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S Mf2 2C è il contributo del trasferimento nella fase stazionaria e C in quella mobile. Cs=qkd /(1+k) *DS M sQ è la costante di uniformità delle particelle della fase stazionaria; k è il fattore di ritenzione; d è lo spessore massimo della fase stazionaria; D è il coefficiente di diffusione. Cm= omega*d /D .s mDall’equazione di Van Deemter si devono ottimizzare il flusso della fase mobile per via sperimentale, le caratteristiche fisiche della fase mobile ed il diametro delle particelle della fase stazionaria in quanto devono essere uniformi e con un diametro ridotto. In GC è importante che la fase gassosa abbia un’elevata densità.
LA RISOLUZIONE
La risoluzione indica il grado di separazione dei picchi edipende dalla selettività ed efficienza. In termini matematici la risoluzione tra due picchi adiacenti (Rs) è espressa dal rapporto fra le loro distanze e la semisomma delle rispettive larghezze alla base.
=t -t /(w +w /2). Nel caso reale dis R2 R1 1 2picchi asimmetrici, l'equazione deve essere modificataponendo al denominatore la somma dei segmenti a e b,ovvero le due semibasi che si affiancano. R =t -t /(a+b). IlS R2 R1valore minimo di R è di 1 (sovrapposizione dei picchi del 4%).sPer R =1,5 (sovrapposizione dello 0,3%) la separazione èSconsiderata completa. La risoluzione fra due picchi può anche essere posta inrelazione con il numero di piatti teorici (N), con la selettività (alfa) e con il fattoredi ritenzione (k).N2 e k2 si riferiscono al secondo picco. Per aumentare la risoluzione si puòaumentare N, diminuire il fattore di ritenzione k (per fasi mobili gassose si varia laT, per quelle liquide la composizione dell'eluente), aumentare la selettività alfa.La variazione dei due parametri precedenti non è sufficiente nel caso in cuialfa=1. In tale caso si variano diversi parametri, tra cui la fase stazionaria, la fase mobile
e il tracciato scende bruscamente per salire lentamente. Queste asimmetrie possono essere causate da diversi fattori, come la presenza di impurità nella fase mobile o nella fase stazionaria, la presenza di interazioni tra il soluto e la fase stazionaria, o problemi di flusso nella colonna cromatografica. Per risolvere il problema dell'eluzione e dell'asimmetria dei picchi, è possibile adottare diverse strategie. Una soluzione potrebbe essere variare la fase mobile in modo da rendere più affine il soluto con la fase stazionaria. Inoltre, è possibile lavorare in gradiente di concentrazione, ovvero variare la composizione della fase mobile durante l'eluzione. In alternativa, si può lavorare con una condizione isoterma o programmare la temperatura in GC per ottenere variazioni. È importante notare che i picchi cromatografici possono presentare una forma gaussiana non simmetrica. Possono verificarsi due tipi di deformazioni: il tailing, in cui il picco sale bruscamente per scendere lentamente, e il fronting, in cui il picco scende bruscamente per salire lentamente. Queste asimmetrie possono essere causate da diversi fattori, come impurità nella fase mobile o stazionaria, interazioni tra il soluto e la fase stazionaria o problemi di flusso nella colonna cromatografica.Il tracciato sale lentamente e scende rapidamente. Le cause di fronting e tailing possono essere ricondotte all'introduzione del campione lenta o comunque scorretta, all'adsorbimento irreversibile della sostanza nella fase stazionaria, al sovraccarico e ad una ridotta solubilità del campione nella fase mobile. Il fattore di simmetria viene espresso dal fattore o rapporto di simmetria A = b/a dove b e a sono le distanze della curva S dalla verticale tracciata nel punto di massimo del picco, misurate in corrispondenza del 10% dell'altezza del picco, rispettivamente a sinistra e destra del punto massimo. Nel caso di tailing A < 1 mentre nel caso di fronting A > 1.
La cromatografia liquida ad alta prestazione si sviluppò negli anni 60 al fine di analizzare molecole non idonee all'analisi GC. L'HPLC è l'evoluzione strumentale ad alta efficienza della cromatografia liquida su colonna. La diminuzione
del diametro delle particelle di impaccamento porta ad un aumento dell'efficienza, della resistenza e ad una diminuzione del flusso di percolazione. Da questo si ha la necessità di aumentare la pressione per forzare il solvente attraverso l'impaccamento costituito da particelle fini. Il picco deve fluire in circa un minuto. Il diametro impatta molto sul numero dei piatti teorici. Per questo è un fattore molto influente sull'efficienza. L'HPLC è solitamente accoppiato ad un detector UV. L'accoppiamento con la massa è il migliore in quanto consente di aumentare sensibilità e selettività. Il detector monitora l'eluizione. Solitamente sono presenti due pompe che permettono l'eluizione secondo gradiente. La classificazione delle tecniche HPLC comprende due tipologie. Il primo metodo presenta una cromatografia normale o fase diretta (fase stazionaria idrofila ad adsorbimento; fase mobile lipofila) e una cromatografia aper le fasi legate. La silice esterificata è suscettibile all'idrolisi e non può essere utilizzata per fasi acquose o alcoli. Le fasi più stabili sono di formula Si-O-Si-R. La silice può essere funzionalizzata con diversi gruppi appropriati per cromatografia a scambio ionico, ripartizione... Fasi mobili acide con pH<2 tendono ad idrolizzare i legami silossanici. Il problema si risolve inserendo sostituenti ingombranti come l'isobutile. La silice può essere formata da una sostanza usata tal quale come fase stazionaria per la cromatografia di adsorbimento o essere costituita da un supporto con al di sopra la fase stazionaria vera e propria della ripartizione.
