Appunti di Analisi dei farmaci II

HPAE-PAD: High-performance anion exchange chromatography with Pulsedamperometric detection

HPAE-PAD is another innovative technique. The electrolytic eluent generator produces the mobile phase based on hydroxide (NaOH) with concentrations >0.1M. Under these conditions, carbohydrates are in the anionic form. The separation column contains a strong stationary phase, which is an anion exchange resin. A gradient of acetate ions is used as the eluent. The reduced analysis time prevents epimerization for mono and disaccharides, while oligosaccharides undergo up to 15% epimerization because they are more retained. The amperometric detector applies a series of potentials to the electrode with selective oxidation of carbohydrates.

This technique allows for non-derivatization, has limited detection limits, provides linear detection, and is highly specific for carbohydrates. However, since

ogni zucchero dà un segnale diverso, bisogna fare le curve di calibrazione per avere dei risultati quantitativi.
ELETTROFORESI CAPILLARE (CE) è considerata la più recente delle tecniche separative ed è l'evoluzione strumentale della gelelettroforesi. Ricordiamo che l'elettroforesi è la migrazione differenziale di specie ioniche in soluzione per effetto di un campo elettrico: la separazione avviene perché gli ioni si muovono con velocità di migrazioni diverse in base alla loro carica e massa. In soluzione libera, per effetto dei moti convettivi conseguenti a diffusione termica, si verifica un rapido rimescolamento che impedisce la separazione degli ioni in bande: si usa quindi un gel (poliacrilamide o agarosio) per ridurre i fenomeni convettivi. L'elettroforesi su gel ha però bassa efficienza, tempi lunghi e basse differenze di potenziale applicabile perché il gel agisce come resistenza elettrica. La CE rispetto alla

cromatografia liquida è più efficiente, consuma volumi minori e ha un ridotto costo della fase mobile. Se la separazione avviene in un tubo capillare con diametro interno inferiore a 100 µm, ci sono microproprietà anti-convettive perché ci sono forti campi elettrici senza sviluppo di calore, quindi avviene la separazione degli ioni in bande. Il tubo è costituito da silice fusa con lunghezza 20-100 cm e solitamente è termostatato. Le estremità del capillare sono immerse nella stessa soluzione che riempie il capillare ed è contenuta in 2 recipienti: in uno è inserito l'anodo, nell'altro il catodo. Il generatore è a corrente continua estabilisce differenze di potenziale di 0-30 kV. Per inserire il tampone nel capillare si esercita una pressione con un gas come l'azoto sullo spazio di testa del recipiente di riserva, chiuso da un tappo a tenuta. Tra i tamponi più usati ricordiamo fosfato, citrato, succinato.

dalla carica e dalla dimensione delle molecole. Durante l'elettroforesi, le molecole si separano in base alle loro caratteristiche elettroforetiche, creando un profilo di picchi sull'elettroferogramma. L'uso di un rivelatore UV-visibile consente di rilevare molecole che assorbono la luce nella regione UV o visibile dello spettro elettromagnetico. Questo tipo di rivelatore è particolarmente utile per analizzare composti organici e inorganici. La fluorimetria, invece, sfrutta la capacità di alcune molecole di emettere luce fluorescente quando vengono eccitate da una radiazione luminosa. Questo tipo di rivelatore è molto sensibile e può essere utilizzato per analizzare molecole a bassa concentrazione. Infine, l'utilizzo di uno spettrometro di massa (MS) consente di identificare e quantificare le molecole in base alla loro massa e carica. Questo tipo di rivelatore è molto potente e può essere utilizzato per analizzare una vasta gamma di composti. In conclusione, l'elettroforesi è una tecnica analitica versatile che permette la separazione e l'analisi di molecole in base alle loro caratteristiche elettroforetiche. L'uso di diversi tipi di rivelatori consente di ottenere informazioni dettagliate sulle molecole analizzate.dal rapporto carica/massa. Applicando il potenziale a un capillare riempito con un tampone, il tampone si sposta con flusso regolare e continuo verso il catodo. Il doppio strato elettrico genera una differenza di potenziale (POTENZIALE ZETA) quindi i cationi vengono attratti al catodo trascinando per effetto dell'asolvatazione le molecole di acqua. La velocità di migrazione data da EOF (flusso elettro-osmotico) si misura calcolando la velocità di una molecola neutra: v = (μ * ε) / η con il potenziale Z, la costante dielettrica ε, la viscosità η del tampone. Dato che il potenziale Z dipende dalle cariche della superficie interna, dipende anche dal pH. Il movimento del liquido per effetto del flusso elettro-osmotico ha un profilo piatto, il che è un vantaggio rispetto al flusso laminare. Il flusso EOF si sovrappone alla migrazione elettroforetica degli analiti carichi. Per i cationi la velocità di migrazione

è data dalla somma della velocità elettroforetica più quella EOF: la loro separazione si basa sul diverso rapporto carica/massa. Si dice mobilità apparente la somma della mobilità EOF e della mobilità intrinseca di una specie migrante ionica. Le molecole neutre sono prive di mobilità elettroforetica, migrano tutte con la stessa velocità per mobilità EOF e hanno velocità inferiore a ioni cationi. Gli anioni migrano all’anodo ma se la mobilità EOF è superiore a quella elettroforetica migreranno al catodo (con velocità inferiore anche alle molecole neutre).

