ricorda: la trasduzione può avvenire in un singolo passaggio, ma in genere è articolata in una serie di reazioni che coinvolgono numerose e diverse molecole.

I concetti fondamentali della trasduzione

Quando si tratta la trasduzione bisogna sempre studiare alcuni concetti fondamentali:

• Gli elementi coinvolti nella trasduzione
• La specificità
• La modulazione del segnale
• La cinetica

Gli elementi coinvolti

• Effettori: proteine che svolgono funzioni diverse
  • Strutturale (proteine impalcatura e proteine di integrazione/biforcazione)
  • Di trasmissione (kinasi, fosfatasi, proteine G, proteine che generano secondi messaggeri)
• Secondi messaggeri: piccole molecole prodotte in grosse quantità che hanno la capacità di attivare altre proteine (Es. cAMP)
• Proteine bersaglio

La specificità

Nonostante ci siano poche molecole segnale, si riscontra una grande varietà di effetti biologici, dato che le risposte cellulari sono tessuto specifiche. La specificità viene ottenuta perché:

• Ci sono recettori diversi
• Ci sono cascate di reazioni intracellulari diverse
• Il corretto svolgersi delle reazioni è facilitato dall’esistenza di specifici domini di riconoscimento e di proteine impalcatura
• C’è cooperazione e ridondanza del segnale

La modulazione del segnale

In un processo di trasduzione si ha un aumento dell’intensità del segnale man mano che la via di trasduzione procede. L’amplificazione è data sia dall’attività dei secondi messaggeri che dall’attività di elementi con attività enzimatica (Es. Kinasi).

La cinetica

Le risposte cellulari possono essere attivate o spente in tempi diversi. Con effetto soglia si intende il momento in cui si ha l’insorgenza dell’effetto (l’effetto si manifesta). La cooperatività è il feedback positivo, sono i meccanismi molecolari fondamentali dell’effetto soglia.

Nota: i tessuti sono in grado di regolare la quantità e l’attività dei recettori.

I meccanismi a livello tissutale

Ci sono due meccanismi a livello tissutale che sono attivati quando le cellule risultano essere o troppo o troppo poco stimolate:

• Desensitizzazione (e down regulation): stimolazione eccessiva
• Up regulation: segnale percepito con scarsa intensità

Le tipologie di comunicazione

In un organismo pluricellulare, la comunicazione può essere di due tipi:

• A corto raggio (brevi distanze)
• A lunga distanza

La comunicazione a corto raggio

Questa forma di comunicazione interessa spazi brevi (le cellule sono vicine). Viene distinta in:

• Dipendente da contatto: le molecole segnale restano attaccate alla superficie della cellula segnalante e quindi ci deve essere un contatto diretto tra cellula segnalante e cellula bersaglio. Un caso particolare è la comunicazione mediata da giunzioni gap che consentono una comunicazione bidirezionale e una rapida trasmissione di ioni e piccole molecole.
• Paracrina (e autocrina): le molecole sono secrete nell’ambiente extracellulare ma percorrono solo brevi distanze perché agiscono come mediatori locali. La distanza percorsa è condizionata da proteine antagoniste secrete che si possono legare al segnale o al recettore. In genere la cellula segnalante è diversa dalla cellula bersaglio (comunicazione paracrina), ma in alcuni casi le cellule rilasciano segnali a cui esse stesse rispondono (comunicazione autocrina).

La comunicazione a lunga distanza

Questa forma di comunicazione interessa grandi distanze. Viene distinta in:

• Endocrina: rilascio della molecola segnale nel torrente circolatorio. Le molecole segnale sono gli ormoni e le cellule segnalanti sono le cellule endocrine.
• Sinaptica: tipica del sistema nervoso (SN). L’assone neuronico termina in corrispondenza di connessioni specializzate (sinapsi) su cellule bersaglio distanti. Questa forma di comunicazione combina un segnale elettrico con un segnale chimico. Infatti, ogni impulso elettrico stimola il terminale a secernere il neurotrasmettitore.

Ricorda: Tra queste due forme di comunicazione ci sono delle importanti differenze:

• La comunicazione endocrina è lenta mentre quella sinaptica è veloce
• L’ormone e il suo recettore mostrano grande affinità mentre i neurotrasmettitori non necessitano di grande specificità perché sono rilasciati in corrispondenza della cellula bersaglio

I recettori collegati a proteine G (GPCR)

I GPCR sono la classe di recettori di membrana più numerosa: solo nei mammiferi ne sono stati identificati circa 700, buona parte coinvolta nel senso dell’olfatto. Ricorda: Sono così chiamati perché attivano le proteine G, legate all’estremità citoplasmatica.

