Appunti del corso di Biochimica per le Biotecnologie

INTERATTOMA SU LARGA SCALA

Il concetto è quello di costruire una matrice 6000x6000 in cui abbiamo fusi tutte le ORF dei geni di un

organismo legate a BD e AD, sulle diagonali abbiamo il rapporto del prodotto genico con sé stesso, poi vi

sono interazioni crociate dove due proteine sono una volta legate ad AD e BD e successivamente sono

scambiate.

Andiamo a fondere ad AD e BD l'intera ORF ovvero l'intera area codificante della proteina.

Il vantaggio è che per ogni proteina mi basta un'unica fusione (una con AD e una co BD), è un’interazione

tra proteine intere che è quindi più fisiologica, ma a causa dell'ingombro alcune aree possono essere rese

meno accessibili.

All’interno di una cellula l'interazione è modulata da eventi post-traduzionali che riarrangiano alla struttura

della proteina (attivatore allosterico, fosforilazione…), questi attivatori potrebbero non essere presenti.

Questo sistema è ragionevolmente efficace, vi è comunque il problema che le proteine intere potrebbero

non essere la fonte migliore per identificare l'interazione.

Un secondo approccio potrebbe essere di costruire delle fusioni dove il frammento fuso non è l'intera ORF,

ma un frammento più piccola (100-150 aa), questo vuol dire che per proteine molto grandi è necessario

avere fusioni diverse, il DNA viene tagliato in modo casuale e si generano molte varianti in questo modo si

può identificare delle interazioni che potrebbero essere perse. Tuttavia, il numero di interazioni da testare

sono molto di più.

HIGH-TROUGHPUT

Un secondo approccio sia partendo da ORF intere che da frammenti di ORF si può basare sulla possibilità di

identificare dopo la trasformazione quali coppie danno un segnale positivo.

Ho fatto un approccio di tipo casuale quindi non so da quale questo segnale positivo derivi, si estrae il DNA

e si analizza in modo da identificare in modo sicuro il gene.

Quelle che non vengono identificate vengono considerate interazioni negative, potrebbe anche dipendere

dal fatto che quella particolare interazione non si sia mai verificata.

l'uso di frammenti piccoli rende più probabilmente accessibili i siti di interazione, potremmo rendere

interagibili frammenti che normalmente sono coperti (falso positivo), i frammenti potrebbero non

assumere la struttura 3D corretta e quindi rendere impossibile l'interazione.

Qualsiasi sistema di screening soprattutto se sono ad alta processività ha delle intrinseche problematiche

che risultano nella presenza di errori.

PULL-DOWN PROTEOMICS

Questo sistema si basa su un principio diverso, è un sistema che identifica delle interazioni in condizioni

fisiologiche.

l'interazione si deve svolgere all'interno dell'ospite da cui derivano le proteine da testare.

Si analizzano le interazioni in particolari condizioni.

1. Costruire dei ceppi in cui una proteina alla volta viene marcata con un TAG necessaria per la

purificazione e questo TAG deve essere lo stesso per tutte le proteine

2. l'analisi si basa sul principio di usare una colonna di affinità in modo che leghi il TAG, questa

purificazione avviene condizioni tali che tutte le proteine interagenti con la proteina legata alla

colonna rimangano in complesso.

3. Quando vado ad eluire trovo una famiglia di proteine che sono in grado di interagire direttamente

o indirettamente con la proteina di interesse.

4. Per fare l'esperimento su scala genomica bisogna ingegnerizzare l'organismo poiché non vi sono

anticorpi per tutte le proteine.

5. Se si usano anticorpi questi potrebbero essere diretti in un sito di interazione, il TAG invece viene

posto in coda alla proteina con uno spaziatore in modo che non interferisca con la struttura 3D

Questa purificazione premette di ottenere proteine in condizioni native.

Queste proteine per il momento sono ignote, vanno identificate quindi la parte a valle del saggio è molto

complicata.

Il sequenziamento di un numero elevato di proteine è molto complesso.

Ogni proteina è frammentata in peptidi e ciascuno è passato in spettrometria e questo ci permette

 di avere la sequenza dei peptidi, sulla base di questa informazione siamo in grado di assegnare un

nome alle proteine. Le proteine da 2 a 5 sono quelle che interagiscono con la proteina esca

contenente il TAG (proteina 1)

l'analisi bioinformatica dei dati di spettrometria consente di assegnare

un’identità alle proteine.

All'interno del pool di proteine vi sono proteine che interagiscono sia

direttamente (5,4,2) sia proteine che interagiscono indirettamente (3). La

proteina 3 non sarebbe stata identificata nel saggio dei due ibridi.

Comparazione dei dati ottenuti da due gruppi (rosso e blu) nel caso di

due tipo differenti di saggio.

I diagrammi contengono le proteine identificate da ogni gruppo e quelle

individuate da entrambi.

DATABASE

Prendono i dati dai singoli esperimenti e li mettono insieme in modo ragionato in modo da avere un certo

consenso dell'interattoma. Questo processo si basa anche su algoritmi.

Vi è una componente umana che fa sì che ogni database sia diverso da un altro, quindi si ottengono

interattomi che combaciano solo parzialmente.

