Appunti di analisi dei farmaci

CROMATOGRAMMA

Il cromatogramma è il tracciato del segnale del rivelatore in funzione del tempo o del volume di eluente, a partire dall'istante in cui la miscela viene introdotta nella colonna (t=0). Il PICCO CROMATOGRAFICO è il tracciato completo che si ottiene per ciascuna sostanza eluita: in condizioni ideali ha forma di curva gaussiana che viene descritta dal punto di massimo e dalla distanza tra i punti di flesso. Questa distanza divisa per 2 permette di ottenere la deviazione standard σ. I picchi possono anche avere forma gaussiana asimmetrica, per cui si hanno 2 deformazioni: tailing (tracciato sale bruscamente per scendere lentamente) e fronting (tracciato sale lentamente per scendere rapidamente). Il fattore di asimmetria A = b/a con a e b le distanze della curva dalla verticale tracciate nel punto massimo del picco, misurate in corrispondenza del 10% dell'altezza del picco rispettivamente a sinistra e a destra. In caso di tailing A è <1, nel caso di fronting è >1.

Queste deformazioni possono essere causate dall'introduzione del campione lenta o scorretta, dall'adsorbimento irreversibile della sostanza in fase stazionaria, dal sovraccarico o dalla ridotta solubilità del campione in fase mobile.

Altezza del picco = distanza tra il punto di massimo e la tangente alla linea di base.

Larghezza della base del picco (W) = lunghezza del segmento interpolato all'intersezione tra le tangenti ai flessi della gaussiana e la linea di base. W = b4 .σ

Larghezza a metà altezza del picco: W = 2.354 .σH

Distanza tra i punti di flesso = segmento interpolato tra i due punti di flesso, che corrisponde al 60.7% dell'altezza del picco. W = 2 .σi

Tempo di ritenzione (t) = tempo impiegato da ciascuna sostanza per eluire dalla colonna, che viene misurato dall'istante in cui la miscela viene introdotta nello strumento fino a quando si registra il massimo del picco.

Tempo morto (t) = tempo di ritenzione di una sostanza non

Trattenuta dalla fase stazionaria.

Volume morto (o volume della fase mobile) = volume della colonna non occupato dalla fase stazionaria.

Tempo di ritenzione corretto = tempo che una sostanza impiega per le interazioni con la fase stazionaria. t' = t - t_R

In ogni istante del processo cromatografico le sostanze si distribuiscono tra le 2 fasi in modo specifico. A un tempo t si raggiungerà l'equilibrio in cui C <--> CM. Quindi avremo la costante di distribuzione K = C / C_M. Questa è correlata al volume di ritenzione: V = V_S + K * V_M con V il volume della fase stazionaria.

Sperò, difficile calcolare V quindi si fa riferimento al FATTORE DI RITENZIONE. Ro fattore di capacità k = n.moli / n.moli quindi risulta che Kc = V * k / V e V = RV * (1 + k). Siccome V = t * F, avremo la seguente equazione: t * F = t * F * (1 + k). Che, siccome il flusso è costante, diventa t = t * (1 + k). Quindi avremo che k = Mt' / t_R.

Affinché una separazione sia buona, deve avere fattore di ritenzione della sostanza eluita per prima maggiore di 1 ma inferiore a 10-15. La qualità di una separazione cromatografica, inoltre, dipende dalla selettività e dall'efficienza. La SELETTIVITÀ indica la capacità di un sistema cromatografico di eluire specie chimiche a velocità il più possibili diverse. Viene espressa dal fattore di separazione = t' / t''. Se, però, i picchi sono larghi, α = R2 / R1, questi possono sovrapporsi quindi la selettività non basta per una buona risoluzione cromatografica. Invece, l'EFFICIENZA è la capacità di un sistema cromatografico di eluire tutte le particelle di una specie chimica con la stessa velocità, per formare picchi stretti. Viene calcolata con il numero dei piatti N = (t'' / σ)^2 = 16 (t'' / w)^2. Dalla selettività e dall'efficienza dipende quindi la RISOLUZIONE, che indica

Il grado di separazione dei picchi: R = 2(t - t₀)/(w_s R₂ R₁ + w₀). Nel caso reale di picchi asimmetrici, invece, è R = (t - t₀)/(a + b) con a² R₂ R₁ e b le due semibasi che si affiancano. Il valore minimo di R è 1 (quindi con sovrapposizione dei picchi del 4%), mentre per R = 1.5 la separazione è considerata completa (quindi con sovrapposizione dei picchi dello 0.3%). Per aumentare la risoluzione si può, quindi, aumentare N, aumentare k o aumentare α. Per aumentare k in fasi mobili gassose si varia la temperatura, mentre per fasi mobili liquide si varia la composizione dell'eluente. Conoscendo il numero di piatti, si può calcolare anche l'altezza relativa al piatto teorico H = L/N con L la lunghezza della colonna: una colonna è più efficiente tanto più H è piccolo. Inoltre, l'efficienza di una colonna dipende anche da fattori extra-colonna che non incidono più del 10% e da altri fattori della colonna.

