Appunti completi per l'esame di Genetica dello sviluppo e del differenziamento

Prof: Silvia Nicolis

Laurea magistrale in Biologia

Dispensa non a cura del docente

Pozzi Serena e Marta Cerina

INTRODUZIONE

Lo sviluppo parte da un nucleo diploide e porta a un individuo completo, formato da cellule di diverso tipo,

organizzate nello spazio.

Sviluppo e differenziamento della cellula, nello sviluppo è compreso l’aumento del numero di cellule,

secondo proliferazione controllata.

Differenziamento: da cellule non specializzate a cellule specializzate e differenziate fra loro.

Occorre l’attivazione di geni che caratterizzano uno specifico tipo di cellula, allo stesso modo bisogna

spegnere i geni non inerenti con quel particolare tipo cellulare.

Nel corso dello sviluppo ci sono diverse tendenze degli eventi, da poche cellule a molte che si differenziano

e si diversificano, in primis nei 3 foglietti embrionali, mesoderma, ectoderma e endoderma, che si

differenziano dalla gastrula e nelle cellule germinali.

A questo punto le cellule seguono diversi destini progressivi, oltre al mantenimento di cellule staminali che

conservano il carattere indifferenziato, servono per la rigenerazione in diversi tessuti.

Ci sono cellule staminali anche nel cervello, nel giro dentato dell’ippocampo e nella zona sottoventricolare

del telencefalo che si differenziano in neuroni olfattivi, è un’attività staminale limitata nello spazio e per il

tipo di cellula prodotta (molti più neuroni possibili da fare), la presenza di cellule staminali, potrebbe essere

sfruttata e stimolata a differenziare in più tipi di neuroni? Ad ora ancora no.

Le cellule germinali sono già divise nelle prime fasi dello sviluppo, dalla massa delle altre, alla base

dell’allantoide si definiscono poche cellule che andranno a migrare nelle creste genitali e che si

differenzieranno in cellule germinali maschili o femminili.

Durante il corso vengono trattate fasi dello sviluppo tardivo di topo, un modello in cui è possibile indurre

mutazioni patologiche e mirate utilizzando il gene-taregting, ottenendo un fenotipo patologico molto simile

all’uomo. Il differenziamento nel tempo e nello spazio è determinato da segnali a cascata tra le cellule,

anche a livello molecolare c’è un’organizzazione strutturale dei geni a livello della cromatina.

Lo sviluppo comprende diversi aspetti:

- per aumentare il numero di cellule;

Proliferazione,

- in tipi cellulari diversi;

Differenziamento,

- le cellule devono spostarsi per raggiungere il loco preciso

Migrazione e organizzazione spaziale,

per la formazione di tessuti e organi (migrazione dei neuroni GABAergici); - da

Rigenerazione,

parte delle cellule staminali;

La ha a che fare con diversi processi cellulari dello sviluppo, sviluppo della forma, correlata alla

morfogenesi

proliferazione differenziale e all’organizzazione spaziale (ex. sv. del tubo neurale, prima struttura che si

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forma durante lo sviluppo). Importanti sono le molecole segnale, i che legano recettori specifici

morfogeni

sulle cellule, l’asse morfogeno-recettore delinea il un evento fondamentale per lo sviluppo.

signaling,

L’espressione genica presenta diversi livelli di regolazione, il primo evento è la trascrizione dei geni sul DNA

in RNA, spesso si ottiene un trascritto primario, che può essere soggetto a splicing alternativo, verrà

poliadenilato, verrà aggiunto il CAP, editato e trasportato dal nucleo al citoplasma, potrebbe essere anche

un RNA non codificante, lo splicing alternativo, in particolare è oggetto di regolazione fine e permette la

differenziazione dei prodotti genici. Il livello successivo è quello della traduzione, che permette una

regolazione differenziale dell’output finale, a questo livello i miRNA regolano la traduzione, agendo sulla

stabilità del RNA, la traduzione restituisce una proteina che può essere modificata post traduzionalmente.

TECNICHE PER LO STUDIO DELL’ESPRESSIONE GENICA

- Northern blot

Permette di visualizzare gli mRNA.

L’mRNA totale di una cellula viene estratto e fatto migrare su un gel di agarosio che separa i diversi mRNA

in base del peso molecolare, la matrice di agarosio li separa rallentando nel gel gli mRNA più lunghi. In

condizioni denaturanti la lunghezza dell’mRNA diventa l’unico parametro per la separazione, si evita la

formazione di strutture secondarie. La distanza migrata è inversamente proporzionale al logaritmo del peso

molecolare.

