Appunti di Biochimica

Biochimica 8 CFU

Prof. Mauro Magnani

Scienze biologiche

Riassunti completi con teoria e immagini (Lehninger capitoli: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23)

Parte 1: Capitoli introduttivi (dal 3 al 12 + 23)

Capitolo 3: Amminoacidi, peptidi e proteine

Le proteine sono le macromolecole più abbondanti in natura e sono formate sempre dalla stessa serie di amminoacidi uniti covalentemente.

Gli amminoacidi prendono il nome di residui amminoacidici per sottolineare la perdita degli elementi di una molecola di acqua quando un amminoacido si unisce ad un altro. Il primo amminoacido scoperto fu l’asparagina. Si tratta di α-amminoacidi che hanno un gruppo carbossilico e uno amminico legati al C α e che differiscono per la catena laterale o gruppo R. Il C è detto centro chirale.

Per ogni amminoacido sono possibili 2 stereoisomeri detti enantiomeri per la forma speculare, che differenziano solo per la posizione di H N e H a destra e a sinistra e che si indicano con L e D. Gli atomi di C del gruppo R si indicano con le lettere β, γ, δ, ε... I residui degli amminoacidi nelle molecole proteiche sono tutti stereoisomeri L, quelli D sono presenti solo in pochi piccoli peptidi.

Classificazione dei gruppi R

• Gruppi R alifatici non polari: Idrofobici. Esempi: Alanina, Valina, Glicina, Prolina.
• Gruppi R aromatici: Idrofobici. Il Triptofano e la Tirosina assorbono luce UV, questo spiega il caratteristico assorbimento della luce della maggior parte delle proteine con una lunghezza d’onda di 280nm.
• Gruppi R polari non carichi: Gruppi molto più solubili in acqua perché contengono gruppi funzionali che formano legami H con l’acqua. Esempi: Asparagina, Cisteina.
• Gruppi R carichi positivamente: Basici. Esempio: Arginina.
• Gruppi R carichi negativamente: Acidi. Esempi: Aspartato, Glutammato.

Oltre ai 20 comuni, le proteine possono contenere anche residui amminoacidici, formatisi per modifiche chimiche dei residui già incorporati in un polipeptide. Sono stati identificati nelle cellule circa 300 altri amminoacidi che hanno svariate funzioni, ma non sono costitutivi.

Quando un amminoacido che non ha un gruppo R ionizzabile viene sciolto in acqua a pH neutro, esso esiste in soluzione come ione dipolare o zwitterione e può comportarsi da acido o da base e prende il nome di anfoterico.

Gli amminoacidi presentano caratteristiche curve di titolazione:

• A pH bassi prevale la forma completamente protonata della glicina.
• Al punto di mezzo, che per la glicina è 2,34, il gruppo COOH prende il protone. Al punto di mezzo il pH=pKa. Il pKa può essere inteso come una misura della tendenza di un gruppo a cedere il protone.
• A 5,97 si ha il secondo punto di flesso a cui corrisponde la rimozione completa del primo protone e l’inizio della rimozione del secondo. Qui la glicina è nella forma dipolare.
• A 9,60 si ha la rimozione del secondo protone e corrisponde al pKa di NH. Intorno a 2,34 e 9,60 si hanno due regioni con potere tamponante.

Equazione di Henderson-Hasselbalch

HA ↔ H⁺ + A⁻

pH = pKa + log [A⁻]/[HA]

Ka = costante di dissociazione

HA = acido

pKa = valore del pH al quale l’acido è per metà dissociato

• [A⁻]=[HA] punti di flesso
• Punto isoelettrico: pH al quale la carica netta è zero.

L’istidina ha un potere tamponante intorno ad un pH neutrale, condizione tipo dei fluidi intracellulari ed extracellulari di animali e batteri.

Il legame peptidico permette la formazione di un dipeptide, si genera per eliminazione di una molecola d’acqua dal gruppo α-carbossilico di un amminoacido e dal gruppo α-amminico dell’altro, il primo deve essere attivato. I legami peptidici sono abbastanza stabili.

I peptidi contengono un solo gruppo α-amminico libero e un solo gruppo α-carbossilico libero posti all’estremità della catena, questi gruppi ionizzano come quelli degli amminoacidi liberi. Anche i peptidi hanno curve di titolazione. Il pKa di un gruppo R ionizzabile può modificarsi quando l’amminoacido entra a far parte della struttura di un peptide.

