5. Genetica dello sviluppo e del differenziamento, sviluppo del sistema nervoso e sistemi regolatori ascendenti

Patterning della corteccia cerebrale

Anche il patterning della corteccia cerebrale ha origine grazie a centri di segnale che producono molecole diffusibili.

La corteccia cerebrale è suddivisa in aree con funzioni distinte, nel cervello di topo si identificano anteriormente i bulbi olfattori, poi spostandosi in direzione antero-posteriore l'area motoria (F/M), l'area somatosensoriale (S1), l'area visiva (V1) e più lateralmente l'area uditiva (A1). La posizione delle aree corticali primarie è abbastanza conservata nell'uomo: l'area motoria primaria è anteriore rispetto all'area somatosensoriale primaria e rispetto all'area visiva primaria, che è la più posteriore di tutte, lateralmente troviamo l'area uditiva primaria.

Come si specificano queste aree con funzioni distinte della corteccia cerebrale? Il problema è più complesso nell'uomo dove le aree cerebrali si specificano.

• Ulteriormente dal punto di vista funzionale. Ci si chiede con quali meccanismi genetici vengano specificate le diverse aree corticali nel corso dello sviluppo embrionale.
• L'esistenza di confini che delimitano le diverse aree corticali è congruente con l'idea che durante lo sviluppo ci siano dei centri di segnale che in modo concentrazione-dipendente istruiscono le diverse regioni della giovane corteccia a differenziare nelle diverse aree corticali. Per cui si è andato alla ricerca di geni che potessero spiegare il patterning della corteccia cerebrale.
• C'erano due ipotesi opposte riguardo a ciò che avvia la diversificazione delle aree corticale. Per prima si era sviluppato il che dava un'importanza predominante alle afferenze sulla modello della protocorteccia, corteccia dei neuroni subcorticali, es. connessioni talamo-corticali, siccome queste afferenze si sviluppano molto precocemente, alcuni pensavano che il patterning della corteccia fosse una

conseguenza delle afferenze subcorticali. Ma studiando gli embrioni precoci si è sviluppata un'altra ipotesi, il modello della secondo cui prima si forma una mappa delle aree corticali e dopo le afferenze subcorticali, protomappa, questa mappa viene inizialmente stabilita da centri di segnale che agivano più precocemente sulla corteccia. Questa ipotesi era supportata da alcuni dati di osservazione: si era visto che già prima dell'innervazione da parte delle regioni subcorticali la corteccia appare in parte arealizzata, ci sono aree diversificate dal punto di vista dell'espressione genica molto precocemente nello sviluppo, in più si erano osservanti dei mutanti di topo Bbx2 che mancano di un fattore trascrizionale che è attivo precocemente nel talamo, questi topi non formano proiezioni talamo-corticali, ma nonostante questo il patterning della corteccia si sviluppa ugualmente. Per questo si era iniziato a pensare che ci fosse qualcosa cheagiva in fasi più precoci rispetto alla formazione delle connessioni sub-corticali, per avviare una diversificazione delle aree cerebrali, siccome erano già noti dei casi in cui durante lo sviluppo delle molecole segnale determinavano un gradiente di espressione di fattori trascrizionali per guidare il differenziamento in diversi tipi cellulari, per prima cosa si sono iniziati a cercare dei fattori trascrizionali che fossero espressi secondo un gradiente nella corteccia cerebrale precoce. I primi individuati sono Emx2 e Pax6, attivi nel primordio della corteccia cerebrale secondo due gradienti di concentrazione opposti in senso anteroposteriore e in senso mediolaterale: Emx2 è più attivo nella regione posteriore e mediale, Pax6 è più attivo nella regione anteriore e nelle regioni laterali. Ci si è chiesto quale fosse l'effetto del KO di questi due geni rispetto al patterning della corteccia. Il patterning della corteccia è stato

studiato utilizzando dei marcatori di area che si attivano precocemente, come la caderina 6 e la caderina 8 che marcano aree corticali specifiche, per es. la caderina 8 è attiva nell'area anteriore della corteccia cerebrale che formerà la corteccia motoria, per questo motivo una sonda per la caderina 8 colorerà la corteccia cerebrale anteriore.