Poi si fa un Blot su un filtro di nitrocellulosa, a cui si aggiunge sopra un agente assorbente e un peso. Il gel

viene posto su un wick paper immerso in un tampone salino che aiuta il trasferimento dell’mRNA sul filtro

di nitrocellulosa. L’mRNA che ha migrato passa sul filtro che poi viene portato ad alte T per la fissazione. Il

filtro di nitrocellulosa viene poi messo a contatto con le sonde, in eccesso di DNA genomico che compete

per il legame con le sonde. Le sonde sono oligonucleotidi di DNA o di RNA complementari al messaggero di

interesse, le sonde devono essere marcate, es. nucleotide con fosforo radioattivo.

Es. mi interessa il messaggero di Pax-6. Con un vettore di clonaggio clono il cDNA ottenuto a partire

dall’mRNA di Pax-6. Si aggiungono dei promotori per RNA polimerasi sul filamento complementare al cDNA

di Pax-6 nel vettore di clonaggio, così ottengo un trascritto di mRNA complementare all’mRNA del gene

Pax-6.

Le sonde marcate legano l’mRNA complementare sul filtro di nitrocellulosa, solo se la complementarietà è

estesa è stabile, vengono fatti dei lavaggi per rimuovere la sonda in eccesso o non appaiata

completamente. Si lavora sulla salinità, abbassando la concentrazione salina dei lavaggi, le condizioni

diventano più stringenti e rimangono solo gli ibridi con il messaggero di interesse. In altri casi preferisco una

bassa stringenza ad es. perchè voglio trovare tutti gli mRNA trascritti da geni relati tra di loro, non un solo

mRNA.

Con il Northern blot posso investigare se l’mRNA di interesse si trova in diversi tessuti e in quali quantità

(banda più o meno marcata), se una banda è più ampia, forse è perchè ci sono forme di splicing diverse,

mRNA di lunghezza diversa ma riconosciuti dalle sonde.

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- In situ hybridization

Serve per visualizzare gli mRNA, in sezioni istologiche, ma anche su embrioni e organi interi. Anche in

questo caso serve una sonda marcata che permetta di visualizzare il messaggero di interesse.

La marcatura della sonda viene fatta inserendo un ribonucleotide marcato con la digossigenina, la sonda

viene realizzata con la stessa tecnica di clonaggio in vitro vista per la Northern blot. Il tessuto, es. di

embrione di zebrafish, deve essere trattato per la FISH, si usano dei detergenti per creare dei buchi nella

membrana delle cellule, in seguito sono incubate con le sonde. Dopo diversi lavaggi, si aggiunge un

anticorpo anti-digossigenina coniugato con l’enzima fostatasi alcalina. Poi viene aggiunto il substrato

dell’enzima, un substrato cromogeno incolore, dove è presente l’enzima il substrato viene fosforilato e si

forma un prodotto di colore blu che precipita nella cellula. In questo modo sono facilmente identificabile le

cellule colorate dove è presente l’mRNA di interesse.

La tecnica è stata utilizzata nello studio degli stadi precoci dell’embrione di Drosophila, ha permesso di

vedere che le cellule embrionali hanno un trascrittoma molto diverso già agli stadi più precoci, si vedono

delle bande colorate dei territori embrionali che preludono ai segmenti, che si formeranno solo dopo.

- RT-PCR (Reverse Transcription PCR)

A partire dall’mRNA estratto da una cellula si usa una trascrittasi inversa per retrotrascrivere il cDNA

corrispondente, con il calore o con una RNAasi H viene eliminato il filamento di mRNA. In questo modo si

ottiene una copia del cDNA di tutti gli mRNA della cellula oppure solo di alcuni. Poi si usa la PCR per

amplificare il cDNA. Posso usare un primer specifico per il gene di interesse, così ottengo il cDNA double

strand che poi amplifico con i due primer e la Taq polimerasi. Con l’amplificazione esponenziale ottengo

tante copie del cDNA, che alla fine posso analizzare con l’elettroforesi sul gel.

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- Microarrays É una tecnica molto utile per

comparare l’espressione genica in due

tipi cellulari o della stessa cellula in

due stati diversi, es. di un embrione

WT e di un embrione mutato. Per

prima cosa si estraggono gli mRNA e si

retrotrascrivono in cDNA tramite la

trascrittasi inversa, i cDNA provenienti

dai due tipi cellulari si colorano con

due fluorocromi diversi, verde e rosso.

