Appunti del corso di Biochimica per le Biotecnologie

Trasduzione del segnale

Indica una serie di fenomeni con i quali la cellula si collega con l'esterno. La cellula capta il segnale e lo converte in una risposta adeguata. Le cellule sono dei detector che sentono e interpretano le informazioni costantemente per adattarsi all'ambiente e coordinare attività che circondano la cellula.

Tipi di segnali

I segnali possono indicare:

• T, luce, pH, forza ionica, pressione
• Disponibilità di ossigeno, nutrienti, fattori proliferativi e antiproliferativi
• Presenza di competitori, partners, predatori o prede, agenti infettivi
• Stato del genoma

Risposta della cellula

Una cellula può rispondere ai segnali attraverso:

• Cambiamento dei geni che trascrive —> cambiamento che richiede tempo e investimento energetico
• Alterazione della superficie cellulare
• Modificando l'attività di enzimi e proteine
• Muovendo materiali tra compartimenti
• Rimodellando il citoscheletro
• Migrando
• Morendo

Comunicazione cellulare

La comunicazione tra le cellule è essenziale per gli organismi multicellulari:

• Giunzioni cellulari (Connessione del citoplasma, per contatto diretto)
• Riconoscimento tra cellule
• Segnalazione cellulare

Tutto quello che è al di fuori di se stessa è l'ambiente —> in un tessuto le altre cellule sono l'ambiente con cui devono interfacciarsi. I sistemi biologici reagiscono in modo coordinato agli stimoli ambientali, le risposte non sono individuali.

Meccanismo di trasduzione del segnale

Le due cellule sono unite tramite due molecole che sono sulle corrispettive superfici cellulari. La molecola che manda il segnale verso l'interno è uno dei componenti essenziali di qualunque sistema di trasduzione —> recettore che capta il segnale. Questa trasmette il segnale a dei sistemi effettori che decodificano il segnale e procedono con l'azione biochimica.

Quando due cellule comunicano, questa comunicazione avviene tramite due molecole: una sulla cellula che invia (messaggero chimico o ligando) e una sulla cellula che riceve il segnale (recettore). I messaggeri possono agire a distanza o nella prossimità. A breve distanza si chiama segnale paracrino. A lunga distanza è un segnale ormonale o endocrino. Esiste un terzo segnale che si chiama autocrino, ovvero la cellula invia e riceve il segnale da se stessa.

Catena di trasduzione

Una catena di trasduzione richiede:

• Segnale
• Recettore coniugato al segnale chimico —> ogni superficie di recettori diversi è diversa
• Inibizione da contatto —> il contatto con le altre cellule dà segnali di stop della proliferazione, è una segnalazione di prossimità.

Tappe della trasduzione

1. Riconoscimento del segnale (Ricezione)
2. Trasduzione —> segnale convertito in un messaggero biochimico
3. Risposta

Ricezione

Le molecole segnale possono essere molto varie, il recettore deve essere complementare alla molecola segnale e solitamente si trova all'esterno della membrana cellulare —> il segnale non deve entrare nella cellula. Le proteine transmembrana hanno una faccia che guarda verso l'esterno, una porzione citoplasmatica e una porzione transmembrana. Sono tre domini distinti, ma che devono essere funzionalmente accoppiati. Il dominio extracellulare sente il primo messaggero e la porzione intracellulare si occupa di trasmettere il segnale.

Trasduzione

È la parte centrale ed è caratterizzata da vie di trasduzione del segnale. Il recettore e il sistema effettore sono un sistema di connessione tra il segnale e il sistema effettore stesso. Vi sono molti passaggi che coinvolgono sia modificazioni di proteiche sia trasformazioni che portano alla comunicazione tra proteine.

Risposta

Si occupa dell'effettiva risposta cellulare. Vengono controllate una o più componenti cellulari:

• Cambiamento di permeabilità, proprietà di trasporto, o stato elettronico della cellula
• Metabolismo cellulare
• Attività secretoria
• Tasso di proliferazione e differenziamento
• Attività contrattile
• Migrazione
• Morte

Molti eventi sono eventi multipli —> un singolo segnale agisce su elementi diversi e a sua volta una via del segnale può essere controllata da stimoli differenti —> integrazione.

