1. Genetica dello sviluppo e del differenziamento, introduzione e tecniche

Introduzione

Lo sviluppo parte da un nucleo diploide e porta a un individuo completo, formato da cellule di diverso tipo, organizzate nello spazio. Sviluppo e differenziamento della cellula, nello sviluppo è compreso l'aumento del numero di cellule, secondo proliferazione controllata. Differenziamento: da cellule non specializzate a cellule specializzate e differenziate fra loro. Occorre l'attivazione di geni che caratterizzano uno specifico tipo di cellula, allo stesso modo bisogna spegnere i geni non inerenti con quel particolare tipo cellulare. Nel corso dello sviluppo ci sono diverse tendenze degli eventi, da poche cellule a molte che si differenziano e si diversificano, in primis nei 3 foglietti embrionali, mesoderma, ectoderma e endoderma, che si differenziano dalla gastrula e nelle cellule germinali. A questo punto le cellule seguono diversi destini progressivi, oltre al mantenimento di cellule staminali che conservano il carattere indifferenziato, servono per la...

Rigenerazione in diversi tessuti. Ci sono cellule staminali anche nel cervello, nel giro dentato dell'ippocampo e nella zona sottoventricolare del telencefalo che si differenziano in neuroni olfattivi, è un'attività staminale limitata nello spazio e per il tipo di cellula prodotta (molti più neuroni possibili da fare), la presenza di cellule staminali potrebbe essere sfruttata e stimolata a differenziare in più tipi di neuroni? Ad ora ancora no.

Le cellule germinali sono già divise nelle prime fasi dello sviluppo, dalla massa delle altre, alla base dell'allantoide si definiscono poche cellule che andranno a migrare nelle creste genitali e che si differenzieranno in cellule germinali maschili o femminili.

Durante il corso vengono trattate fasi dello sviluppo tardivo di topo, un modello in cui è possibile indurre mutazioni patologiche e mirate utilizzando il gene-taregting, ottenendo un fenotipo patologico molto simile all'uomo.

sviluppo corretto dell'organismo. Inoltre, durante lo sviluppo, avvengono anche processi di apoptosi, cioè la morte programmata delle cellule, che contribuisce alla modellazione degli organi e dei tessuti. Durante lo sviluppo, le cellule si differenziano in tipi cellulari specifici attraverso l'attivazione o l'inattivazione di specifici geni. Questo processo è regolato da segnali chimici e molecole segnale che agiscono come interruttori per attivare o disattivare i geni. Inoltre, le cellule devono anche migrare verso il loro posizionamento corretto nel corpo. Questo avviene attraverso segnali chimici che guidano le cellule verso la loro destinazione finale. Ad esempio, durante lo sviluppo del sistema nervoso, i neuroni devono migrare verso le loro posizioni specifiche per formare circuiti funzionali. Le cellule staminali svolgono un ruolo fondamentale nello sviluppo e nella rigenerazione degli organi e dei tessuti. Le cellule staminali possono differenziarsi in diversi tipi cellulari e possono essere utilizzate per la riparazione e la rigenerazione di tessuti danneggiati. In conclusione, lo sviluppo degli organismi è un processo complesso che coinvolge diversi aspetti cellulari e molecolari. L'organizzazione spaziale, la differenziazione cellulare, la migrazione e la rigenerazione sono tutti processi cruciali per lo sviluppo corretto degli organismi.

• sviluppo.signaling,1L'espressione genica presenta diversi livelli di regolazione, il primo evento è la trascrizione dei geni sul DNA in RNA, spesso si ottiene un trascritto primario, che può essere soggetto a splicing alternativo, verrà poliadenilato, verrà aggiunto il CAP, editato e trasportato dal nucleo al citoplasma, potrebbe essere anche un RNA non codificante, lo splicing alternativo, in particolare è oggetto di regolazione fine e permette la differenziazione dei prodotti genici.
• Il livello successivo è quello della traduzione, che permette una regolazione differenziale dell'output finale, a questo livello i miRNA regolano la traduzione, agendo sulla stabilità del RNA, la traduzione restituisce una proteina che può essere modificata post traduzionalmente.

TECNICHE PER LO STUDIO DELL'ESPRESSIONE GENICA

• Northern blot: Permette di visualizzare gli mRNA. L'mRNA totale di una cellula viene estratto e fatto migrare

su un gel di agarosio che separa i diversi mRNA in base al peso molecolare, la matrice di agarosio li separa rallentando nel gel gli mRNA più lunghi. In condizioni denaturanti la lunghezza dell'mRNA diventa l'unico parametro per la separazione, si evita la formazione di strutture secondarie. La distanza migrata è inversamente proporzionale al logaritmo del peso molecolare. Poi si fa un Blot su un filtro di nitrocellulosa, a cui si aggiunge sopra un agente assorbente e un peso. Il gel viene posto su un wick paper immerso in un tampone salino che aiuta il trasferimento dell'mRNA sul filtro di nitrocellulosa. L'mRNA che ha migrato passa sul filtro che poi viene portato ad alte T per la fissazione. Il filtro di nitrocellulosa viene poi messo a contatto con le sonde, in eccesso di DNA genomico che compete per il legame con le sonde. Le sonde sono oligonucleotidi di DNA o di RNA complementari al messaggero di interesse, le sonde devono essere marcate, ad esempio.con fosforo radioattivo.

Es. mi interessa il messaggero di Pax-6. Con un vettore di clonaggio clono il cDNA ottenuto a partire dall'mRNA di Pax-6. Si aggiungono dei promotori per RNA polimerasi sul filamento complementare al cDNA di Pax-6 nel vettore di clonaggio, così ottengo un trascritto di mRNA complementare all'mRNA del gene Pax-6.

