Appunti di biochimica strutturale (biochimica 1)

Biochimica

Carbonio e biomolecole

Importanza del carbonio – I suoi composti non sono ionici perché possiede la metà di elettroni necessari per riempire le sue orbite elettroniche più esterne (non adatte alla costruzione di molecole elaborate per via delle forze non direzionali).

- Conformazione

- Configurazione

- Catabolismo – Ossidazione

- Anabolismo – Riduzione – Da precursori a macromolecole

- Accoppiamento energetico – ATP – Reazione diretta con il metabolita che necessita di attivazione (reazioni termodinamicamente non favorite, cioè quelle endoergoniche, vengono accoppiate a reazioni termodinamicamente favorite, cioè con delta G minore di zero, e quindi esoergoniche. Il delta G totale deve essere negativo).

- Catalizzatori (enzimi)

- Pathways metabolici – Controllati in modo da regolare i livelli di metaboliti (la concentrazione di prodotto finale attiva o inibisce l’azione dell’enzima che catalizza la prima reazione della via metabolica). Esempio: da treonina a isoleucina.

Proteine

- Funzioni

- Struttura: fibrose, globulari, coniugate

- In soluzione gli aa sono ionizzati e lo stato di ionizzazione dipende dal pH (la ionizzazione riguarda il gruppo amminico e quello carbossilico)

- Punto isoelettrico: pH al quale l’aa è in forma neutra (dipende da R), importante conoscere pKa di R per sapere che carica porta l’aa a pH fisiologico. pH>pI (aa -), pH<pI (+). Ricordare che istidina è unico aa con potere tampone a pH vicino alla neutralità (la carica del gruppo imidazolico a pH neutro può essere positiva o neutra, per questo His prende spesso parte a catalisi enzimatica come donatore o accettore di protoni).

- Stereoisomeri (enantiomeri) – Immagini speculari non sovrapponibili – Attività ottica, capacità di ruotare il piano della luce polarizzata. Aa tutti di tipo L.

- Metionina: primo aa incorporato nelle proteine (N-terminale). Prolina – Struttura ciclica che influenza stabilità e ripiegamento del polipeptide. Tirosina – Gruppo OH forma legami idrogeno, è implicato in catalisi, è modificato post-trad. Cisteina: due residui possono formare tra di loro un ponte disolfuro – Collegamento di regioni diverse di una proteina o di più catene polipeptidiche (stabilizzazione della conformazione).

- Interazione col solvente: gli aa con gruppi R idrofilici (aa basici e acidi) vengono esposti sulla superficie esterna della proteina.

- 2 aa aggiuntivi: selenocisteina (deriva da serina) e pirrolisina (da lisina).

- Modificazioni post-traduzionali degli aa: ossidrilazione, metilazione, acetilazione, fosforilazione, carbossilazione.

- Due tipi di legami covalenti: peptidico e ponte disolfuro (unisce due aa non consecutivi).

- Formazione legame peptidico tra due aa con espulsione di una molecola di acqua (parziale carattere di doppio legame dovuto a risonanza, non c’è libera rotazione del legame C-N peptidico).

- Le proprietà di una proteina dipendono SOLO dai gruppi R degli aa che la compongono.

- Isomeri geometrici (configurazione cis/trans) – A livello del legame peptidico la configurazione preferita è quella in trans.

- Struttura primaria: sequenza aa di una proteina.

Struttura proteine e folding

- Legame peptidico (C—NH) – Libera rotazione impedita, il legame costituisce una struttura planare rigida. C’è libertà di rotazione tra il carbonio alfa e il gruppo carbonilico (angolo psi) e tra il carbonio alfa e il gruppo NH (angolo phi).

- Dato che il legame peptidico è rigido, la conformazione della catena aa è definita quando psi e phi sono fissati per ogni residuo della catena. MA, un residuo non può avere una qualunque coppia di tali valori poiché certe combinazioni non sono possibili a causa di impedimenti sterici (tensione sterica). Agli angoli diedri viene assegnato valore di 0 gradi quando la catena è completamente estesa e aumentano quando si ruota in senso orario. I vincoli sterici che esistono sugli angoli di torsione di una catena ne limitano la sua variabilità conformazionale. Le conformazioni proibite sono quelle per cui la distanza interatomica di un’interazione non covalente è inferiore alla corrispondente somma dei raggi di van der Waals.

