5. Genetica dello sviluppo e del differenziamento, sviluppo del sistema nervoso e sistemi regolatori ascendenti

Sviluppo del sistema nervoso

Determinazione neurale e formazione del tubo neurale

Lo sviluppo neuronale parte dalla determinazione neurale dell'ectoderma, che forma la piastra neurale e assume il destino di futuro epitelio. La piastra si ripiega formando il tubo neurale, nel processo in cui l'ectoderma si suddivide in epitelio neurale e tubo neurale, attraverso la neurulazione. La formazione del tubo comincia la sua diversificazione in regioni differenti: prosencefalo, mesencefalo, romboencefalo e midollo spinale. Queste regioni sono ancora primordi, formate da cellule proliferanti e indifferenziate, fusiformi, che costituiscono il tubo e si dividono coerentemente all'accrescimento del tubo in tutte le direzioni.

L'accrescimento del tubo è differenziale nelle varie regioni. La porzione cefalica, ad esempio, si accresce maggiormente in senso radiale generando vescicole, rispetto alla porzione caudale. In questa fase si verifica la diversificazione di regioni diverse che esprimono geni diversi, anche se a questo livello, tutte le regioni sono costituite da cellule uguali.

Differenziamento cellulare nel tubo neurale

La fase successiva è quella del differenziamento delle cellule neuroepiteliali in cellule neuronali e gliali, che insieme formano il sistema nervoso: neuroni, astrociti e oligodendrociti (glia). Il differenziamento avviene in modo geometricamente definito nell'ambito del tubo neurale. Osservando il tubo in sezione, si nota che le cellule proliferanti e indifferenziate occupano la parte luminale, che si affaccia sulla cavità centrale del tubo, la zona ventricolare. La progenie di alcune cellule migra verso le porzioni esterne del tubo neurale, dove a poco a poco differenzia, prima in neuroni e poi in glia.

Neuroni e glia sono cellule post mitotiche, non si dividono più, anche se alcune cellule gliali in regioni specifiche del cervello adulto hanno una doppia identità e possono dividersi e generare nuovi neuroni e cellule della glia. Entrambe le categorie cellulari compaiono in modo diverso nelle diverse regioni del tubo neurale.

Regionalizzazione del tubo neurale

La regionalizzazione del tubo neurale inizia con la definizione di 3 vescicole: proencefalo, mesencefalo e romboencefalo, che precedono la parte caudale del tubo. Lo stadio successivo è a 5 vescicole. La vescicola 1 si divide nei due ventricoli laterali del telencefalo, che formeranno i primordi dei due emisferi cerebrali e nel diencefalo (1b), che si differenzierà nella retina neurale. A seguire, midbrain e hindbrain, diviso in metencefalo (cervelletto) e mielencefalo. Già in questi stadi precoci, le diverse regioni esprimono geni in modo differenziale, che presiedono allo sviluppo del sistema nervoso.

Cellule staminali neurali

Le cellule che presiedono alle prime fasi dello sviluppo del tubo neurale e che rimangono in loco hanno carattere di cellule staminali, ovvero, sono capaci di autorinnovamento. La cellula staminale neurale si definisce come cellula capace di self-renewal (generare una nuova cellula staminale) e di multipotenza, produrre per differenziamento neuroni, astrociti e oligodendrociti. Ma una cellula staminale neurale è in grado di produrre per differenziamento tutti i tipi neuronali dell'individuo? Non è ancora chiarito questo aspetto.

Proprietà delle staminali neuronali

Le staminali neurali sono state scoperte tramite saggi di coltura in vitro, coltivando cellule prelevate dalla zona ventricolare del cervello embrionale in Stem cell medium, che contiene mitogeni come EGF e bFGF. Le cellule mantenute in questa condizione proliferano e formano neurosfere, che possono essere dissociate. Le cellule ottenute dalla dissociazione possono formare neurosfere secondarie o terziarie, dimostrando la proprietà di self-renewal, tipica delle cellule staminali. È possibile mantenere una popolazione di cellule formanti neurosfere che si espande in modo esponenziale.