Anche i peptidi più piccoli svolgono ruoli importanti come ad esempio l’ossitocina che viene secreta dalla ghiandola pituitaria posteriore e stimola la contrazione dell’utero.

Alcune proteine sono formate da singole catene, altre da più polipeptidi. Se almeno 2 sono identiche la proteina è detta oligomerica e le unità identiche protomeri. Il numero di residui amminoacidici in una proteina può essere calcolato dividendo il suo peso molecolare per 110. Le proteine che contengono altri gruppi chimici oltre agli amminoacidi sono dette proteine coniugate, la parte non amminoacidica è detta gruppo prostetico. Per esempio, le lipoproteine contengono lipidi, le glicoproteine gruppi saccaridici, ecc.

Per poter studiare una proteina è necessario purificarla: il primo passaggio consiste nella rottura delle cellule provocando il rilascio delle proteine in una soluzione detta estratto grezzo, poi si ha il frazionamento usufruendo della grandezza e della carica delle proteine, poi si ha la dialisi attraverso ad es. la cromatografia su colonna che sfrutta le cariche, la grandezza e l’affinità di legame. Le singole frazioni vengono analizzate per cercare la proteina d’interesse. Un altro metodo è l’elettroforesi che è utile per separare e visualizzare le proteine individuando il numero e il grado di purezza. La migrazione della proteina su gel durante l’elettroforesi è una conseguenza delle dimensioni e della forma. Spesso nell’elettroforesi si usa il detergente SDS (sodio-dodecil-fosfato).

L’isoeletrofocalizzazione serve per determinare il punto isoelettrico di una proteina, combinandola con l’elettroforesi SDS si ha l’elettroforesi bidimensionale che può risolvere una miscela complessa di proteine.

Unità di attività enzimatica: quantità di enzima necessaria per trasformare 10 μmol di substrato al minuto a 25 °C nelle condizioni di dosaggio attuali.

Esistono 4 livelli di struttura delle proteine:

• Struttura primaria: È rappresentata solo dagli amminoacidi uniti dal legame peptidico. La proteina nella struttura primaria non è stabile, elevata energia ed entropia.
• Struttura secondaria: Organizzazione di brevi sequenze amminoacidiche che originano particolari strutture per tratti della molecola che si ripetono: β foglietto o α elica.
• Struttura terziaria: Descrive gli aspetti tridimensionali.
• Struttura quaternaria: Si ha quando la proteina è costituita da 2 o più subunità polipeptidiche. C’è una correlazione struttura-funzione della proteina, alterando la struttura primaria si altera la sua funzione. Proteine con stesse funzioni in specie diverse hanno sequenze amminoacidiche simili. Le proteine umane sono polimorfiche cioè mostrano piccole variazioni nella popolazione umana.

1953: Sequenziamento proteine Sanger – Doppia elica Watson e Crick.

Per degradare un intero polipeptide si può usare la degradazione di Edman attraverso un sequenziatore che automatizza i processi. Per sequenziare le proteine di grandi dimensioni devono essere prima scisse in frammenti attraverso metodi chimici o enzimatici:

• Rottura dei legami disolfuro: Se sono presenti devono essere scissi perché potrebbero generare interferenze col sequenziamento.
• Rottura della catena polipeptidica: Le proteasi catalizzano l’idrolisi dei legami peptidici, alcuni enzimi rompono solo legami peptidici adiacenti a specifici residui amminoacidici.
• Ordinamento dei frammenti peptidici: Viene effettuato tramite la rottura di un altro frammento del polipeptide originario. A questo punto si ha un confronto per sovrapposizione tra i frammenti della prima e della seconda serie, così da determinare l’ordine esatto.
• Localizzazione dei ponti disolfuro: Se erano presenti, bisogna trovare la loro corretta posizione. Lo si fa tramite confronto tra i peptidi generati dall’azione della tripsina e quelli generati da un altro reagente senza effettuare prima la rottura dei ponti disolfuro. La maggior parte delle proteine viene oggi sequenziata per metodo indiretto, inoltre si può dedurre la sequenza di un polipeptide determinando la sequenza del gene che lo codifica.

Proteoma: Patrimonio proteico.

Vi sono 3 metodi chimici per ottenere un peptide:

• Purificazione partendo da tessuto
• Ingegneria genetica
• Sintesi chimica diretta

Esistono famiglie proteiche basate sulle somiglianze delle strutture e delle funzioni. L’amminoacido istidina è l’unico ad avere pKa vicino al pH fisiologico, per questo funge da scambiatore di protoni nella catalisi acido-base.