- Diagramma o plot di Ramachandran: diagramma che riporta le coppie di valori permessi degli angoli diedri. Rappresenta le regioni stericamente permesse. Misure più precise risultano dal calcolo delle energie relative a ciascuna conformazione. Qualunque scelta accettabile venga fatta riguardo il raggio di van der Waals, si ottengono solo 3 regioni del plot fisicamente accessibili alla catena polipeptidica (solo il 25% del plot è costituito da zone stericamente permesse). Eccezione: glicina e prolina: le zone permesse sono più ampie (45%) – il plot relativo alla glicina è centro-simmetrico, questo perché è l’unico aa simmetrico – per questo motivo la glicina ha ruolo strutturale molto importante perché permette conformazioni inusuali alla catena principale proteica. La prolina (essendo costituita da un gruppo R ciclico) è caratterizzata dalle maggiori restrizioni conformazionali.

- Struttura secondaria: data dal ripiegamento della catena polipeptidica, essa analizza i rapporti tra aa vicini nella struttura primaria (alfa elica) o anche distanti tra di loro (foglietto beta). La str. Secondaria rappresenta l’organizzazione tridimensionale di segmenti definiti della catena aa. È la str. Primaria che determina il tipo di piegamento. 3 tipi: alfa-elica, foglietto beta, ripiegamento beta.

- Struttura ad alfa-elica: la più semplice organizzazione tridimensionale di una catena polipeptidica, le sue proprietà includono la bassa solubilità. Lo scheletro carbonioso è avvolto intorno ad un asse centrale, lasciando i gruppi R proiettati verso l’esterno (assume struttura a bastoncino). Essa si forma quando un certo numero di coppie successive di angoli diedrici hanno valori compresi tra -60 e -50 gradi. In questo modo i piani peptidici si dispongono in maniera elicoidale intorno ad un asse longitudinale. L’elica è tenuta insieme da legami H tra il carbonile di un legame peptidico e NH del legame peptidico del quarto aa successivo (quindi i legami H sono intracatena). Lo spazio interno è quasi nullo, privo di molecole di acqua e quindi idrofobico, i gruppi R polari sono esposti esternamente. Non tutti gli aa sono compatibili con la formazione dell’alfa elica: la prolina non forma tale struttura secondaria poiché l’N non ha nessun H disponibile per la formazione di ponti H, inoltre fa parte di un anello rigido e quindi il legame Calfa-N è bloccato. La glicina è invece troppo piccola. Alanina forma spontaneamente l’elica.

- Foglietto beta: Si formano legami H intercatena tra filamenti di almeno 5-10 aa, organizzati in modo che lo scheletro carbonioso risulti in un andamento a zig-zag. I legami possono formarsi anche intracatena ma tra residui distanti tra di loro nella sequenza primaria. Tale struttura è composta principalmente da residui di glicina e alanina e i gruppi R giacciono sopra e sotto il piano del legame peptidico. La disposizione dei foglietti può essere parallela o antiparallela (è la più stabile perché H del legame H risulta in linea con O e N). L’intervallo dei valori degli angoli diedri che possono essere assunti nella formazione di tale struttura è molto ristretto (valori in alto a sx del plot).

- Ripiegamento beta: struttura che si ritrova in ripiegamenti e anse, dove la catena cambia direzione, collega tratti successivi in alfa eliche o in foglietti beta ed è un ripiegamento di 180 gradi di una sequenza di 4 residui.

- Rilevazione della struttura secondaria: tecnica del dicroismo circolare

- Alfa elica e foglietto beta possono combinarsi tra loro per dare origine a motivi proteici che fanno parte della struttura terziaria.

- Esistono proteine a sola struttura secondaria (proteine fibrose): sono rigide, idrofobiche e formano macro-aggregati fibrillari. Queste sono proprietà ideali per una funzione strutturale (collagene, cheratine). Tipiche dei tessuti connettivi.

- Fasci di alfa eliche possono superavvolgersi tra di loro andando a formare coiled coils (tipica delle proteine fibrose). Struttura lineare con conformazione a filamento.

- Miosina: proteina costituita da una regione C-terminale a struttura fibrillare (coda) formata da due alfa eliche avvolte, e da una regione N-terminale (testa) a struttura globulare con funzione enzimatica.

- Alfa cheratine: proteine strutturali formate da due catene di alfa cheratina che si avvolgono su sé stesse a dare una struttura coiled coil. Ponti S-S trasversali intercatena stabilizzano le singole eliche mantenendole compatte ed avvolte. A seconda del loro numero protofilamento e microfibrilla saranno più o meno duri.