Le cellule sono caratterizzate da due tipi di risposta: risposte veloci (pochi secondi) e risposte lente (minuti o ore). Una prima risposta può essere il cambiamento di funzionalità di proteine che devono essere accese o spente —> switch proteins, uno stato segnala uno stato acceso e un altro uno stato spento, una seconda attività prevede la sintesi ex novo di proteine che è un processo lento e dispendioso.

Integrazione

Varie combinazioni di fattori consentono risposte diverse —> diverse vie di trasduzione cooperano tra di loro. Diverse molecole segnale possono dare risposte diverse: ad esempio, l'acetilcolina è in grado di ridurre la velocità di contrazione delle cellule del muscolo liscio, induce contrazione del muscolo scheletrico ed induce secrezioni nelle ghiandole salivari. L'effetto di un ormone dipende dalla capacità dell'ormone di prendere contatto ed interagire con il recettore, il destino della cellula dipende dal sistema di trasduzione che si trova a valle. Può variare il sistema effettore oppure la via stessa di trasduzione, compreso il recettore.

La stessa risposta può essere indotta da segnali diversi: Epinefrina, glucagone e ATCH promuovono tutte la degradazione del glicogeno nelle cellule epatiche, tutti i recettori sono diversi, ma l'effetto è lo stesso. Vi è un secondo messaggero che segnala all'interno (AMP ciclico). Specifici recettori e specifiche macchine di trasduzione del segnale. I sistemi di trasduzione sono geneticamente conservati.

La velocità con cui una cellula risponde alla rimozione del segnale dipende dalla velocità di distruzione o turnover delle molecole influenzate dal segnale. E tale velocità di turnover determina anche la prontezza della risposta quando arriva un nuovo segnale. La fosforilazione è un evento veloce così come la defosforilazione —> meccanismo veloce. Tutte le vie di trasduzione del segnale devono essere reversibili. La velocità con cui viene spenta la via di trasduzione coincide con la velocità caratteristica per l'arrivo di un nuovo segnale.

Recettori intracellulari

Esistono due tipi differenti:

1. Capta la presenza di una molecola ormonale che può attraversare senza problemi la plasmo-membrana (idrofobica), sono trasportate da dei trasportatori e sono rilasciate nella vicinanza delle cellule bersaglio in cui entrano senza la necessità di un recettore.
2. Inizialmente si pensava che vi fosse una sola classe di molecole che intervenivano sia come trasportatori che come recettori (es. recettori trasportatori degli aa). In lievito i trasportatori e i recettori sono gli stessi, invece per il glucosio i recettori hanno perso la capacità di trasportarlo e viceversa i trasportatori hanno perso la capacità di segnalarlo.

La molecola recettrice nello spazio citoplasmatico interagisce con l'ormone ed è in grado di cambiare localizzazione e di andare nel nucleo dove il complesso ormone-recettore si lega a geni specifici, a questo punto la proteina legata al gene è in grado di attivare la trascrizione di mRNA che viene esportato dal nucleo e viene tradotto nel citoplasma dai ribosomi producendo delle proteine. In questo caso il recettore è anche il sistema di trasduzione.

Ormoni steroidei

Sono fattori di trascrizione in grado di stimolare la trascrizione di specifici geni legandosi agli enhancer a monte dei geni in questione. Il fattore di trascrizione non effettua la trascrizione stessa ma stimola l'attività della DNA polimerasi II, si attiva tramite delle molecole adattatrici. Il fattore di trascrizione deve essere una molecola composta da dei domini essenziali:

• Sito di legame per l'enhancer —> sequenza specifica
• Sito di interazione con il sistema di trascrizione —> dominio di attivazione

Per gli ormoni steroidei è richiesto che il recettore leghi l'ormone stesso, questo favorisce la traslocazione nel nucleo e rende disponibile nello stesso compartimento il fattore di trascrizione che si può legare all'enhancer, il terzo dominio del recettore lega l'ormone ed influenza la funzionalità della proteina, è un fattore ormone-dipendente:

• Non migra nel nucleo fino al legame con il ligando
• Il ligando può agire smascherando il sito di legame per il DNA

La presenza dell'ormone consente di assumere due conformazioni:

