Appunti di Analisi dei farmaci II

1-IL PROCESSO DI SCOPERTA DEI FARMACI

Nello sviluppo di un farmaco bisogna tenere conto di diversi aspetti: materie prime a uso

farmaceutico con requisiti specifici; intermedi di sintesi; principio attivo ed eccipienti; prodotto

finito (forma farmaceutica). Ricordiamo che il principio attivo è l’ingrediente attivo, ma anche gli

eccipienti quindi le forme non attive devono avere caratteristiche idonee all’uso farmaceutico.

Per la commercializzazione del farmaco è necessario determinare l’identità e la purezza dei materiali

di partenza, degli intermedi di lavorazione, degli eccipienti e del prodotto isolato. Anche le

impurezze devono essere isolate, identificate e quantificate. Poi si valuta il tempo di degradazione

del principio attivo tale e quale e nella forma farmaceutica.

Si parte dalla necessità medica, cioè dalla condizione morbosa/patologica che bisogna curare. A

questo punto bisogna identificare il target da colpire per raggiungere l’azione terapeutica. In alcuni

casi ancora non si conosce il target (come nelle malattie neurodegenerative) quindi bisogna

effettuare diversi studi.

A questo punto si procede con l’identificazione del composto bersaglio “HIT” che viene poi

sviluppato: deve essere riconosciuto dalle cellule e internalizzato. Quando questa molecola viene

ricercata l’importante è che sia attiva, non quanto venga metabolizzata. Per trovare l’hit si procede

con 2 approcci:

• Fenotipico: si usa quando non si conosce il target. Si basa su un modello cellulare fenotipico

che va a mimare la cellula. Quindi si fa lo screening di migliaia di composti fino a trovare

quella attiva;

• Target-based: si parte dal target noto. Il modello ci permette di valutare il target oppure di

valutare l’attività enzimatica: per esempio si valuta la quantità di prodotto rispetto al

consumo di reattivo. Si fa un primo screening a concentrazione fissa, poi si fa un altro

screening per vedere se c’è una correlazione tra le concentrazioni.

Per il processo fenotipico non si conosce il target sul quale si agisce, quindi poi si procede con la

caratterizzazione della molecola, che si può fare con approcci:

• OMICI: con un approccio di proteomica si vanno a identificare le proteine che costituiscono

il proteoma, il DNA e il trascrittoma. Così alla fine si possono costruire dei pattern molecolari;

• CHEMOPROTEOMICA: la molecola viene legata alla fase stazionaria in una cromatografia di

affinità. La difficoltà nel legare una molecola alla fase stazionaria è quella di dover effettuare

gli studi struttura-attività. Poi si fa eluire il lisato cellulare e si separa il target cellulare, quindi

si fanno degli studi per stabilire quale è il target.

A questo punto c’è la fase HIT-TO-LEAD in cui si modifica la molecola trovata per migliorarne le

caratteristiche: selettività (deve legare il target giusto), potenza (deve essere nanomolare) e deve

essere drug-like (quindi deve essere assorbita, distribuita, avere un profilo metabolico e poi essere

escreta in maniera ottimale).

Si procede anche con lo sviluppo del processo: dai grammi fino al chilo (quantità per effettuare le

analisi pre-cliniche e cliniche). Le analisi pre-cliniche e cliniche, la ricerca di un processo di sintesi e

la ricerca tossicologica avvengono in parallelo per risparmiare tempo poiché dopo 20 anni dal

brevetto questo scade, quindi qualunque azienda farmaceutica potrebbe sintetizzare il composto

prima della società ideatrice. Questo spiega anche perché i farmaci biotecnologici arrivano sul

mercato molto più facilmente: se si ha un antigene produrre un anticorpo è relativamente veloce,

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quindi non bisogna preoccuparsi dell’assorbimento né del metabolismo né della tossicità. Quindi

tutta la parte ADME nei farmaci biotecnologici viene saltata.

Lo studio ADME permette di valutare se la sostanza nel tempo degrada e studia la stabilità

metabolica in modelli in vitro. Per stabilizzare una sostanza bisogna conoscerne gli HOT SPOT cioè i

punti che vanno incontro a metabolismo: per trovarli la molecola viene caratterizzata. Un tempo ciò

avveniva purificando il metabolita dalla matrice biologica poi usando l’IR mentre ora si usa la tecnica

liquido-massa, usata sia per analisi quantitative che qualitative.