Bisogna fare una estrazione di una sottorete in modo da snellire tramite un filtro tutti gli archi presenti in

un interattoma in modo da mantenere solo quelli di nostro interesse.

ORMONE DELLA CRESCITA UMANO.

È una coppia di proteine che è stata studiata molto in termini dell'efficienza dell'interazione.

Se stiamo studiando l'interazione tra due proteine sapendo gli strumenti a nostra disposizione possiamo

avere un approccio generale di come operare, dobbiamo capire come in funzione della conoscenza a priori

possiamo fare degli esperimenti utili.

l'ormone della crescita è l'ormone responsabile della crescita, l'ormone della crescita è necessario per

attuare il potenziale di crescita insto nel nostro genoma.

Una deficienza dell'ormone della crescita può essere identificata e ovviata riuscendo ad arrivare al massimo

della crescita.

Viceversa, una esagerata produzione di ormone della crescita fa si che essi sviluppino una corporatura

eccessivamente grosso, lo sviluppo è aumentato in maniera non controllata, questo può avere un impatto

forte sulla qualità della vita.

l'ormone della crescita è stato uno dei primi ormoni prodotti per DNA ricombinante

Somministrazione per ovviare alla carenza

 Studio per consentire di identificare molecole antagoniste per bloccarne la produzione



È stato il primo lavoro che si è occupato dell'interazione di 2 proteine.

Prima di questo studio l'unica fonte utilizzabile di ormone della crescita era l'estrazione dall'ipofisi dei

cadaveri. Alcune delle preparazioni erano state ottenute da soggetti affetti da prioni e quindi vi è stato un

contagio nei pazienti a cui era stato somministrato.

l'ormone della crescita è prodotto nell'ipofisi ed è controllato da circuiti inibitori ed attivatori, la produzione

è mantenuta anche in età adulta. Dato che uno degli effetti è di stimolare la massa muscolare è stato a

lungo usato come doping.

La porzione di recettore extracellulare del recettore forma un ponte interagendo con l'ormone della

crescita che collega due recettori, questo è quello che innesca la trasduzione del segnale.

Il primo studio che è stato condotto è stato fatto quando dell'ormone della crescita e del suo recettore si

sapeva poco.

Hgh

 Prolattina umana

 Pgh ormone della crescita porcino

 Hprl



Sono proteine molto simili

Pur avendo una struttura primaria molto simile l'ormone umano e quello porcino non sono in grado di

funzionare su ospiti scambiati.

Per l'incapacità di azione di ormoni da fonte animale si è dovuto sfruttare l'ormone di cadaveri.

Queste 4 proteine sono abbastanza simili, ma non identiche.

Gli autori hanno pensato di interscambiare dei frammenti tra una specie e l'altra.

In ognuna delle zone (A-F) vi sono un certo numero di differenze tra l'ormone umano e le altre proteine.

l'effetto che ottengo sostituendo i frammenti A dell'ormone della crescita umano con quello porcino

inserisco tutte le varianti amminoacidiche dentro l'ormone umano. Questa è una delle strategie di

mutagenesi, l'unico modo presente ai tempi era l'utilizzo di enzimi di restrizione, è per quello che queste

zone sono di lunghezze variabili.

Vogliono valutate l'efficacia, la forza e la specificità dell'ormone della crescita e le sue varianti nei confronti

del recettore per l'ormone della crescita in modo da identificare le porzioni importanti.

Hanno valutato la costante di dissociazione termodinamica tra l'ormone della crescita e il suo recettore,

hanno usato la porzione extracellulare del recettore che può essere espressa come proteina solubili in E.

Coli.

La Kd è il rapporto tra Koff e Kon che sono le costanti cinetiche di formazione e dissociazione del complesso

ormone recettore.

Hanno poi confrontato al Kd del mutante e quella del wt.

Nessuna delle mutazioni introdotte ha un effetto migliorativo, hanno sempre comunque peggiorato il

legame, vi è un'unica eccezione dove la kd passa a 0,29.

Tentarono di mappare la posizione delle mutazioni introdotte:

Hanno utilizzato la struttura dell'ormone della crescita del maiale poiché era l'unica conosciuta, la struttura

è approssimabile a quella dell'ormone umano poiché variano solo di pochi aa.

Nel grafico si vede l'effetto biochimico delle interazioni,

sull'asse delle x vi è il numero di residui, sull'asse delle y si ha

il rapporto tra la Kd del mutante e la Kd del wt.

La larghezza della colonna indica la grandezza del frammento.

Le colorazioni diverse indicano la provenienza del

frammento.

La grandezza dell'effetto è indicata dall'altezza della banda.

Tutto quello che è sopra 1 è un peggioramento, mentre ciò

che è sotto 1 è un miglioramento (solo 1 caso).

Da questa analisi abbiamo identificato le aree più importanti

per il legame che sono le aree in C e in F che sono quelle che quando vengono cambiate danno effetti più

significativi.

La struttura dell'ormone è fatta da 4 eliche interconnesse da anse non strutturate.

Questo primo approccio è un approccio a bassa risoluzione poiché abbiamo utilizzato un numero limitato di

frammenti e siamo partiti da poche varianti diverse, se avessimo a disposizione un numero più elevato di

varianti e potessimo fare delle frammentazioni più piccole ci troveremmo a fare un esperimento con

campionamento più ampia.