• Attiva —> con ormone
• Inattiva —> senza ormone

La risposta può essere suddivisa in:

• Risposta precoce
• Risposta tardiva

Le proteine di risposta primaria prodotte nella risposta precoce sono a loro volta fattori di trascrizione che attivano dei geni secondari —> proteine di risposta secondaria che sono effettivamente le operatrici della risposta. Vi sono delle proteine della risposta primaria che sono in grado di spegnere la risposta primaria. Possiamo distinguere eventi precoci (proteine che attivano le vie controllate dal recettore e dall'ormone) ed eventi tardivi. Viene in genere trascritto un gene il cui prodotto è un fattore di trascrizione con attività negativa —> ferma la prima reazione.

Recettori di superficie

I recettori più noti si trovano sulla superficie delle a plasmo-membrana e sono di 3 tipi:

• Recettori legati ai canali ionici
• Recettori legati a enzimi
• Recettori legati alle proteine G

Trasduzione di una molecola extracellulare

1. Interazione con il recettore tramite il dominio extracellulare, il dominio intracellulare trasmette il segnale trasdotto e attiva la via di trasduzione del segnale —> trasduzione primaria.
2. Il dominio intracellulare trasmette il segnale (relay) e questa trasmissione può coinvolgere sia proteine che piccole molecole, questa catena trasduce il segnale ma lo amplifica anche.
3. I segnali extracellulari sono presenti in piccole quantità, mentre i sistemi intracellulari funzionano con concentrazioni molto più elevate. È per questo che è necessaria l'amplificazione.
4. Il segnale tradotto e amplificato può interagire con segnali analoghi provenienti da altre vie di trasduzione —> integrazione.
5. Vi è un processo di concentrazione di vie del segnale, ma vi può essere un’operazione anche opposta —> spread, diffondendo il segnale anche ad altri sistemi effettori. Diverse vie di trasduzione possono attivare sistemi effettori multipli ovvero tutti i sistemi in grado di svolgere un'azione biochimica in risposta al segnale.
6. Possono essere necessari altri vari passaggi: una parte del processo può avvenire nel citoplasma, ma poi il segnale deve essere trasmesso all'interno del nucleo poiché uno degli effetti è alterare la trascrizione genica. È un percorso lungo e complesso e su ognuno di questi passaggi è possibile intervenire in modo farmacologico, quindi bisogna conoscere non solo l'evento effettivo, ma anche il contesto in cui opera.

Caratteristiche specifiche delle vie di trasduzione del segnale

• Specificità —> complementarietà tra segnale e recettore
• Amplificazione —> il segnale che arriva può avere una concentrazione minore rispetto a quella che otteniamo nei passaggi successivi, vi è una amplificazione del volume che serve per contrastare il rumore di fondo ovvero la possibilità che il recettore si attivi senza ligando o con un ligando differente, il sistema di amplificazione non deve essere eccessivo altrimenti si amplificherebbe anche il segnale di fondo
• Adattamento —> il recettore innesca una risposta biologica e una di queste risposte deve andare a spegnere il segnale in modo che la via non rimanga indefinitamente accesa
• Integrazione —> 2 segnali interagiscono con recettori diversi, sono in grado di innescare una risposta che tiene conto di entrambi i segnali, il modo in cui la cellula integra i segnali può essere diverso

In questi processi di trasduzione dobbiamo avere delle situazioni in cui il sistema si può trovare: acceso o spento. Vi sono diverse proteine che possono funzionare come interruttori (es. recettore). Il recettore in assenza del ligando non può interagire a valle, il legame con il ligando causa una modifica che permette l'interazione.

Due proteine che sono coinvolte come molecole interruttore sono proteine la cui attività è controllata da un evento di fosforilazione oppure da un’interazione con piccole molecole quali il GTP.

Fosforilazione

La fosforilazione è un evento di modificazione delle proteine che può avvenire in molte proteine diverse e comporta il legame covalente di un gruppo fosfato di precisi residui aa. Il gruppo fosfato è un gruppo ingombrante (80Da) e ha 2 cariche negative nette (acido forte). Le proprietà del gruppo fosfato fanno sì che sia in grado di perturbare la struttura 3D di una proteina, sicuramente a livello locale ma anche a livello distale. Una proteina si può trovare in due condizioni: off o on.