Le sonde marcate legano l'mRNA complementare sul filtro di nitrocellulosa, solo se la complementarietà è estesa è stabile, vengono fatti dei lavaggi per rimuovere la sonda in eccesso o non appaiata completamente. Si lavora sulla salinità, abbassando la concentrazione salina dei lavaggi, le condizioni diventano più stringenti e rimangono solo gli ibridi con il messaggero di interesse. In altri casi preferisco una bassa stringenza ad es. perché voglio trovare tutti gli mRNA trascritti da geni relati tra di loro, non un solo mRNA.

Con il Northern blot posso investigare se l'mRNA di...

interesse si trova in diversi tessuti e in quali quantità (banda più o meno marcata), se una banda è più ampia, forse è perché ci sono forme di splicing diverse, mRNA di lunghezza diversa ma riconosciuti dalle sonde.

2- Fluorescence in situ hybridization (FISH)
Serve per visualizzare gli mRNA, in sezioni istologiche, ma anche su embrioni e organi interi. Anche in questo caso serve una sonda marcata che permetta di visualizzare il messaggero di interesse. La marcatura della sonda viene fatta inserendo un ribonucleotide marcato con la digossigenina, la sonda viene realizzata con la stessa tecnica di clonaggio in vitro vista per la Northern blot. Il tessuto, es. di embrione di zebrafish, deve essere trattato per la FISH, si usano dei detergenti per creare dei buchi nella membrana delle cellule, in seguito sono incubate con le sonde. Dopo diversi lavaggi, si aggiunge un anticorpo anti-digossigenina coniugato con l'enzima fosfatasi alcalina. Poi viene

aggiunto il substrato dell'enzima, un substrato cromogeno incolore, dove è presente l'enzima il substrato viene fosforilato e si forma un prodotto di colore blu che precipita nella cellula. In questo modo sono facilmente identificabili le cellule colorate dove è presente l'mRNA di interesse.

La tecnica FISH è stata utilizzata nello studio degli stadi precoci dell'embrione di Drosophila, ha permesso di vedere che le cellule embrionali hanno un trascrittoma molto diverso già agli stadi più precoci, si vedono delle bande colorate dei territori embrionali che preludono ai segmenti, che si formeranno solo dopo.

- RT-PCR (Reverse Transcription PCR)

A partire dall'mRNA estratto da una cellula si usa una trascrittasi inversa per retrotrascrivere il cDNA corrispondente, con il calore o con una RNAasi H viene eliminato il filamento di mRNA. In questo modo si ottiene una copia del cDNA di tutti gli mRNA della cellula oppure solo di alcuni.

Poi si usa la PCR per amplificare il cDNA. Posso usare un primer specifico per il gene di interesse, così ottengo il cDNA double strand che poi amplifico con i due primer e la Taq polimerasi. Con l'amplificazione esponenziale ottengo tante copie del cDNA, che alla fine posso analizzare con l'elettroforesi sul gel. 3- Microarrays È una tecnica molto utile per comparare l'espressione genica in due tipi cellulari o della stessa cellula in due stati diversi, es. di un embrione WT e di un embrione mutato. Per prima cosa si estraggono gli mRNA e si retrotrascrivono in cDNA tramite la trascrittasi inversa, i cDNA provenienti dai due tipi cellulari si colorano con due fluorocromi diversi, verde e rosso. I cDNA vengono ibridati su un chip per microarray, costituito da un insieme di sonde immobilizzate su un supporto solido, ciascuna sonda complementare con un diverso cDNA occupa un dot, possono esserci le sonde per tutti i geni espressi o solo per alcuni. Si incuba il chip per

microarray con la miscela di cDNA dei due tipi cellulari, in stessa quantità. Dopo l'ibridazione e il lavaggio si osservano i risultati sotto i raggi UV che eccitano i due fluorocromi, l'emissione colorata riflette abbastanza il numero di molecole di cDNA che si sono ibridate con le sonde. I dot gialli sono quelli in cui si sono ibridati cDNA provenienti da entrambi i tipi cellulari, vuol dire che un certo mRNA è espresso in entrambi i tipi cellulari, mentre i dot verdi e rossi sono quelli in cui solo il cDNA proveniente dall'uno o dall'altro tipo cellulare si è ibridato, quindi l'mRNA è espresso solo in una o nell'altra cellula. Ci sono anche dei dot con gradazioni diverse, la macchina è in grado di rilevare le percentuali relative di rosso e di verde, dando dei risultati semiquantitativi.

4- RNA Seq

Si basa sulle tecniche di next generation sequencing, il sequenziamento dà come risultato una serie di reads,

Cioè piccole sequenze di 20/30 nucleotidi. Si estrae dalla cellula l'mRNA, si purifica e si retrotrascrive con una trascrittasi inversa per avere il cDNA. Il cDNA deve essere frammentato, es. tramite sonicazione, si aggiungono ai frammenti di cDNA gli adaptors, cioè brevi sequenze che permettono di sequenziare l'insieme dei frammenti. La frammentazione può avvenire sull'mRNA o sul cDNA. Si ottiene una library (collezione di frammenti) che viene sequenziata tramite high-throughput sequencing. I reads ottenuti sono allineati sui genomi di riferimento presenti nei database, sappiamo dove vanno collocati e vediamo quanti reads ci sono in ogni regione. Troveremo regioni in cui ci sono più o meno reads, alcune regioni non hanno nessun reads, capisco che corrispondono a un introne o a una regione intergenica. Questa tecnica permette di sequenziare tutto ciò che è stato trascritto in mRNA, allineando i reads con un genoma di riferimento.

scopro tutto il trascrittoma della cellula in analisi, scopro introni e esoni, nuove