I cDNA vengono ibridati su un chip per

microarray, costituito da un insieme di

sonde immobilizzate su un supporto

solido, ciascuna sonda

complementare con un diverso cDNA

occupa un dot, possono esserci le

sonde per tutti i geni espressi o solo per alcuni. Si incuba il chip per microarray con la miscela di cDNA dei

due tipi cellulari, in stessa quantità. Dopo l’ibridazione e il lavaggio si osservano i risultati sotto i raggi UV

che eccitano i due fluorocromi, l’emissione colorata riflette abbastanza il numero di molecole di cDNA che

si sono ibridate con le sonde. I dot gialli sono quelli in cui si sono ibridati cDNA provenienti da entrambi i tipi

cellulari, vuol dire che un certo mRNA è espresso in entrambi i tipi cellulari, mentre i dot verdi e rossi sono

quelli in cui solo il cDNA proveniente dall’uno o dall’altro tipo cellulare si è ibridato, quindi l’mRNA è

espresso solo in una o nell’altra cellula. Ci sono anche dei dot con gradazioni diverse, la macchina è in grado

di rilevare le percentuali relative di rosso e di verde, dando dei risultati semiquantitativi.

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- RNA Seq

Si basa sulle tecniche di next generation sequencing, il sequenziamento dà come risultato una serie di

reads, cioè piccole sequenze di 20/30 nucleotidi. Si estrae dalla cellula l’mRNA, si purifica e si retrotrascrive

con una trascrittasi inversa per avere il cDNA. Il cDNA deve essere frammentato, es. tramite sonicazione, si

aggiungono ai frammenti di cDNA gli adaptors, cioè brevi sequenze che permettono di sequenziare

l’insieme dei frammenti. La frammentazione può avvenire sull’mRNA o sul cDNA. Si ottiene una library

(collezione di frammenti) che viene sequenziata tramite high-throughput sequencing.

I reads ottenuti sono allineati sui genomi di riferimento presenti nei database, sappiamo dove vanno

collocati e vediamo quanti reads ci sono in ogni regione. Troveremo regioni in cui ci sono più o meno reads,

alcune regioni non hanno nessun reads, capisco che corrispondono a un introne o a una regione

intergenica. Questa tecnica permette di sequenziare tutto ciò che è stato trascritto in mRNA, allineando i

reads con un genoma di riferimento scopro tutto il trascrittoma della cellula in analisi, scopro introni e

esoni, nuove forme di splicing... .

Si possono trovare: reads esonici, in corrispondenza degli esoni trascritti e ritenuti con lo splicing, junction

reads, in cui in un singolo read trovo un pezzo di sequenza di un esone e un pezzo di sequenza dell’esone

successivo, sul genoma sono separati in due dall’introne mentre sull’mRNA e quindi sul cDNA sono vicini,

siti di splicing, reads che contengono strecthes di poli A in corrispindenza dell’estremità in cui c’è stata

poliadenilazione... .

Allineando i reds con il genoma di riferimento vedo regioni con più o meno reads, ottengo quindi due tipi di

informazioni: sequenza degli mRNA e abbondanza, cioè livello di espressione dell’mRNA e di certe forme di

splicing rispetto ad altre. Guardando quali e quanti reads sono stati sequenziati in certe regioni trovo le

varianti di splicing, inizi di trascrizione alternativi... .

TRANSGENESI E GENE TARGETING

Il topo è uno dei modelli genetici più importanti. È diventato importante soprattutto da quando abbiamo

capito come modificare in modo mirato il genoma murino, tra l’uomo e il topo c’è un grado di omologia del

97.5% per i geni che codificano per le proteine, sfruttando i geni omologhi dei geni umani nel topo si

possono generare e studiare i modelli murini di patologie umane. L’alto grado di omologia delle sequenze

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codificanti testimonia che la diversificazione delle sequenze regolative influisce enormemente sulla

diversificazione delle specie.

Come si ottengono dei topi geneticamente modificati?

1. Transgenesi: aggiunta di un gene in una posizione casuale nel genoma del topo

2. Gene targeting: mutazione mirata di uno o più geni specifici.

Topi transgenici

Per ottenere un topo transgenico si aggiunge il transgene prima ancora dello stadio di zigote, in uno dei due

pronuclei dell’uovo fecondato prima che si siano fusi, in questo modo tutte le cellule dell’adulto avranno il

gene e verrà trasmesso alla progenie.

Viene preparata una soluzione contenente i frammenti di DNA lineare contenenti il transgene, il DNA viene

iniettato in uno dei due pronucleo dell’uovo fecondato, il transgene si integra casualmente in

corrispondenza delle rotture transitorie che si verificano fisiologicamente nel genoma e vengono subito

ricucite dai meccanismi di riparazione del DNA, queste rotture e sistemi di riparazione vengono sfruttati per

integrare il gene esogeno. Il gene esogeno si integra in un punto casuale del genoma, in una o più copie, di

solito più copie sono integrate tutte insieme in un punto. Lo zigote viene reimpiantato nell’utero di una

femmina di topo pseudogravida, cioè resa recettiva ormonalmente attraverso l’accoppiamento con un

maschio vasectomizzato. In questo modo gli unici embrioni che si svilupperano saranno derivati dagli zigoti

che erano stati trasfettati con il gene esogeno.