È importante anche ricordare di validare un metodo di analisi, e per farlo è necessario conoscere:

accuratezza (vicinanza al valore vero), limite di determinazione quantitativa (minima quantità

determinabile quantitativamente, nell’analisi strumentale si intende che il segnale deve essere 10

volte maggiore del rumore di fondo), linearità (intervallo in cui la risposta è proporzionalmente

correlata alla concentrazione di analita) e precisione (ripetibilità e riproducibilità). La ripetibilità è la

capacità di fornire analisi che non differiscano più di un certo valore, mentre la riproducibilità è la

capacità del metodo di dare gli stessi risultati indipendentemente dagli operatori, dal luogo e dal

periodo in cui viene eseguita l’analisi. Una volta ottenuta l’autorizzazione a entrare nel mercato, si

procede con la produzione su larga scala.

In campo analitico si parla oggi di GAC (Chimica Analitica Green) che stabilisce alcune regole e

metodiche da seguire per la progettazione di un nuovo farmaco:

• Utilizzo di tecniche analitiche dirette per evitare un trattamento sul campione;

• Utilizzo di una dimensione minima del campione e un numero minimo di campioni;

• Utilizzo di misure in situ;

• Integrazione di processi e operazioni analitiche per ridurre l’utilizzo di reagenti e risparmiare

energia;

• Utilizzo di metodi automatici e miniaturizzati;

• Evitare o minimizzare la derivatizzazione, la produzione di grandi quantità di rifiuti analitici

e l’utilizzo di reagenti tossici;

• Preferibile l’utilizzo di metodi multi-analitici o multi-parametri;

• Preferibile l’utilizzo di reagenti ottenuti da fonti rinnovabili;

• Aumentare il grado di sicurezza dell’operatore. 2

2-ANALISI ELEMENTARE

Si divide in 2 diversi tipi: qualitativa (determinazione degli elementi presenti in un composto) o

quantitativa (determinazione del contenuto % degli elementi presenti, da cui poi si determina la

formula minima e con il PM la formula molecolare).

Prima di iniziare con l’analisi elementare è importante identificare la natura della sostanza: organica,

metallorganica o inorganica con il metodo del coccio o SAGGIO DI COMBUSTIONE. È un’analisi

qualitativa che prevede la scomposizione della molecola organica nei suoi elementi con una prima

reazione di combustione in un ambiente ossidante. Il carbonio si trasforma in CO , l’azoto in ioni

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cianuro e lo zolfo in ioni solfuro. Poi gli elementi si identificano con reazioni colorimetriche.

Questo saggio viene eseguito al BUNSEN, utilizzando cocci con una concavità in cui si pone una

punta di spatola della sostanza. Più i cocci sono sottili, meglio si diffonde il calore e più efficace sarà

la combustione. Si parte da una fiamma bassa, mista ossidante e riducente, poi la sostanza si riscalda

gradatamente per verificare se avvengono fusione o decomposizione. A poco a poco si passa alla

fiamma ossidante: se la sostanza è organica a questo punto si incendia o carbonizza sviluppando

fumo. È importante che la fiamma sia ossidante: ha un cono azzurro all’esterno e un cono azzurro

più luminoso all’interno; inoltre riscalda a 400-600°C. Il fondo del coccio deve essere posizionato

sulla punta del cono azzurro interno della fiamma, perché questo è il punto più caldo.

I composti organici se sottoposti a riscaldamento bruciano: alcuni fondono poi vanno incontro a

decomposizione o combustione, altri si decompongono direttamente senza fondere. I composti

organici non lasciano residui, oppure lasciano residui neri, lucidi e compatti. Invece i composti

organometallici sottoposti a riscaldamento, dopo aver eliminato la porzione organica, lasciano un

residuo infusibile (sembra cenere). Invece, i composti inorganici rimangono inalterati o al massimo

scoppiettano per liberare acqua di cristallizzazione.

A questo punto si procede con l’analisi elementare: la presenza di C, H e O è data per scontata poi

possono essere presenti anche altri eteroelementi. C e H possono comunque essere evidenziati con

un saggio: si scalda la sostanza con CuO, si raccoglie la CO formatasi e la si fa gorgogliare in idrossido

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di bario. Si osserva la precipitazione di bario carbonato: R-CH -CH -R’ + CuO --> CO ^ + H O^. CO +

2 2 2 2 2

Ba(OH) --> BaCO _.

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RICERCA DEGLI ELEMENTI

Si effettua tramite il SAGGIO DI LASSAIGNE che permette di riconoscere la presenza di N e S nelle

molecole. Consiste nella decomposizione termica della sostanza in presenza di sodio metallico, che

si presenta come un solido burroso con una superficie metallica lucida, splendente e grigia, che

stando all’aria diventa opaca per la formazione di ossido di sodio. Questo saggio fa sì che si verifichi

la mineralizzazione della sostanza.