Non tutte le cellule provenienti da neurosfere sono in grado di formarne altre. Si nota che in coltura le cellule stabiliscono un equilibrio tra cellule formanti neurosfere e cellule che smettono di dividersi, presentando quindi un potenziale mitotico molto più limitato.

Processo di differenziamento delle cellule

Ponendo le cellule ottenute dalle neurosfere in un terreno di coltura di differenziamento, che non contiene più i mitogeni aggiunti in precedenza, ma a cui è stato aggiunto BSA non presente nel SCmedium in cui le cellule sono state espanse e piastrate su un substrato come il matrigel, le cellule differenziano, portando alla formazione di neurosfere discrete contenenti neuroni, astrociti e oligodendrociti. Ciò viene visualizzato tramite l'impiego di anticorpi in esperimenti di immunofluorescenza, dimostrando la multipotenza della cellula formante neurosfera.

Espressione genica e identità delle cellule staminali

Nello sviluppo del tubo neurale ci sono geni attivi in modo differenziale, individuabili tramite un reporter, come beta-geo, che conferisce alla cellula neomicina resistenza e attività β-galattosidasica, colorandola di blu dopo la somministrazione del substrato cromogeno x-Gal. Il gene beta-geo è stato posto sotto il controllo del promotore di Sox2 tramite KI. Dal topo contenente il transgene in eterozigosi, sono state dissociate cellule e messe in coltura. Queste cellule formano neurosfere, e allestendo la coltura in presenza di neomicina, è possibile selezionare le cellule in cui il locus Sox2 è trascrizionalmente attivo. La formazione di neurosfere da parte di queste cellule dimostra che il gene Sox2 è espresso in cellule staminali neurali in vitro.

Poste in terreno differenziativo, si ottengono cellule positive per β-tubulina III, proteina specificamente espressa nei neuroni, che mostrano morfologia neuronale, sono in grado di fare sinapsi elettricamente attive e differenziano anche in cellule della glia. Questo porta a concludere che le cellule che esprimono Sox2 hanno le proprietà delle staminali neuronali.

Espansione e differenziazione delle cellule neuroepiteliali

Le cellule staminali neurali sono attive durante lo sviluppo del tubo neurale nelle fasi precoci. Il tubo è formato da un singolo strato di cellule neuroepiteliali che si organizzano in una palizzata. La divisione delle cellule staminali avviene secondo un piano parallelo alla superficie del ventricolo, partendo dalla base del tubo neurale. È la cosiddetta fase di espansione, formata da divisioni simmetriche della staminale. A questa fase segue, intorno al giorno 13, la fase di divisione asimmetrica delle cellule. Il suo prodotto è formato da una cellula che rimane nella zona ventricolare mantenendo la staminalità e un'altra cellula che migra verso l'esterno, differenziandosi nelle zone più periferiche del tubo neurale, dove forma il progenitore dei neuroni. Anche quando la cellula si è distaccata dalla zona ventricolare, è ancora in grado di dividersi prima di diventare neurone, ma possiede un potenziale di divisione limitato. Il differenziamento in neuroni è precedente al differenziamento in cellule della glia.

Il grande sviluppo del sistema nervoso umano è dovuto in larga misura al mantenimento per lungo tempo del potenziale proliferativo delle cellule della zona sottoventricolare esterna. Siamo nella fase precedente alla formazione della glia. La staminale tramite divisione asimmetrica continua a produrre altre cellule staminali e da un certo momento dello sviluppo anche progenitori gliali. Le due fasi non sono completamente separate. La genesi dei neuroni comincia prima, mentre quella della glia finisce dopo. Sono largamente non sovrapposte.

Il neuroepitelio agli stadi più avanzati del differenziamento presenta già strati diversificati. Si individuano i neuroblasti corticali che producono corteccia in modo inside-out. Ovvero, prima viene generato lo strato più profondo, poi i neuroblasti degli strati superficiali attraversano lo strato profondo per andare a differenziare negli strati superiori. In questo processo sono implicati fenomeni come la migrazione e l'arrivo in zone specifiche del neuroendotelio, guidati da programmi di migrazione cellulare e fattori genetici.