La struttura

I GPCR hanno una struttura simile: sono per lo più glicoproteine costituite da una singola catena polipeptidica ancorata alla membrana plasmatica tramite 7 domini transmembrana idrofobici. L’estremità N-t si affaccia sul lato extracellulare; l’estremità C-t si affaccia sul lato citoplasmatico; si formano 3 anse (loops) intracellulari e 3 anse extracellulari. Nei GPCR si evidenziano regioni conservate (i domini transmembrana che hanno una funzione strutturale e di sostegno) e regioni variabili (C-t e il III loop che sono coinvolti nella cascata di reazioni intracitoplasmatica). La conformazione inattiva dei recettori è stabilizzata da interazioni non covalenti tra i residui amminoacidici delle α-eliche trasnmembrana. Il legame con il ligando disturba tali interazioni portando il recettore ad assumere la conformazione attiva.

Nota: Per i 7 domini, questi recettori sono anche chiamati “recettori 7 M” e “recettori serpentina”.

I ligandi

Le molecole segnale che si legano a questi recettori sono:

• Neurotrasmettitori (catecolamine, acetilcolina, serotonina, GABA, glutammato)
• Fotoni
• Odori
• Ormoni peptidici (neurormoni, oppioidi): comunicazione neuroendocrina
• Eicosanoidi: piccole molecole che derivano dall’acido arachidonico importanti nei processi disinfiammatori e nella comunicazione paracrina

Le proteine G trimeriche

I GPCR sono così chiamati perché attivano le proteine G eterotrimeriche. Sono proteine in grado di legare e idrolizzare GTP (mostrano attività GTPasica intrinseca). Si differenziano in: Small G proteins e Proteine G eterotrimeriche. Le proteine G eterotrimeriche sono formate da 3 subunità proteiche: α, β, γ. Le proteine sono ancorate alla membrana tramite catene lipidiche collegate alle subunità α e γ. La subunità α contiene il dominio con attività GTPasica ed è coinvolta nel legame con il recettore e con l’effettore. Inizialmente si pensava che la subunità βγ avesse il solo compito di mantenere il complesso inattivo (si lega alla subunità α e impedisce il rilascio di GDP): è stato dimostrato che anche la subunità βγ può interagire con recettori ed effettori.

Il ciclo di attivazione e disattivazione

Quando la proteina è inattiva, la subunità α è legata alla subunità βγ e lega nella tasca di legame GDP. Il ligando si lega al recettore determinandone un cambio di conformazione che comporta una maggiore affinità del recettore per la proteina G. La subunità α interagisce fisicamente con il recettore e il GDP viene scambiato con GTP. La proteina risulta così attiva e la subunità α si dissocia dalla subunità βγ per interagire con l’effettore. La disattivazione della proteina G si basa sul rilascio del fosfato: l’attività GTPasica della subunità α è notevolmente aumentata dall’interazione con l’effettore e con specifici regolatori chiamati RGS. Con l’idrolisi di GTP a GDP la proteina si disattiva e la subunità α si associa nuovamente alla subunità βγ.

Le vie di trasduzione

Nota: Le vie di trasduzione mediate da GPCR presentano uno schema ben preciso:

• Primo messaggero (= ligando) → recettore → proteina G → effettore → secondo messaggero → proteina kinasi → proteina bersaglio

Possiamo ricordare 4 vie di trasduzione:

• La via adenilatociclasi
• La via fosfolipasi C-β
• La via diretta K⁺/Ca²⁺
• La via cAMP e cGMP fosfodiesterasi

La via adenilatociclasi

Molti segnali extracellulari che agiscono tramite GPCR influenzano l’attività dell’adenilatociclasi determinando una variazione nella concentrazione del cAMP. L’adenilatociclasi è l’effettore della via: è una proteina di membrana costituita da una singola catena polipeptidica con due domini transmembrana e due domini che formano il centro catalitico. Il cAMP è il secondo messaggero: è una molecola idrosolubile che diffonde nella cellula e amplifica il segnale. La subunità α di una proteina G attivata mette in azione l’adenilatociclasi che sintetizza cAMP (aumento della concentrazione). Però c’è l’enzima cAMP fosfodiesterasi che, sempre attivo, degrada rapidamente il cAMP a AMP lineare. Per questa ragione la concentrazione del cAMP nella cellula varia in poco tempo.

Il cAMP esercita i suoi effetti principalmente sulla kinasi PKA. Questa proteina quando è inattiva è complessata ad un’altra proteina ed è formata da due subunità regolatrici e due subunità catalitiche. Quando il cAMP si lega alle due subunità regolatrici determina il distacco di queste da quelle catalitiche. Le subunità catalitiche attive possono così fosforilare molecole bersaglio specifiche per indurre la risposta cellulare. La risposta cellulare può essere:

• Rapida: controllo dei livelli di glucosio nel sangue
• Lenta: trascrizione di geni (proteina CREB)

Le modalità per spegnere la via sono 4:

• Distacco del segnale
• Attività GTPasica delle proteine G (si disattivano)
• cAMP fosfodiesterasi degrada cAMP a AMP lineare
• Fosfatasi agiscono in maniera opposta a kinasi

La via fosfolipasi C-β

Molti GPCR esercitano i loro effetti tramite proteine G che attivano l’enzima di membrana fosfolipasi C-β (PLCβ). Tali proteine sono chiamate proteine G_q. Gli elementi chiave di questa via sono: IP₃/DAG, Ca²⁺, PKC/CAMkinasi.

