Appunti Biologia cellulare 03/03

GFP: è una proteina fluorescente verde ed è

diventata una sonda molto utilizzata nella

ricerca biologica. Le immagini riportate

nella diapositiva sono foto di animali, ma

anche cellule, che over-esprimono questa

proteina fluorescente verde.

Animale trangenico: è un animale, che

grazie alle tecniche della biologia

molecolare, ha subito nelle sue cellule una

manipolazione tale che il genoma è stato

modificato attraverso l’inserzione di un

frammento di DNA esogeno (il transgene).

In questo caso viene inserito il tratto di

DNA che codifica per la GFP che viene

quindi espressa e quindi è possibile ottenere

animali transgenici verdi fluorescenti.

Il premio Nobel nel 2008 per la chimica fu assegnato a tre scienziati Osamu Shimomura, Martin Chalfie,

Roger Y. Tsien per la scoperta e lo sviluppo dell’utilizzo della GFP. Shimomura che negli anni 70 si dedicava

alla raccolta delle meduse, che sono il materiale di partenza per i suoi studi: le Equorea victoria, infatti, sono

organismi bioluminescenti, da cui prima è stata isolata una proteina che chiamò equorina, che è una sonda per

il calcio (viene usata per misurare le variazioni di calcio intracellulare), e successivamente la GFP.

Fluorescenza: fenomeno per il quale una molecola colpita da una radiazione luminosa di una determinata

lunghezza d’onda, ne emette un’altra di energia inferiore, quindi con lunghezza d’onda maggiore. Molte

molecole biologiche possono essere studiate proprio perché hanno dei ligandi fluorescenti, o mediante

l’utilizzo di specifici anticorpi che vengono marcati con dei fluorocromi. Ci sono altre sostanze che possono

essere direttamente colorate con dei fluorocromi (DNA, RNA), che si legano in

modo stechiometrico a queste molecole e quindi dalla misurazione della

fluorescenza possiamo trarre tutta una serie di informazioni importanti.

Chalfie successivamente riuscì a studiare e clonare il gene per la GFP. Non fu poi

difficile inserire questo frammento di DNA in un vettore e cercare di farlo

esprimere in cellule.

La cosa interessante e che rende la GFP così maneggevole è che la sua

fluorescenza di fatto non richiede cofattori; non richiede ossigeno; non è specie-

specifica; ha delle dimensioni limitate, quindi, se viene espressa come proteina di

fusione con un’altra proteina nucleare o citoplasmatica, la localizzazione di quella

proteina sarà rispettata e anche i suoi movimenti; non è tossica anche se viene

over-espressa; è fotostabile.

È possibile, quindi, marcare le cellule e seguire il loro percorso durante lo

sviluppo embrionale (!!).

Tsien riuscì a generare tutta una serie di mutanti della GFP in grado di assorbire e

quindi poi emettere a lunghezze d’onda diverse (quindi tanti colori diversi della

GFP), così che se ne possano usare più di una in contemporanea per poter marcare

delle strutture diverse.

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Una cellula staminale è una cellula che si divide per un tempo

infinito, perché dotata di capacità di rinnovamento, e quando si

divide genera una cellula figlia uguale a sé stessa (quindi

anche questa staminale, che contribuisce al mantenimento

della popolazione) e una cellula progenitrice, ancora in grado

di dividersi, ma per un tempo limitato, ed è in grado di

generare una progenie che andrà incontro a differenziamento.

Si parla quindi di divisione asimmetrica delle cellule

staminali.

Due caratteristiche delle cellule staminali: capacità di

automantenersi (self-renewal) e la potenza differenziativa.

In base a queste conoscenze, possiamo dividere le cellule staminali in:

 Cellule staminali embrionali, indicate anche con ESC, si soltanto trovano nella blastocisti (stadio

dello sviluppo molto precoce dell’embrione, in particolare una settimana circa dopo la fecondazione

prima dell’impianto nella mucosa uterina);

 Cellule staminali tissutali o adulte, indicate anche con ASC, si trovano nel feto, nel bambino e durante

tutta la vita, quindi forse è più appropriato usare il termine tissutale. Fra queste vanno considerate le

cellule staminali neonatali, fetali e anche quelle isolabili dal sangue cordonale e dalla placenta,

pertanto possono anche essere chiamate cellule staminali tissutali o somatiche.

Le cellule staminali hanno un grande interesse biologico, in quanto è sempre più evidente che il

malfunzionamento dei meccanismi biologici molecolari che assicurano l’equilibrio tra rinnovamento e

differenziamento delle cellule staminali sono alla base di alcune patologie. Lo studio di queste cellule è anche

diretto verso la cura di certe patologie (medicina rigenerativa).

Il primo ad utilizzare il temine cellula staminale fu Haeckel nel 1868 (“stem cell”), riferendosi ad una cellula

capostipite di una linea cellulare. Successivamente questo termine fu usato anche da altri scienziati.

Lo zigote è la cellula staminale per eccellenza (totipotente).

Le ASC hanno una potenza differenziativa più limitata rispetto alle ESC. Se le ESC vengono definite

pluripotenti, cioè sono in grado di dare origine a dei progenitori, che dividendosi genereranno una progenie

cellulare che andrà incontro a differenziamento generando tutti i tipi cellulari di cui siamo costituiti.

Le ASC invece sono multipotenti, cioè sono in grado di dare origine a diversi, ma non tutti, i tipi cellulari. Ci

sono delle cellule staminali adulte, ad esempio quelle della pelle, che hanno una potenza differenziativa più

limitata, rispetto ad esempio alle cellule emopoietiche che sono multipotenti, infatti sono delle cellule

unipotenti/bipotenti/oligopotenti .