Fino alla nascita, le divisioni asimmetriche incrementano di molto il numero delle cellule differenziate rispetto alle staminali. Al termine dello sviluppo, il cervello è formato quasi interamente da cellule differenziate. Solo una piccola proporzione di cellule rimane staminale anche nel cervello adulto. Queste risiedono nel giro dentato dell'ippocampo, regione importante per la costruzione della memoria. In questa zona, le cellule staminali continuano a generare nuovi neuroni per tutta la vita dell'individuo. La neurogenesi è estremamente importante per le funzioni dell'ippocampo, inclusa la formazione di nuove memorie spaziali. È modulata dall'ambiente e in particolare è stimolata dalla corsa, oltre che dall'elaborazione di compiti più sofisticati. La neurogenesi ippocampale declina con l'età.

Un'altra popolazione di cellule staminali nel cervello adulto risiede nella zona sottoventricolare del telencefalo, sotto alle cellule ependimali. Si occupano della neogenesi di interneuroni del bulbo olfattorio.

Identità genetica delle cellule staminali neurali

Le staminali neurali hanno proprietà di espressione genica sia comuni che specifiche della zona del tubo neurale da cui sono state isolate. Vengono poste in coltura neurosfere originate da cellule prelevate dal midollo o dal telencefalo. In questo esperimento, il telencefalo esprime un marcatore blu, costituito dal transgene beta-geo, guidato dalle sequenze regolative di Sox2 specifiche per la corteccia. Infatti, il gene Sox2 è guidato nella sua espressione nel tubo neurale da differenti enhancer, attivi in differenti tratti del tubo stesso. Qui, l'attività del transgene fa da marker per le staminali coltivate dalla corteccia, mentre l'assenza di colorazione caratterizza le cellule coltivate dal midollo.

Dopo diversi giorni di coltura in vitro, in assenza di G-418, dopo ogni passaggio un'aliquota veniva ripiastrata in presenza di G-418 e si procedeva alla conta delle cellule sopravvissute. L'andamento delle cellule resistenti nel tempo è visualizzato nel grafico. Anche se le cellule sono cresciute in assenza di G-418, la maggior parte esprime il marker corticale, che è attivo anche in assenza di pressione selettiva. Ovvero, nelle cellule sono presenti fattori trascrizionali che garantiscono la continuità dell'espressione del marcatore. Per contro, le cellule del tessuto spinale non lo mostrano mai. C'è un'identità genetica diversa tra midollo e corteccia, che si mantiene in seguito a proliferazione cellulare intensa anche in piastra.

Esiste un'identità genetica specifica delle cellule staminali neurali, che dopo un certo stadio dell'embriogenesi è stabile in coltura. Si può controllare anche con altri marcatori, che si conosce essere espressi solo nella parte anteriore o posteriore del tubo neurale. Tramite rt PCR, si evidenzia che la parte anteriore esprime fattori trascrizionali cefalici, quali BF-1, Otx-1, Tbr-2 e Emx-2, mentre la parte posteriore non li esprime. Come atteso, Sox2 risulta espresso in entrambi. Le neurosfere coltivate dalla corteccia, in presenza o assenza di G-418, esprimono marcatori anteriori, al contrario di quelle dissociate dal midollo. Fa eccezione Emx2, per cui viene persa in vitro una limitazione dell'espressione.

Plasticità dell'identità regionale

Neurosfere di staminali neuronali cefaliche, piastrate con estratto di cervello ventrale, attivano geni ventrali. Quindi, l'identità regionale risulta essere plastica. Se fornisco stimoli o citochine di un certo tipo, come nel caso di un espianto di cervello ventrale, posso cambiare l'identità regionale.