Una punta di spatola della sostanza viene aggiunta al sodio metallico (asciutto!) in una provetta di

vetro. Questa viene fatta scaldare su fiamma fino a far diventare incandescente il fondo della

provetta. Poi si immerge la provetta in acqua distillata, facendone fuoriuscire il contenuto. Si filtra

e sul filtrato limpido e incolore si cercano gli ioni cianuro e solfuro. 0

Quindi il sodio funge da riducente perché è presente inizialmente come Na poi lo si trova ossidato

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a Na nel prodotto. La soluzione di Lassaigne finale è alcalina perché contiene Na S o NaCN. Nel

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caso in cui ci siano solo gli alogenuri in realtà non si ha un pH veramente alcalino perché gli alogenuri

non danno idrolisi.

È importante che il sodio metallico sia sempre in eccesso per assicurare una mineralizzazione

completa della sostanza.

Verificare la presenza di AZOTO

Aggiungere ferro solfato (FeSO ) alla soluzione di Lassaigne poi scaldare a bagnomaria. Siccome

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l’ambiente è basico c’è precipitazione di Fe(OH) che ha un colore grigio-verde. In realtà però

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precipita anche Fe(OH) perché Fe(II) si ossida spontaneamente all’aria a dare Fe(III). In soluzione ci

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sarà il ferrocianuro di sodio.

Si lascia raffreddare e si acidifica con H SO diluito: gli idrossidi di ferro si ridisciolgono e il

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ferrocianuro reagisce con Fe formando il ferrocianuro ferrico o l’esacianoferrato (II) di ferro (III)

che hanno la tipica colorazione blu di Prussia.

Non si usa HCl per acidificare perché si formerebbe FeCl di colore giallo che farebbe risultare

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verdastro il colore del blu di Prussia, rendendolo difficilmente riconoscibile.

Una colorazione gialla o incolore alla fine dell’esperimento indica assenza di azoto. Il test è positivo

per una colorazione che va dall’azzurro pallido al blu molto intenso: la colorazione dipende dalla

quantità di azoto presente e da quanto è facile la mineralizzazione iniziale della sostanza.

Bisogna anche verificare se l’azoto è organico (nitrato) o inorganico, con la prova dei nitrati. Quindi

la soluzione viene acidificata e si fa reagire con ferro ferroso: si sviluppa ossido di azoto che in

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presenza di Fe dà un complesso di ferro ossido di azoto che si presenta come un anello bruno.

Verificare la presenza di ZOLFO

Aggiungere sodio nitroprussiato alla soluzione di Lassaigne: in presenza di zolfo si assiste allo

sviluppo di una colorazione violacea intensa. Ciò è dovuto alla reazione tra lo zolfo e il sodio

nitroprussiato a dare solfonitroprussiato di sodio.

Quando nella soluzione di Lassaigne sono presenti sia zolfo che azoto, aggiungendo FeSO si osserva

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la formazione di un precipitato nero di FeS. Questo andrà a coprire il colore degli idrossidi di ferro.

Comunque dopo l’aggiunta di H SO il precipitato di FeS si ridiscioglie quindi non si noterà più la

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colorazione nera ma blu (a causa del blu di Prussia causato dall’azoto). Quindi, se durante la ricerca

di azoto si vede la precipitazione di un solido nero, si può subito ipotizzare anche la presenza di

zolfo. 42-

Anche per lo zolfo bisogna capire se è organico (solfato SO ) o inorganico. Il solfato può essere

presente solo come salificante per una base, quindi in presenza anche di azoto: se si è già verificata

l’assenza di azoto è inutile verificare di che tipo sia lo zolfo (sarà sicuramente inorganico). 4

Per verificare in che forma è lo zolfo si lavora sulla sostanza che viene sciolta in acqua: se lo zolfo è

sotto forma di solfato sarà generalmente idrosolubile. Poi si acidifica con HNO o HCl diluiti e si

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aggiunge BaCl : se sono presenti solfati si forma un precipitato bianco di BaSO .

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Verificare la presenza di ALOGENI

La ricerca dei fluoruri viene eseguita sulla soluzione di Lassaigne, che viene acidificata con HCl diluito

poi trattata con alcune gocce di soluzione rossa di zirconio-alizarina 50:50. La decolorazione delle

gocce indica la presenza di fluoruri.

Se azoto e zolfo sono assenti si può verificare la presenza di alogeni direttamente sulla soluzione

basica di Lassaigne. Questa viene acidificata con HNO diluito poi si aggiungono alcune gocce di

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AgNO : si osserva la formazione di un precipitato. Si elimina il surnatante e si effettuano delle prove

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specifiche per il riconoscimento di bromuri/cloruri/ioduri.