Il gruppo fosfato deriva spesso da ATP e raramente da GTP. Il fenomeno deve essere reversibile in tempi brevi e con poco dispendio energetico. Le proteine fosfatasi idrolizzano il gruppo fosfato senza dispendio energetico; la proteina che causa la fosforilazione è la proteina chinasi che utilizza energia (ATP) (il prefisso delle proteine chinasi indica il substrato su cui agisce). Essendo un ciclo che consuma energia, devono essere strettamente controllati dall'arrivo o allontanamento del segnale perché altrimenti sarebbe solo una perdita di energia.

Proteina G

È una proteina in grado di legare i nucleotidi guaninici e legano sia GTP che GDP. Il passaggio dalla forma attiva (legata a GTP) alla forma inattiva (legata a GDP) avviene tramite 2 passaggi. Il passaggio diretto e quello inverso sono l'uno l'opposto dell'altro in termini funzionali, ma non in termini biochimici (non si riforma ATP dopo la defosforilazione). Similmente per le proteine G, l'attivazione è determinata dall'uscita di GDP e sostituirlo con un GTP in entrata, la via inversa di inattivazione è di riportarla al GDP legato e comporta l'idrolisi del GTP. Si consuma energia perché si idrolizza un legame ad alta energia durante lo spegnimento del segnale.

Attivazione dei recettori

I recettori possono essere attivati da:

• Legame con una molecola segnale (ligando)
• Cambiamenti nella concentrazione di un metabolita (come ossigeno, nutrienti)
• Stimoli fisici (come luce, contatto, calore)

Il ligando può essere un qualsiasi tipo di molecola: micro molecola (glucosio) o macromolecola (proteina). Il legame può essere espresso quantitativamente tramite una relazione in cui si forma un complesso recettore-ligando e deve essere reversibile. Il legame del ligando può essere visto come una semplice reazione reversibile: K è la costante termodinamica di dissociazione; d[R] e [L] sono le concentrazioni del recettore e del ligando liberi e all'equilibrio e [RL] è la concentrazione del complesso recettore-ligando. K è la costante di dissociazione del complesso recettore-ligando e misura l'affinità del recettore per il ligando. La massima risposta fisiologica a molti segnali esterni si ha quando solo una frazione delle molecole di recettore sono occupate dal ligando.

La velocità di associazione V1 è pari alla velocità di dissociazione V2 è pari a all'equilibrio V1=V2. 1/Kd è la costante di associazione. La cinetica di legame tra recettore e ligando se è di 1 a 1 ed è descrivibile da un grafico simile a quello di Michaelis-Menten. Possiamo determinare delle costanti (es. costante di dissociazione) sulla base della costruzione della curva.

Recettori legati ai canali

I recettori per il glutammato, la serotonina e l'acetilcolina agiscono come una barriera quando i recettori cambiano forma, sono coinvolti in rapide segnalazioni sinaptiche fra cellule elettricamente eccitabili solitamente associate con il cambiamento del potenziale di membrana. Questo tipo di segnali è mediato da un piccolo numero di neurotrasmettitori che transitoriamente aprendo o chiudendo i canali ionici formati dalle proteine alle quali si legano.

Una parte del recettore è strutturato come un canale che permette il passaggio di ioni all'interno della membrana plasmatica schermando le cariche dei fosfolipidi, può verificarsi un cambio di potenziale di membrana, di [Ca²⁺] citosolico. Sono dei canali che possono essere aperti o chiusi e l'apertura dipende dall'interazione con il ligando.

Recettori con attività enzimatica

Vi sono due sottoclassi:

• Attività intrinseca: Queste molecole possono essere dei recettori tirosin chinasici, interagiscono con un primo messaggero (fattore di crescita, proteina con attività ormonale). Queste proteine hanno una parte del dominio intracellulare con attività chinasica che fosforila altre proteine e in particolare è una sottoclasse di proteine chinasi che si chiama tirosin chinasi poiché l'amminoacido accettore è una tirosina.
• Attività estrinseca che viene fornita da una proteina che si associa al recettore in opportune occasioni. L'attività è fornita da...