- Fibroina della seta: proteina fibrosa a foglietto beta. Aa con gruppi R piccoli che portano ad una perfetta sovrapposizione dei foglietti. La struttura è flessibile.

- Collagene: proteina fibrosa caratterizzata da struttura a triplice elica allungata. Struttura secondaria unica, distinta da quella ad alfa elica. Presente nel tessuto connettivo. Proteina strutturale che assicura flessibilità a pelle, ossa, tendini, vasi sanguigni etc. Forma una tripla elica chiamata tropocollagene (unità strutturale). Non sono alfa eliche ma eliche allungate. Ciò è dovuto alla presenza di glicina e prolina (nelle estroflessioni), le quali rilassano la catena permettendo la loro associazione con altre catene mediante legami H. Non si sono legami H intracatena ma intercatena. Risulta quindi compatta, idrofobica e insolubile, adatta a formare fibre. Le unità di tropocollagene si dispongono testa-coda in modo leggermente sfalsato. Sequenza a tripeptidica ripetuta gly-X-Y (X=prolina, Y=4-idrossiprolina). Il collagene contiene anche legami covalenti trasversali intercatena tra catene laterali di lisina e istidina che tendono ad aumentare con l’età.

- Oltre alle proteine strutturali, le strutture secondarie possono formare anche proteine integrali di membrana (recettori, canali, porine, trasportatori).

- Folding: da struttura secondaria a quella terziaria – Ripiegamento della catena polipeptidica

- Denaturazione: perdita della conformazione e della struttura tridimensionale (con calore, pH, forza ionica, agenti chimici denaturanti come l’urea) – Rottura dei legami H della struttura secondaria e perdita di funzionalità.

- Struttura terziaria: disposizione nello spazio degli atomi di una proteina (relazioni a lungo raggio tra aa distanti della stessa catena). Conformazione tridimensionale degli atomi nello spazio. Struttura stabilizzata da legami non covalenti e da legami covalenti (S-S tra cisteine). PDI: protein disolfuro isomerasi, enzima coinvolto nella formazione di ponti disolfuro tra 2 residui di cisteina. Avviene a seguito dell’ox dei gruppi SH di due cys vicinali (con perdita di acqua).

- Proteine globulari: catene ripiegate con conformazione sferoidale (combinazioni di str. Secondarie). Solubili in acqua, hanno struttura terziaria, sono proteine cellulari, sono enzimi e proteine regolatrici. Se la struttura secondaria si ripiega si origina la struttura globulare. Interno idrofobico, all’esterno vengono esposti aa polari che rendono solubile la proteina. La catena si ripiega nelle regioni che mancano di struttura secondaria. Tali ripiegamenti sono favoriti da aa come prolina, glutammato, lisina vicinali e triptofano vicinali.

- Motivo: struttura supersecondaria o ripiegamento – Avvolgimento caratteristico formato da uno o più elementi di struttura secondaria e da elementi di connessione (beta-alfa-beta loop e beta barrel).

- Domini: porzioni tipiche delle proteine globulari dotate di specificità strutturale e funzionale. Strutture indipendenti ognuna delle quali ha le caratteristiche di una piccola proteina globulare. La combinazione di più strutture secondarie nella stessa proteina permette la creazione di diverse forme nello spazio con conseguente manifestazione di diverse strutture funzionali – Possono essere create molte proteine diverse.

- 4 classi di proteine (secondo classificazione strutturale SCOP): tutto alfa, tutto beta, alfa/beta (strutture tra loro alternate), alfa + beta (strutture tra loro distanziate).

- Famiglia di proteine: proteine con somiglianza significativa nella struttura ½ e nella funzione.

- Ad una struttura tridimensionale di una proteina è associata una funzione biologica.

- Proteina nativa: proteina nella sua forma funzionale.

- Le proteine si ripiegano spontaneamente nella loro conformazione nativa in condizioni fisiologiche. La struttura 1 determina la struttura tridimensionale (III).

- Il ripiegamento non è casuale, ma è gerarchico. Si ha un procedimento a tappe le prime delle quali sono: formazione di nuclei idrofobici compatti, formazione di strutture secondarie, formazione di domini e raggiungimento della conformazione nativa. Il processo avviene in modo cooperativo.

- Ipotesi di Anfinsen: la sequenza aa contiene tutte le informazioni per il ripiegamento della proteina.