Se invece azoto e zolfo sono presenti bisogna effettuare la CALCINAZIONE: la sostanza viene

miscelata con 3 parti di ossido di calcio in una capsula in ambiente anidro. Si scalda la capsula per

circa 10 minuti, si lascia raffreddare poi si aggiunge H O distillata che porterà in soluzione gli alogeni.

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Si filtra e a questo punto si avrà in soluzione il cloro sotto forma di Cl per formazione di CaCl durante

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la calcinazione. Si acidifica con HNO diluito fino a pH=0, si aggiungono alcune gocce di AgNO e si

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nota, in caso di saggio positivo, la formazione di un precipitato bianco. Questo è solubile in

ammoniaca diluita.

Dopo aver solubilizzato il precipitato in ammoniaca, si può riprecipitare con HNO . A questo punto

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bromuri e ioduri si determinano con acqua di cloro che ossida, poi si estrae con un solvente

organico: il bromo vira a giallo mentre lo iodio a viola. Se sono presenti entrambi il viola copre il

giallo e si aggiungerà quindi acqua di cloro per far assumere una colorazione gialla al bromo.

Anche in questo caso bisogna verificare se l’alogeno è organico o ionico, ma solo se nella molecola

sono presenti azoto o zolfo. Infatti se nella molecola azoto e zolfo sono assenti, l’alogeno sarà

sicuramente organico.

Invece se è presente l’azoto, il cloro potrebbe essere ionico. Se è così la sostanza come tale deve

risultare idrosolubile, perché sarà un sale cloridrato o di ammonio quaternario: se nelle prove di

solubilità la sostanza non si scioglie in H O, il cloro non sarà ionico. Per verificare la ionicità si scioglie

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la sostanza in acqua, si acidifica con HNO e si aggiunge AgNO : se il cloro è presente in forma ionica

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precipita AgCl bianco. È possibile che durante l’aggiunta di HNO si verifichi la precipitazione del

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nitrato della sostanza organica che rende torbida la soluzione, quindi bisogna filtrare e fare la ricerca

del cloro nel filtrato.

Se sono presenti 2 alogeni contemporaneamente quasi sempre uno dei due alogeni è cloro ionico:

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è presente come Cl perché fa da controione di un ammonio quaternario, oppure è presente come

+

cloridrato. In quest’ultimo caso si ha uno spostamento di un H sul gruppo amminico della sostanza,

quindi quando si va a modificare il pH cambia lo stato della protonazione. L’azoto del gruppo

amminico rimarrà protonato solo a pH acido e a pH neutro, mentre si deprotonerà a pH basico.

Bisogna comunque ricordare che bromo e iodio non sono MAI presenti contemporaneamente e lo

iodio è presente solo nelle sostanze azotate e non è MAI ionico. 5

Verificare la presenza di FOSFORO E ARSENICO

viene effettuata in una capsula una calcinazione con un eccesso di miscela ossidante (miscela 1:1 di

KNO e Na CO ). Così fosforo e arsenico si trasformano in composti inorganici: fosforo in acido

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fosforico e arsenico in acido arsenico. Dopo aver scaldato si aggiunge una quantità doppia di miscela

magnesiaca (cloruro di magnesio e ammoniaca): se è presente il fosfato si forma fosfato ammonico

che viene fatto precipitare con AgNO . Poi si filtra e si lava goccia a goccia con H O fino a eliminare

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l’odore di ammoniaca. Così si forma fosfato di argento che ha colorazione gialla.

Tra le sostanze metallorganiche, l’unica contenente fosforo è il calcio glicerofosfato, un glicerolo

esterificato con l’acido fosforico. Quindi il fosforo è legato covalentemente allo scheletro

tricarbonioso del glicerolo: un gruppo OH del fosfato forma l’estere organico con il glicerolo, mentre

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gli altri due OH formano il sale con Ca . Per questo è necessario eseguire la calcinazione.

Verificare la presenza di METALLI

Per alcuni metalli è possibile effettuare il SAGGIO ALLA FIAMMA: quindi si immerge il filo di nichel-

cromo ben pulito (non deve dare alcuna colorazione alla fiamma) in HCl concentrato, poi portarlo

all’estremità della sostanza da esaminare così che vi aderisca una piccola quantità. Portare il filo

nella fiamma ossidante e osservare la colorazione che assume la fiamma: sodio giallo; potassio

violetto; bario verde pallido; calcio rosso-mattone; rame azzurro-verde; litio rosso carminio. Il calcio

dà un residuo sul coccio poco visibile alla fiamma quindi è meglio proceder