Il controllo del flusso elettro-osmotico dipende da diversi fattori:

• pH: modula la ionizzazione delle cariche dei gruppi silanolici;
• Temperatura: influenza la viscosità del tampone e il potenziale z. L’aumento di temperatura corrisponde a una riduzione di EOF. La temperatura dipende dall’intensità del

campoelettrico;

• Solventi (CH CN, MeOH): variano in misura variabile in potenziale z;
• Capillari rivestiti: varia la carica interna del capillare.

TEMPO DI MIGRAZIONE = costante che identifica un analita da un punto di vista qualitativo, al paridel tempo di ritenzione in HPLC.

VELOCITA' DELLO IONE v = l/tm con l la lunghezza del capillare e tm il tempo impiegato.

MOBILITA' APPARENTE = v/E con E il campo elettrico quindi la differenza di potenziale applicatoµaper unità di lunghezza E = V/L. Quindi risulta = l / (tm * E) = (l * L) / (tm * V). La mobilità apparenteµaè data dalla mobilità effettiva e dall'effetto EOF: = (l * L) / (t * V) e si calcola considerando unµEOF EOFcomposto neutro come DMSO o alcol benzilico.

MOBILITA' EFFETTIVA = – .µ µ µe a EOFEFFICIENZA = definita con piatti teorici (N) e dipende dall'ampiezza del picco e da tm. Dati picchi2stretti e non simmetrici si

preferisce usare l'ampiezza a metà altezza (b): N = 5,54 * (tm/b) .

L'efficienza è influenzata da:

• Diffusione longitudinale: N = (π * E * l) / 2D con D il coefficiente di diffusione dell'analita nel µetampone. Quindi l'efficienza migliora per alti campi elettrici a causa della riduzione del tempo di migrazione, inoltre grandi molecole hanno un ridotto D quindi migliorano l'efficienza;
• Temperatura: il riscaldamento per effetto del passaggio di corrente elettrica riduce l'efficienza. Quindi l'aumento del campo elettrico migliora l'efficienza ma oltre un certo valore si ha effetto opposto per aumento della temperatura;
• Effetto di adsorbimento sulle pareti del capillare: causano perdita di efficienza, soprattutto a pH alcalino dove c'è massima ionizzazione dei gruppi silanolici quindi questo effetto è maggiore. Infatti l'interazione elettrostatica tra l'analita e i gruppi

silanolici induce una variazione di EOF quindi perdita di riproducibilità. Questo effetto è più marcato per analiti ad alta carica e alto PM; - Effetto di eccessivo caricamento: non bisogna superare l'1-2% del volume capillare. Quindi gli analiti si separano perché migrano a velocità diverse. La risposta dipende dall'ampiezza della banda (quindi dalla concentrazione di analita) ma anche dalla velocità di migrazione. A parità di concentrazione, analiti con velocità di migrazione inferiore danno un'area del picco maggiore rispetto ad analiti con velocità di migrazione maggiore. Quindi si calcola l'AREA CORRETTA A = A / tm. - Elettroforesi capillare zonale (CZE): Metodo di separazione più usato. Permette di separare composti ionici in base al rapporto carica/massa (la carica viene regolata dal pH del tampone elettroforetico). I composti neutri si muovono alla velocità di EOF senza separarsi tra

loro (ed è il limite di questo metodo).

Cromatografia elettrocinetica micellare (MEKC)

Metodo di separazione in cui si usa lo stesso strumento della CZE ma varia il tampone elettroforetico: oltre alla soluzione tampone salina contiene un tensioattivo (anionico, cationico o neutro) oltre la sua concentrazione micellare critica. Per esempio il sodio dodecil-solfato che oltre 8mM forma micelle cariche negativamente che per effetto di EOF migrano verso il catodo.

Le micelle migrano lentamente formando una fase pseudo-stazionaria dove le molecole lipofile neutre si ripartiscono con un meccanismo separativo cromatografico.

Viene usata per esempio per separare i componenti dello sciroppo per la tosse con pH=9,2 e mobilità catodica.

Cromatografia elettrocinetica con emulsione (MEEKC)

Variante della MEKC in cui il carrier usato per la fase pseudo-stazionaria è costituito da una micro-emulsione (goccioline lipidiche). La fase lipidica è costituita da n-eptano o n-ottano allo

iche permette anche una MS/MS. La MS/MS consente di selezionare uno specifico ione di interesse e successivamente frammentarlo per ottenere informazioni sulla sua struttura e composizione. La trappola ionica è in grado di intrappolare gli ioni all'interno di un campo elettromagnetico e successivamente rilasciarli per l'analisi. I sistemi ibridi, come il Q-TOF, la trappola-orbitrap e il quadrupolo-orbitrap, combinano diverse tecniche di analisi per ottenere una maggiore sensibilità e risoluzione. DETECTOR MS I detector utilizzati per l'analisi MS sono principalmente il detector a scintillazione, il detector a fotomoltiplicatore e il detector a ionizzazione di campo. Il detector a scintillazione è basato sulla rivelazione della luce emessa da una sostanza radioattiva quando viene colpita dagli ioni. Il detector a fotomoltiplicatore utilizza un fotocatodo per convertire la luce emessa dagli ioni in segnali elettrici. Il detector a ionizzazione di campo utilizza un campo elettrico per ionizzare le molecole e successivamente rilevarle. APPLICAZIONI La tecnica di MS viene utilizzata in diversi settori, tra cui la chimica analitica, la farmaceutica, la biologia e la medicina. Viene utilizzata per l'identificazione e la quantificazione di composti chimici, lo studio delle reazioni chimiche, l'analisi di campioni biologici e la scoperta di nuovi farmaci. La MS è una tecnica molto potente e versatile che permette di ottenere informazioni dettagliate sulla composizione e la struttura delle molecole.