Questi ultimi sono spiegati con il MODELLO DEL NON-EQUILIBRIO di Giddings che individua 4 fattori che partecipano all'allargamento delle bande:

1. Percorsi multipli: nella fase mobile ci sono diversi cammini che può percorrere l'analita, a causa della porosità e dell'impaccamento della fase stazionaria. Quindi le molecole di analita anche se partono insieme percorrono distanze diverse e arrivano al detector in tempi diversi, provocando un allargamento di banda. Per risolvere questo problema bisogna ottenere una distribuzione granulometrica della fase stazionaria molto ristretta;
2. Diffusione molecolare longitudinale: le molecole di sostanza si muovono spontaneamente in direzione longitudinale, sia nel senso della fase mobile sia nel senso opposto. In questo caso l'allargamento di banda dipende dal tempo di permanenza dell'analita nella fase mobile e dalla diffusività del soluto. Per minimizzare questo problema si può aumentare il flusso

della fase mobile;

Distribuzione di flusso: è più veloce al centro piuttosto che vicino alle particelle;

Trasferimento di massa tra le fasi: all'inizio le molecole di analita più vicine alla fase stazionaria diffondono a questa dalla fase mobile, mentre le molecole rimaste nella fase mobile si spostano trascinate dalla corrente dell'eluente e diffondono nella fase stazionaria nel trattisuccessivo. Per ridurre questo processo si usano solventi a bassa viscosità, che aumentano la diffusività dell'analita.

Le variabili che influenzano l'efficienza di una colonna possono essere anche descritte con un modello matematico attraverso la funzione H = f(u) con u la velocità lineare della fase mobile. Questa funzione può essere descritta con un'equazione tipo: y = a + b/x + c*x da cui si ottiene l'equazione di VanDeemter H = A + B/u + C*u:

A è associato ai percorsi multipli e alla distribuzione di flusso:

A = 2*π*d·p con parametro associato alla granulometria e d il diametro medio delle particelle. Per minimizzare A bisogna ridurre il d e aumentare l'uniformità delle particelle;

B è associato alla diffusione molecolare longitudinale: B = 2*π*γ·M con γ fattore di tortuosità e D il coefficiente di diffusione del soluto nella fase mobile (trascurabile in HPLC). Per minimizzare B bisogna ridurre o D o γ aumentare u;

C è associato alla resistenza al trasferimento di massa: C = C_s + C_m con C_s il contributo del trasferimento nella fase stazionaria e C_m in quella mobile. Inoltre, C = (q*k*d)/(D*(1+k)) con q la costante di uniformità delle particelle in fase stazionaria, d lo spessore massimo in fase stazionaria e D il coefficiente di diffusione. Invece, C = (ω*p^2)/(D*M^2).

HPLC (cromatografia liquida ad alta prestazione) è l'evoluzione strumentale ad alta efficienza della cromatografia liquida su colonna.

Si basa sulla diminuzione del diametro delle particelle di impaccamento, che aumenta l'efficienza e la resistenza e abbassa il flusso di percolazione. Quindi c'è la necessità di aumentare la pressione per forzare il solvente attraverso l'impaccamento costituito da particelle fini. Le tecniche HPLC vengono divise in 2 metodi che comprendono le diverse cromatografie: A fase diretta: 1° metodo, con fase stazionaria idrofila e fase mobile lipofila. Utilizzata con analiti a MM<2000 solubili in H2O non ionici (la fase stazionaria consigliata è ciano o ammino); Inversa: 1° metodo, con fase stazionaria lipofila e fase mobile idrofila. Utilizzata con analiti a MM<2000 solubili in solventi organici polari o debolmente polari (la fase stazionaria consigliata è C18, C8, C4, C2, fenile o ciano) o mediamente polari come alcol, acetonitrile o acetato di etile (la fase stazionaria consigliata è ciano, ammino o diolo), maanchecon analiti a MM>2000 solubili in solventi organici e di dimensioni <30nm(la fase stazionaria consigliata è C18, C8 o C4) o solubili in H2O non ionici di dimensioni <30nm (la fase stazionaria consigliata è C18, C8, C4, resina polifenilica o polietere) Adsorbimento liquido-solido: 2° metodo. Utilizzata con analiti a MM<2000 solubili in solventi organici moderatamente polari come CHCl3 (la fase stazionaria consigliata è la silice); Ripartizione liquido-liquido: 2° metodo; Esclusione: 2° metodo. Utilizzata con analiti a MM>2000 solubili in H2O non ionici oppure solubili in solventi organici di dimensioni comprese tra 30 e 400nm; Scambio ionico: 2° metodo. Utilizzata con analiti solubili in H2O ionici; Affinità: 2° metodo. STRUMENTI E MATERIALI Come fase stazionaria vengono utilizzate solitamente particelle microporose esferiche di silice, tranne quando il pH è >12 perché la silicesi scioglie. I gruppi silanolici possono essere geminali non acidi, vicinali non acidi, o liberamente mediamente acidi. Questi ultimi a pH 2-3 sono completamente protonati, e a pH>3 si dissociano in gruppi Si-O che trattengono fortemente i composti basici. La silice esterificata, però, è suscettibile di idrolisi quindi non si può usare per fasi acquose o alcol. Invece, le fasi più stabili sono quelle con formula Si-O-Si-R che presenta un legame silossanico. Questo può essere idrolizzato da fasi mobili acide con pH<2: in questo caso il prodotto della reazione è un acido silicico.