Capitolo 4: Struttura tridimensionale delle proteine

• Conformazione: Disposizione spaziale degli atomi di una proteina senza rottura di legami covalenti, per rotazione intorno ai legami singoli. Le conformazioni che la proteina assume sono quelle termodinamicamente più stabili, cioè quelle con più bassa energia libera di Gibbs (G) e in questo caso si parla di proteine native.
• Stabilità: Tendenza a mantenere la conformazione nativa. Lo stato non avvolto di una proteina possiede un elevato grado di entropia che tende a mantenere lo stato non avvolto. Le interazioni chimiche, che invece stabilizzano la conformazione nativa sono i ponti disolfuro e le interazioni deboli non covalenti. I ponti disolfuro sono presenti soprattutto nelle proteine dell’ambiente extracellulare. La conformazione più stabile è quella con il maggior numero di interazioni deboli. Le interazioni idrofobiche sono quelle predominanti: quando l’acqua circonda una molecola idrofobica si forma un guscio di molecole di Ossigeno unite da legami H, che prende il nome di strato di solvatazione; l’aumento dell’ordine nelle molecole di acqua nello strato di solvatazione provoca una diminuzione di entropia. Le catene laterali idrofobiche degli amminoacidi tendono a raggrupparsi all’interno delle proteine, lontano dall’acqua. Il rilascio di molecole di acqua, determinato dalle interazioni intramolecolari rappresenta la forza entropica trainante per l’avvolgimento della macromolecola.
• La maggior parte della variazione dell’energia libera che si verifica quando in una proteina si formano interazioni deboli deriva dall’aumento dell’entropia della soluzione acquosa circostante, per effetto dell’ammassamento delle superfici idrofobiche. I legami H svolgono un ruolo importante nel ripiegamento delle proteine. Le interazioni ioniche limitano la flessibilità delle proteine e danno una forma caratteristica. Gli atomi di C α di residui amminoacidici adiacenti sono separati da 3 legami covalenti che si susseguono così: Cα-C-N-Cα. I 6 atomi del gruppo peptidico giacciono sullo stesso piano e l’atomo di O del gruppo carbonilico è in posizione trans rispetto all’atomo di H legato all’azoto ammidico. Lo scheletro della catena peptidica può essere considerato come una serie di piani rigidi in cui i piani consecutivi hanno in comune un punto di rotazione, corrispondente al Cα. La conformazione del peptide è definita da 3 angoli ciechi detti: φ (phi), ψ (psi), ω (omega) che riflettono la rotazione intorno a ciascuno dei 3 legami che si ripetono nello scheletro del peptide. Gli angoli φ e ψ possono avere valori tra -180° e +180°, ma non tutti i valori sono permessi.

Struttura secondaria

• Non tiene conto della conformazione delle catene laterali o della relazione con altri segmenti della proteina. Le principali strutture secondarie sono: α elica e foglietto β.
• α elica: Lo scheletro carbonioso polipeptidico si avvolge strettamente intorno ad un asse immaginario che attraversa longitudinalmente la parte centrale della spirale, mentre i gruppi R sporgono al di fuori dell’elica. L’elica si avvolge in modo destrorso e la disposizione dei legami H è la migliore possibile; sono i legami H che collegano i giri dell’elica.
• L’α elica si trova soprattutto nelle α-cheratine, l’amminoacido Alanina tende più degli altri a formare α eliche. L’α elica può anche generare interazioni tra catene laterali distanti 3/4 residui. In ogni legame peptidico esiste un piccolo dipolo elettrico, questi dipoli si sommano attraverso i legami H presenti nell’elica e il dipolo netto aumenta con la lunghezza dell’elica. Le cariche parziali – e + del dipolo sono sui gruppi N-H e C=O dei legami peptidici. Ci sono quindi 5 restrizioni che compromettono la stabilità dell’α elica:
  1. La propensione intrinseca di un residuo amminoacidico a formare l’α elica
  2. L’interazione tra gruppi R
  3. L’ingombro sterico di gruppi R adiacenti
  4. La presenza di prolina e glicina
  5. Le interazioni tra residui amminoacidici della fine del segmento dell’elica e il dipolo
• β foglietto: Scheletro a zig-zag che in alcuni casi può disporsi accanto ad altri formando una struttura con pieghe, i legami H si formano tra regioni adiacenti delle catene polipeptidiche. I gruppi R sporgono in direzioni opposte. Le catene adiacenti possono essere parallele o antiparallele. Quando 2 o più foglietti β si sovrappongono in una proteina, i gruppi R devono essere piccoli, come nel caso delle β-cheratine.
• L’asimmetria strutturale nelle molecole porta ad un assorbimento della luce piano-polarizzata differente a destra e a sinistra, queste differenze sono indicate con l’espressione spettroscopia in dicroismo circolare (CD). Per le proteine gli spettri vengono effettuati nella lontana regione UV, la regione che assorbe è quella del legame peptidico.