Tra i topi che nascono ci sono quelli transgenici, fino a 1/3 della progenie, riconosciuti con una piccola

biopsia della coda, in cui il DNA viene analizzato con la PCR. Ogni topo transgenico è il fondatore di una

linea transgenica, trasmette il gene esogeno alla progenie.

Si possono studiare:

- regolazione dell’espressione genica, es. promotori e enhancer tramite un gene reporter.

- espressione di geni mutati, es. transgeni che codificano per una proteina che causa una patologia.

- espressione ectopica, es. transgene sotto il controllo di un promototre attivo in un certo tessuto,

non fisiologico.

In altri animali il gene esogeno non si riesce a integrare allo stadio di una cellula, ma solo a uno stadio

successivo formato da più cellule, meno utile perchè non tutte le cellule dell’adulto avranno il transgene.

Gene targeting

Il gene targeting permette di ottenere una mutazione specifica di un gene di interesse nel genoma murino.

Il gene targeting si basa su una elevata omologia di sequenza (varie migliaia di nucleotidi) tra il tratto di

DNA genomico da modificare e un vettore di mutagenesi.

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Si sfrutta la tendenza che hanno le cellule di appaiare le sequenze omologhe. Il vettore si appaia per

omologia di sequenza con il tratto del genoma del topo, in un piccolo numero di casi avviene un evento di

doppio crossing-over che rimpiazza il tratto del genoma murino con un tratto del vettore di mutagenesi. È

un evento molto raro, per cui si congelano le cellule germinali dei topi in cui si è ottenuta la mutazione

voluta.

Essendo un evento molto raro servono tantissimi tentativi, non si usa l’embrione di topo ma un intermedio

cellulare, le cellule ES, che possono essere essere estratte dalla blastocisti matura e coltivate in vivo in gran

numero. Si ottengono delle linee di cellule ES che mantengono la pluripotenza e la capacità di formare

parte di un nuovo organismo se reimpiantate nella massa cellulare interna di una blastocisti ospite. Le

cellule ES vengono trasfettate, vengono selezionate quelle in cui è avvenuta la ricombinazione e reiniettate

in una blastocisti ospite partecipano alla costruzione di un nuovo organismo che è un topo chimerico,

formato da cellule che vengono dalla massa cellulare interna della blastocisti ospite e cellule che vengono

dalle cellule ES che erano state modificate geneticamente. Serve uni marker di selezione per vedere quali

sono le cellule che derivano dalle cellule ES, es. gene per un colore diverso del pelo. Questi topi sono

chimerici anche nelle cellule germinali. Accoppiando un topo chimerico con un topo normale si ottengono

topi normali e topi in cui tutte le cellule hanno in eterozigosi la mutazione che era stata indotta nelle cellule

ES, in quanto derivano da una cellula germinale con la mutazione. Accoppiando due topi eterozigoti per la

mutazione voluta ottengo anche dei topi omozigoti per la mutazione, es. se la mutazione è loss of function

avrò topi knock-out per quel gene.

La possibilità di mutazioni geniche mirate ha permesso lo studio di molti geni spesso correlati a patologie,

oltre che in topo, è possibile attuare mutazioni mirate anche in altri organismi, utilizzando il sistema

che permette di operare mutazioni sito specifiche anche nel genoma umano.

CRISPR-Cas9,

Per ottenere mutazioni sito specifiche nel topo si è usato fino ad ora il che è ancora il

gene targeting,

sistema migliore e più validato dall’esperienza.

Entrambi i metodi si fondano su meccanismi propri della cellula di riparo del DNA, questi meccanismi si

servono di un templato da cui copiare la sequenza corretta. Nel gene targeting si sfrutta la tendenza della

cellula di appaiare sequenze omologhe, quindi si disegna e sintetizza un vettore di targeting basato sulla

presenza di regioni omologhe di alcune kb che fiancheggiano il gene da modificare, serve un marcatore di

selezione per identificare le cellule che hanno integrato il vettore, questo metodo non discrimina se il gene

si è inserito nella regione di nostro interesse o a caso, quindi occorre migliorare gli strumenti, per

aumentare la probabilità di questi eventi rari, a fronte della tendenza di ogni cellula a integrare DNA in un

sito casuale.

Il passo successivo è stato quello di attuare una diluizione clonale delle cellule, piastr