Qual è allora la differenza tra le ESC e lo zigote?

Lo zigote, essendo totipotente, può sostenere la generazione di non solo di tutte le cellule differenziate che si

trovano in un organismo, che derivano dai tre foglietti embrionali (endoderma, mesoderma, ectoderma), ma

sostiene anche lo sviluppo dei tessuti extraembrionali (questo le pluripotenti non possono farlo).

Oltre allo zigote, anche i blastomeri sono cellule staminali totipotenti, che sono quelle cellule che

costituiscono l’embrione nei due-quattro giorni in seguito alla fecondazione.

Le cellule pluripotenti (ESC) possono essere isolate dalla blastocisti e rappresentano la massa cellulare

interna, quindi dopo rimozione dello strato esterno possono essere messe in coltura e come nutriente si dà uno

strato di cellule mitoticamente inattivate, che si chiama feeding-layer, formando quindi una specie di tappeto

nutriente, in questa condizione le ESC manifestano la loro capacità di self-renewal, quindi di automantengono

per un tempo illimitato. Inoltre, sotto determinati stimoli possono formare tutte le cellule che derivano dai tre

foglietti generativi.

Le ASC possono essere multipotenti, quando ci si riferisce alla generazione di molti tipo cellulari, oligopotenti

(alcuni tipo cellulari), bipotenti (due), unipotenti (uno solo). Un esempio di quest’ultima è le cellule satelliti,

che sono le cellule staminali adulte residenti nel muscolo scheletrico. Le cellule satellite si trovano in una

nicchia tra la fibra del muscolo e la lamina basale. Questa cellula, quando attivata, può proliferare e generare

delle cellule che differenzieranno in fibre muscolari (e basta, perché sono unipotenti).

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Quando si parla di ESC ci si riferisce proprio alla massa

cellulare interna (o embrioblasto) della blastocisti,

circondato da un altro strato di cellule (trofoglasto), che

quando viene rimosso è possibile prelevare la massa

cellulare interna e coltivarla in opportune condizioni per

un tempo teoricamente indefinito.

I primi che riuscirono ad isolare cellule staminali

embrionali murine pluripotenti, furono Evans e

Kaufman (1981). Per dimostrare questa pluripotenza

delle cellule che erano riusciti ad isolare, fecero una

serie di saggi funzionali:

1. Differenziamento in vitro: se i due scienziati fossero davvero riusciti ad isolare una serie di cellule

pluripotenti, per definizione queste cellule dovevano essere in grado di generare una progenie capace

di differenziarsi in vitro in tutti i tipi cellulari derivanti dai tre foglietti germinativi. Per dimostrarlo,

quindi, queste cellule dovevano differenziarsi in almeno un tessuto derivante da ognuno dei tre

foglietti. Questo effettivamente succede, quindi il test del differenziamento in vitro veniva soddisfatto.

Loro seguivano l’acquisizione di questo fenotipo differenziato mediante l’espressione di specifici

marcatori, tipici di quella cellula differenziata. Quindi andavano a testare l’espressione, ad esempio, di

specifiche proteine che sono tipiche del neurone, del condrocita ecc.

2. Formazione di chimere: questo test consiste nel testare la

pluripotenza di queste cellule andando a iniettare nella

cavità di una blastocisti ospite un’aliquota di queste cellule

che hanno isolato dalla massa interna di un’altra blastocisti.

Se le nostre cellule sono pluripotenti, si coordineranno o

andranno a colonizzare tutti i tessuti dell’embrione che

quindi sarà chimerico, perché tutti i suoi tessuti, compresa la

linea germinale, saranno composti da cellule con due

genomi diversi. Ovviamente questo test non si applica alle

ESC umane. Si tratta di un tipico saggio funzionale



retrospettivo se il topolino che ottengo è chimerico in

tutti i suoi tessuti, allora le cellule che ho prelevato erano

pluripotenti.

3. Formazione di teratomi: i teratomi sono dei tumori dei tessuti embrionali composti da tessuti derivanti

da tutti e tre i foglietti embrionali. Se le cellule staminali embrionali che ho isolato erano veramente

pluripotenti, iniettati sottocute in un topolino immunodepresso dovevano condurre alla generazione di



un teratoma. Quindi, le ESC sono tumorigeniche sono così potenti dal punto di vista

differenziativo, da essere tumorigeniche. È quindi importantissimo studiare le cellule staminali per

poterle usare in modo sicuro.

Nel 1998 James Thompson dimostra di essere riuscito ad isolare delle ESC da blastocisti umane.

Per la tecnica di fecondazione in vitro, la donna deve prima sottoporsi ad una forte stimolazione ormonale e

questo trattamento stimola la produzione di oociti. A questo punto le cellule vengono prelevate e in laboratorio

può avvenire la fecondazione con spermatozoi in vitro. Sempre in vitro, si permette a queste cellule fecondate

e messe in incubatore per qualche giorno di dividersi, e questi embrioni poi vengono impiantati nell’utero

della donna. A causa di queste potenti stimolazioni embrionali, talvolta il numero di cellule potenzialmente

fecondabili possono essere anche davvero molto numerose, e a seconda dei paesi il numero di cellule che poi

possono essere impiantate in un’unica volta varia, ma ci sono delle restrizioni numeriche. Pertanto, alcuni di

questi em