Struttura terziaria e quaternaria

La struttura terziaria tiene conto delle relazioni a lungo raggio nella sequenza amminoacidica nel senso che amminoacidi che si trovano lontani, possono interagire tra loro nella forma completamente avvolta della proteina. La struttura quaternaria invece si trova in quelle proteine costituite da 2 o più catene che si dispongono in strutture 3D. Considerando queste 2 strutture possiamo dividere le proteine in fibrose e globulari: le prime prevedono un unico tipo di struttura secondaria e la terziaria è semplice, le seconde hanno più strutture secondarie. Inoltre, le prime proteggono le cellule dei vertebrati, mentre le seconde sono enzimi o proteine regolatrici.

Proteine fibrose

• Conferiscono resistenza/elasticità. Formate da elementi di struttura secondaria ripetuti. Sono insolubili in acqua a causa della presenza di amminoacidi idrofobici.
  • α-cheratina: Resistenza alla tensione. Si trova nei mammiferi (capelli, corna, unghie, zoccoli ecc.). Le α-cheratine fanno parte delle proteine dei filamenti intermedi. Elica destrorsa. 2 catene di α-cheratina con uguale direzione formano un superavvolgimento sinistrorso (struttura quaternaria). Sono presenti legami crociati, cioè ponti disolfuro che danno stabilità.
  • Collagene: Resistenza alla tensione, si trova nel tessuto connettivo (tendine, cartilagine ecc.). Elica sinistrorsa, ma diversa da α elica. Tre catene α sinistrorse che formano un superavvolgimento destrorso. La sequenza amminoacidica è formata da 3 peptidi ripetuti GLY-X-Y dove X è spesso Prolina e Y 4-Hyp. Triple molecole di collageno formano il tropocollagene. La rigidità e la fragilità del tessuto connettivo degli enzimi derivano da un accumulo di legami crociati nelle fibre di collagene. I legami crociati normalmente uniscono le molecole di collageno in una fibra. Esistono 30 varianti di collagene nei mammiferi.
  • Fibroina della seta: Viene prodotta da ragni e insetti, le catene che la formano hanno conformazione β. Struttura flessibile, molti legami H. La seta non si può allungare perché il foglietto β della fibroina è già del tutto esteso.

Proteine globulari

• Nelle proteine globulari alcuni segmenti della catena polipeptidica si avvolgono gli uni sugli altri creando una struttura più compatta di quella delle proteine fibrose. Queste proteine includono enzimi, immunoglobuline ecc.
• Mioglobina: Lega l’O e lo immagazzina facilitandone la diffusione nei muscoli in rapida contrazione. Nel mezzo presenta il gruppo eme che lega l’O, lo scheletro è costituito da 8 α eliche interrotte da alcuni ripiegamenti (alcuni β), le α eliche sono destrorse. All’interno si trovano i residui R idrofobici. Il gruppo eme è piatto e l’atomo di Fe al centro ha 2 legami: uno si lega al gruppo R di un residuo di His (istidina), e l’altro all’O.

Tutte le proteine globulari hanno forme correlate alle loro funzioni biologiche, hanno tutte forma compatta con le catene laterali idrofobiche all’interno e le catene idrofiliche all’esterno. La stabilità è data da legami H e interazioni ioniche. La struttura 3D è data da α eliche e foglietti β.

Motivo: Formato da 2 o più elementi di struttura secondaria e da elementi di connessione. Esempio: Ansa β – α – β, Barile α/β.

Dominio: Parte di catena stabile, che se staccata, mantiene la sua struttura 3D. In una proteina con molti domini, ognuno può svolgere funzioni diverse. Le strutture delle proteine sono divise in 4 classi: Tutto α, Tutto β, α/β, α+β.

Struttura quaternaria: Una proteina costituita da più subunità è detta anche multimerica, se le subunità sono poche oligomerica. L’unità ripetuta è detta protomero. La prima proteina oligomerica descritta è l’emoglobina: 4 catene polipeptidiche, 4 gruppi eme in cui il Fe è allo stato ferroso Fe²⁺, 2 catene α e 2 catene β.