Meccanismi di specificazione dell'identità neuronale

All'interno del midollo spinale sono presenti neuroni di tipi diversi. Tra questi, i neuroni motori mandano proiezioni che si accrescono durante l'embriogenesi fino a sinaptare in corrispondenza della placca neuromuscolare, dove danno il segnale per la contrazione del muscolo. Si trovano nella porzione ventrale del midollo, nelle regioni dorsali invece si trovano i corpi cellulari degli interneuroni che ricevono input dai neuroni sensoriali dalla periferia e che proiettano i propri assoni sui neuroni motori.

Sono stati compiuti esperimenti sul tubo neurale embrionale, che hanno messo alla luce quali potessero essere i segnali che innescano la specificazione dei neuroni lungo l'asse dorso-ventrale. È stata rimossa la notocorda o aggiunta ectopicamente per chiarire quale fosse il suo ruolo nella differenziazione. La sua rimozione precoce compromette la generazione dei neuroni da parte del tubo neurale, mentre l'aggiunta di una notocorda secondaria in posizione diversa causa il differenziamento di un set secondario di neuroni motori. Non tutte le cellule diventano neuroni motori, solo un set simmetrico avvia la crescita di assoni, esprime marcatori specifici e si accresce a una distanza prefissata dalla notocorda. L'ipotesi è che la notocorda produca un morfogeno, una molecola segnale, che in modo concentrazione dipendente, istruisce le cellule del tubo neurale a diventare neuroni di un certo tipo, in particolare motoneuroni.

Occorre quindi identificare quale molecola solubile veniva prodotta dalla notocorda. Viene condotta un'ibridazione in situ con sonda diretta contro mRNA di Shh (Sonic hedgehog), che codifica per una molecola solubile, ligando del recettore PTC, che in assenza di Shh inibisce SMO. Quando l'interazione avviene, PTC dereprime SMO, permettendo la traslocazione nel nucleo del fattore di trascrizione Gli, prima citoplasmatico, permettendo l'attivazione dei geni responsivi a Gli.

L'unico territorio che esprime il gene è la notocorda e la porzione ventrale del tubo neurale, il floor plate. Shh diffonde diminuendo la sua concentrazione man mano che ci si allontana dalla sorgente. Concentrazioni decrescenti del morfogeno attivano differenzialmente programmi genetici in senso dorso-ventrale nel tubo neurale, allo stadio di cellule ancora indifferenziate: dal ventre, interneuroni V3, neuroni motori, interneuroni V2 e V1.

Mettendo in coltura cellule del tubo neurale precoce, non differenziate, in presenza di concentrazioni progressivamente crescenti di Shh, si osserva che le diverse concentrazioni innescano in vitro il differenziamento di neuroni che avevano le stesse caratteristiche di quelli osservati in vivo: a concentrazioni basse V1, a seguire V2, neuroni motori e interneuroni V3. Quindi, si deduce che la concentrazione di Shh agisce sui progenitori neuroepiteliali nella specificazione.

Viene indagato il meccanismo dell'espressione genica nel tubo neurale nelle prime fasi dello sviluppo tramite ibridazioni in situ e immunofluorescenze, le quali hanno evidenziato geni candidati mediatori dell'azione di Shh. I geni sono espressi in modo diversificato lungo l'asse del tubo. Ad esempio, Pax7 è espresso nella porzione dorsale ma non ventrale, Dbx2 nella banda mediana, Inx3, Pax6. I diversi fattori sono espressi in modo diversificato in territori mutualmente esclusivi, oppure ci sono territori che esprimono due fattori, come nel caso di pax6 e nkx6.1 che hanno un dominio di sovrapposizione.

Questo comporta che i diversi territori siano caratterizzati da combinazioni diverse di fattori trascrizionali, che possono essere un codice che istruisce le cellule ad attivare programmi di espressione genica diversi, portando al differenziamento in neuroni diversi. Questi geni vengono divisi in: classe 1, attivi in posizione dorsale, o classe 2, attivi nelle porzioni ventrali. Shh attiva geni di classe 2, mentre reprime geni di classe 1. Nel corso dello sviluppo, i diversi fattori trascrizionali sono prima espressi secondo gradienti, successivamente, rimanendo allo stadio indifferenziato del neuroepitelio, i gradienti diventano confini.