- Spiegazione termodinamica: lo stato nativo rappresenta la forma a minima quantità di energia libera della proteina. La proteina assume la forma termodinamicamente più stabile.

- Problema: l’esplorazione di tutte le possibili conformazioni da parte di una proteina sarebbe un processo troppo lento (ordine di migliaia di anni). Quindi deve esistere un percorso preciso e diretto di ripiegamento. Durante il corretto avvolgimento si ha una diminuzione di energia libera interna e la stabilità aumenta progressivamente, rendendo il processo di fatto irreversibile. Alcuni elementi si formano per primi, questi elementi guidano il resto della catena nell’assumere la conformazione nativa (processo gerarchico).

- Folding proteico: Fase veloce: formazione di segmenti locali di struttura secondaria

• Collasso idrofobico
• Formazione di un globulo fuso (molten globule) con prevalenza di struttura secondaria. Il globulo fuso è un intermedio di ripiegamento già globulare ma ancora poco compatto
• Stabilizzazione delle strutture secondarie e formazione di proto-domini
• Stabilizzazione della struttura terziaria finale con espulsione di acqua e formazione dei legami H.

- Il tutto può essere visto come un imbuto di energia libera dentro il quale si formano le strutture intermedie, nel processo si ha abbassamento di entropia e di energia libera. Con il procedere del ripiegamento aumenta il numero delle interazioni e quindi diminuisce il numero di conformazioni ammesse.

- Ripiegamento assistito: molte proteine necessitano di aiuto per il corretto ripiegamento. Intervengono i chaperoni molecolari:

• Hsp70: si legano a regioni polipeptidiche non ripiegate e impediscono aggregazioni improprie
• Chaperonine: complessi proteici necessari per il ripiegamento di alcune proteine cellulari che non si organizzano in modo spontaneo.

- Difetti nel ripiegamento: patologie – le proteine solubili secrete dalla cellula ma con un avvolgimento incorretto vengono convertite in fibre extracellulari insolubili che formano placche amiloidi.

- Proteine coniugate: proteine a struttura terziaria che hanno inglobato un gruppo di natura non proteica, che risulta però essenziale per il funzionamento della proteina (gruppo prostetico o coenzima). Es. mioglobina (presente nei muscoli di tutti i mammiferi), formata da una parte proteica chiamata apoproteina (impedisce ox irreversibile del Fe, 2+ rende possibile legame reversibile con O all’eme, modula la funzione del gruppo eme) e dal gruppo prostetico eme (struttura ad anello, contiene atomo di ferro, sito di legame per l’ossigeno; inserito in tasca idrofobica della proteina che impedisce ox del ferro). Ricordare che emoglobina è quasi tutta ad alfa elica con aa esterni e nelle anse polari, aa interni apolari con due istidine cruciali per legame ossigeno, costituita da 153 aa. Il Fe ha 6 legami di coordinazione (4 con N degli anelli pirrolici e 2 perpendicolari al gruppo eme, uno lega un residuo di istidina e uno l’ossigeno). Per funzionare bene, il Fe deve essere nello stato ridotto (2+).

- Molte proteine sono intrinsecamente non strutturate (IUP): non possiedono proprietà strutturali uniformi, una struttura ripiegata, hanno conformazione estesa e sono molto flessibili (contengono combinazioni di aa che conferisce carica netta e bassa idrofobicità). Queste proteine aumentano nel corso dell’evoluzione. Vantaggio: sono più malleabili e consentono il legame con più ligandi adattando la loro struttura.

Struttura quaternaria

- Descrive l’assemblaggio delle diverse subunità nelle proteine chiamate oligomeriche o multimeriche (cioè formate da più catene polipeptidiche che stabiliscono interazioni tra di loro). Tale associazione è guidata da forze deboli. Le subunità sono legate con legami H, interazioni idrofobiche e interazioni elettrostatiche. Esempio: emoglobina (formata da 4 subunità e 4 eme, 2 subunità di tipo alfa e due di tipo beta, ogni subunità contiene un gruppo eme, quindi essa riesce a legare 4 molecole di ossigeno piuttosto di una sola nella mioglobina. Funzionalmente l’emoglobina opera però come due metà, alfa1beta1 e alfa2beta2 saldamente accoppiate).

- Contenuta negli eritrociti.

- In molte proteine multimeriche le subunità monomeriche di dispongono simmetricamente: disposizione simmetrica ciclica e di.