Nota: Anche le proteine G₀ possono attivare le fosfolipasi ma in questo caso la subunità che attiva è la subunità βγ. La fosfolipasi C idrolizza i legami dei fosfolipidi; la PLCβ agisce su una specifica classe di fosfolipidi di membrana chiamati PI, presenti in piccole quantità rivolti verso l’interno. La PLCβ attivata taglia PIP₂ (PI con gruppi fosfato) a dare:

• IP₃: (dalla testa idrofilica) piccolo mediatore intracellulare che, legandosi a specifici recettori sulla membrana del RE, ne determina l’apertura e il rilascio di Ca²⁺.
• DAG: (dalla coda idrofobica) molecola idrofobica che resta nella membrana e che ha il compito di attivare altre molecole tra cui PKC. Questa kinasi si chiama così perché per essere attivata necessita di DAG e di calcio. Un aumento della concentrazione di calcio altera la PKC in modo che traslochi dal citosol alla faccia citoplasmatica della membrana e possa così essere attivata (PKC convenzionali VS PKC atipiche).

Lo spegnimento della via è attuato grazie ad enzimi che agiscono su IP₃ e a pompe.

Il Ca²⁺ come secondo messaggero

Gli ioni calcio possono essere considerati secondi messaggeri perché si legano a diverse molecole bersaglio attivando risposte specifiche. Dato che la concentrazione di calcio è usata come elemento di controllo nelle cellule eucariotiche, sono state sviluppate tecniche che permettono di studiare la variazione della concentrazione durante la trasduzione del segnale (si usano per lo più indicatori fluorescenti sensibili allo ione).

La trasduzione del segnale mediata da calcio è legata alla formazione di picchi di calcio molto intensi (spark and spike): il segnale appare prima piccolo e localizzato in una sola regione o in poche (apertura di singoli o gruppi di canali). Se il segnale extracellulare è forte e persistente, il segnale può propagarsi come un’onda rigenerativa di calcio attraverso il citosol (spike: picco). A un picco di questo tipo ne seguono altri identici (frequenza oscillatoria).

La concentrazione degli ioni calcio in un compartimento cellulare è controllata dall’attività di specifiche pompe, di scambiatori, di proteine che complessano gli ioni, di canali ionici. La concentrazione di calcio citoplasmatico è mantenuta bassa (circa 10^-7 M); la concentrazione di calcio nel lume del RE o nell’ambiente extracellulare può essere anche 10 000 volte maggiore.

Gli effetti del Ca²⁺ sui bersagli sono per lo più indiretti e sono necessarie le proteine–leganti calcio. Una delle più abbondanti e studiate è la calmodulina che presenta 4 siti di interazione per lo ione. In una cellula non stimolata la calmodulina non ha abbastanza calcio per legarsi allo ione. Quando però la concentrazione di calcio aumenta lo ione si lega alla calmodulina in modo che possa attivare diverse proteine. Tra queste ricordiamo la CAMkinasi. Molto importante nel sistema nervoso è la CAMkinasi II. È una proteina di 12 subunità che quando è inattiva vede un dominio interno funzionare come un falso substrato. La CAMkinasi ha due importanti funzioni tra loro collegate: può funzionare da dispositivo di memoria molecolare e da decodificatore della frequenza di oscillazione dello ione calcio.

Le vie con canali ionici

Le proteine G possono attivare o disattivare direttamente canali ionici della membrana. I GPCR modulano l’apertura e la chiusura del canale tramite vie dirette (uso della subunità βγ) o tramite secondi messaggeri e kinasi (uso di nucleotidi ciclici).

La modulazione del canale tramite subunità βγ

L’acetilcolina rilasciata dal nervo vago è molto importante per ridurre la forza e la frequenza di contrazione del muscolo cardiaco. I recettori muscarinici per l’acetilcolina determinano un’apertura dei canali per il potassio che ha un effetto inibitorio. Infatti, il legame tra recettore e ligando porta all’attivazione della proteina G: la subunità α inibisce l’adenilico ciclasi mentre la subunità βγ si lega direttamente al canale del K⁺ e lo apre.

La modulazione del canale via cAMP

Il senso dell’olfatto dipende da GPCR: questi recettori sono in grado di riconoscere e legare molte molecole odorose attivando proteine G dette proteine G_olf. Queste proteine quando sono attivate agiscono sull’adenilatociclasi determinando un aumento della concentrazione di cAMP.