LA FASE MOBILE
La scelta della fase mobile dipende dalla fase stazionaria. Si usa una fase mobile lipofila in cromatografia normale e una polare/mediamente polare in fase inversa. Tra i requisiti generali di una fase mobile troviamo una bassa viscosità, l'immiscibilità
con la fase stazionaria, la capacità di solubilizzare il campione, la compatibilità con il rivelatore, la bassa corrosività, bassa volatilità, basso costo ed elevata purezza. La forza (ε) è il parametro che definisce la forza di eluizione del solvente quando usato come fase mobile sul gel di silice. La viscosità deve essere inferiore a 1.30. Se uso un detector UV la fase mobile non deve assorbire nel range di lunghezze d'onda d'interesse. Con l'UV si usa un cutoff più basso possibile per poter analizzare più molecole possibili. Se uso i 200 nm per identificare composti C-H-O non utilizzo come fase mobile il metanolo perché assorbe a questo livello. Posso usare l'acetonitrile che è la fase mobile più utilizzata anche perché è altobollente. La purezza deve essere elevata soprattutto quando l'HPLC è accoppiato ad uno spettrometro di massa. La fase mobile.può essere rappresentata da un unico solvente o da una miscela di solventi. La composizione può essere costante nel tempo (eluizione isocratica) o variabile (gradiente). Per la scelta della fase mobile è importante valutare l'UV cutoff in quanto si può presentare nello spettro UV. Una diluizione variabile permette di separare in modo migliore picchi che tendono a sovrapporsi. Si fanno delle analisi sequenziali per ottenere la migliore risoluzione possibile. FATTORI STRUMENTALI CHE CONTROLLANO LA VELOCITÀ DI ELUIZIONE Eluizione di composti neutri: Il tempo di eluizione di un composto neutro è determinato dal bilancio tra la sua polarità e la sua lipofilia. Il pH della fase mobile non esercita alcun effetto. Nel caso della cromatografia a fase inversa, quanto più un composto è lipofilo, tanto più è trattenuto. Si ha la situazione opposta nel caso della cromatografia a fase diretta. Eluizione di compostiionizzabili: Nell'eluizione di composti ionizzabili è necessaria una fase mobile tamponata per ottenere gli analiti in forma completamente indissociata (cromatografia di ripartizione) o dissociata (cromatografia a scambio ionico). Se il pH è uguale al pKa vuol dire che la concentrazione della forma dissociata e di quella indissociata sono uguali e quindi avrò due picchi perché le due forme hanno lipofilia diversa e di conseguenza tempi di ritenzione diversi. Nel caso di analiti acidi il pH deve essere almeno di due unità inferiori alla pKa per avere l'analita in forma completamente indissociata. Nel caso di composti basici il pH deve essere maggiore di due unità rispetto alla pKa.
METODI HPLC E TIPI DI COLONNE
Le colonne tradizionali hanno un diametro di 3-5mm e hanno una lunghezza di 10-20cm con particelle grandi 3-5*10 m. I tempi di analisi sono di circa 20 minuti con un flusso di 1 ml al minuto. Non si hanno picchi più larghi di 1 minuto.
Ci sono colonne che permettono di fare analisi veloci, aumentare la risoluzione e incrementare la sensibilità. Sono le colonne monolitiche e le nano-colonne. Le colonne monolitiche consistono in un singolo pezzo di polimero organico o silice con un flusso attraverso macro-pori. Permettono di avere una contropressione molto bassa grazie alla alta permeabilità. I macro-pori permettono di utilizzare un flusso 10 volte più grande rispetto alle colonne con particelle grandi micron. Permettono di ridurre il tempo di analisi di 10 volte senza dare una riduzione della risoluzione. Sono stati sviluppati dei metodi più performanti che prendono il nome di ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC). Riducendo il diametro delle particelle si ha un aumento dell'efficienza per l'equazione. Il sistema UHPLC è molto più costoso e supporta una contropressione molto elevata. Le nano-colonne sono...
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