Quello che si è osservato è che nel cervello di topo Emx2 c'è un'espansione delle aree anteriori e laterali: il territorio di espressione della caderina 8, che rappresenta il primordio della corteccia motoria, si espande posteriormente, ma il cervello complessivo non aumenta di dimensioni, aumenta la frazione di corteccia in cui è attivo il marcatore anteriore. Lo stesso succede per altri marcatori, come la caderina 6 che ha un pattern di espressione laterale, nel cervello di topo Emx2 si osserva un'espansione anche delle aree laterali medialmente. Non essendoci un aumento

delle dimensioni del cervello complessivo, l'espansione delle aree anteriori e laterali è associato ad una contrazione delle aree posteriori. Invece si osservava una contrazione dei territori anteriori e laterali marcati con Nel cervello di topo Pax6 la caderina 8 e la caderina 6, queste aree si contraggono perché c'è un'espansione delle aree posteriori, quindi della regione occipitale che rappresenta il primordio dell'area visiva. Anche in questo caso non cambiano le dimensioni complessive del cervello. Queste osservazioni suggerivano che Emx2 e Pax6 fossero importanti per guidare lo stabilirsi dei confini tra le future aree cerebrali, di conseguenza ci si chiedeva che cosa innescasse nel corso dello sviluppo i gradienti di espressione di questi due fattori trascrizionali. I mutanti KO avevano anche altri problemi, es. il mutante Emx2-/- perdeva il giro dentato dell'ippocampo, mostrava un'alterazione della proliferazione dei.

Precursori neuronali, con un aumento delle cellule indifferenziate e una diminuzione dei neuroni. Si è iniziata a studiare l'espressione di geni codificanti per molecole segnale attivi nelle fasi precoci dello sviluppo cerebrale, intorno al giorno 10, la cui espressione precede la diversificazione della corteccia. Si è osservato che ci sono dei geni codificanti per molecole segnale che sono espressi in modo localizzato, insorgenti puntiformi, come il gene FGF8 che viene espresso in modo molto localizzato in una sorgente nella regione anteriore del telencefalo, possiamo ipotizzare che la molecola segnale diffonda dalla sorgente creando un gradiente di concentrazione, FGF8 è diventato un candidato per agire sulla specificazione di gradienti di espressione di fattori trascrizionali che stabiliscono i confini tra le aree cerebrali. Oltre a FGF8 ci sono anche altri geni con le stesse caratteristiche, come Wnt3a, attivo in modo localizzato nella parte mediana posteriore.

della vescicola telencefalica, e Shh, attivo nella regione ventrale. Quindi nel telencefalo precoce ci sono almeno 3 centri di segnale che esprimono geni codificanti per molecole segnale nel momento giusto perché queste agiscano come segnali di patterning che inducono il successivo gradiente di espressione dei fattori trascrizionali responsabili del patterning della corteccia. In queste fasi precoci il cervello è ancora formato da cellule indifferenziate. Si è allestito un esperimento in cui veniva alterata sperimentalmente la concentrazione di FGF8 durante lo sviluppo del cervello. Si è introdotta un'espressione ectopica aggiuntiva di FGF8 in un cervello embrionale, tramite una elettroporazione in utero, una tecnica per introdurre un'informazione genetica ectopica nel cervello embrionale in via di sviluppo. Si è realizzato un vettore di espressione con il gene di FGF8 sotto il controllo di un promotore forte ed è stato elettroporato nel.posteriori.Dopo lo sviluppo della corteccia nei primi giorni dopo la nascita si sono osservate le conseguenze sulle sezioni del cervello. Nei topi in cui FGF8 era stato overespresso si vede che c'è un'espansione delle regioni corticali anteriori, marcate ad es. con l'efrina A5, il confine si sposta posteriormente. Nei topi in cui FGF8 era stato sequestrato dal recettore solubile si vede che il confine delle aree corticali anteriori si sposta anteriormente, le regioni anteriori si contraggono. Nei topi in cui era stata generata una seconda sorgente di FGF8 nella regione posteriore si osserva una duplicazione della corteccia somatosensoriale, si forma una seconda area somatosensoriale speculare alla prima, si riconosce grazie a dei nuclei caratteristici della corteccia somatosensoriale che appaiono invertiti rispetto a quelli della prima corteccia somatosensoriale. Questo vuol dire che FGF8 ha la capacità di determinare i confini tra le aree cerebrali ma anche

quella di specificare l'orientamento di alcune aree corticali, come quella somatosensoriale. In seguito, è stato scoperto che molecole come FGF8 influiscono sull'espressione di fattori trascrizionali come Emx2 e Pax6, in particolare FGF8 reprime l'espressione di Emx2 e attiva l'espressione di Sp8, un altro fattore trascrizionale. Quindi sembrava confermata l'ipotesi che tra l'azione dei morfogeni e lo stabilirsi dei confini tra le aree corticali c'è l'espressione di fattori trascrizionali, attivi secondo gradiente. In seguito a Emx2 e Pax6 sono stati scoperti altri fattori trascrizionali come Coup-TFI e Sp8, anch'essi espressi in fase precoce secondo un gradiente.

Sono stati realizzati e studiati anche i KO condizionali di questi fattori trascrizionali: il KO di COUP-TFI comporta l'espansione posteriore della corteccia motoria, il KO di Sp8 comporta l'espansione anteriore della corteccia visiva.

Per alcuni di questi

I fattori trascrizionali si sono fatti anche degli esperimenti gain of function, ad esempio l'overespressione di Emx2 con un transgene che determina l'espressione più elevata di Emx2 in modo omogeneo.