4. Genetica dello sviluppo e del differenziamento, lo sviluppo del tessuto muscolare

Tessuto muscolare

I geni responsabili dello sviluppo del tessuto muscolare sono stati scoperti e studiati con approcci diversi da quelli che sono stati usati per il tessuto ematopietico. Il tessuto muscolare si sviluppa a partire dai somiti, masse di cellule mesodermiche indifferenziate che si sviluppano di fianco al tubo neurale, disposte a intervalli regolari.

Sviluppo dei somiti

Nel corso dell’embriogenesi, il somite modifica la sua forma, si allunga in senso dorsoventrale inclinato di 45 gradi rispetto all’asse dorsoventrale. Le cellule mesodermiche dei somiti cominciano a differenziare, si individuano diverse regioni del somite le cui cellule formeranno tessuti diversi, alcune cominciano a migrare. I muscoli scheletrici insieme al derma derivano dalla porzione più dorsale del somite, mentre la cartilagine deriva dalla parte più ventrale. Quindi, a partire dal mesoderma dei somiti, si formano tre tessuti diversi.

Differenziazione del dermamiotomo

All’interno del dermamiotomo si evidenziano due regioni, entrambe formeranno muscolatura scheletrica: il dermamiotomo epassiale, più vicino al tubo neurale, da cui si formerà la muscolatura assiale, e il dermamiotomo ipoassiale, più lontano dal tubo neurale e più ventrale, da cui si formerà la muscolatura intercostale. In seguito, la parte più centrale del dermamiotomo differenzia per formare il derma, mentre dallo sclerotomo iniziano a migrare le cellule che formeranno la cartilagine.

Mioblasti e sviluppo muscolare

Le cellule del futuro muscolo scheletrico prendono il nome di mioblasti. Questi, in misura diversa, hanno un comportamento migratorio e si localizzano sul bordo ventrale del somite. Alcuni, come quelli che formeranno la muscolatura degli arti, iniziano a migrare lungo gli arti in formazione.

Segnali per la differenziazione

Il somite, fin dagli stadi più precoci, riceve segnali dai tessuti adiacenti: la notocorda, il tubo neurale e l’ectoderma di superficie rilasciano molecole di segnale che influenzano il comportamento del somite e inducono il differenziamento delle regioni con destino diverso.

Riprogrammazione dei fibroblasti a mioblasti e miogenesi in vitro

Per identificare i geni responsabili dello sviluppo del muscolo si sono utilizzate molto le cellule in coltura. Ad un certo punto si era scoperto che era possibile ottenere dei mioblasti a partire dai fibroblasti, rappresentava uno dei primi esperimenti di riprogrammazione. Si era visto che somministrando azacitidina a una linea cellulare di fibroblasti CH -10T1/2, che normalmente non fanno miogenesi ma proliferano, i fibroblasti venivano convertiti in mioblasti, cellule ancora indifferenziate. Se si sottraeva il siero di coltura che manteneva le cellule in proliferazione, le cellule smettevano di dividersi, come atteso, ma in più si allineavano come fanno i mioblasti durante la miogenesi normale formando dei cordoni, poi fondevano e formavano delle fibre muscolari vere e proprie.

La fibra muscolare infatti è un sincizio, in cui ci sono tanti nuclei appiattiti contro la membrana e le fibre contrattili, derivata da un programma differenziativo preciso caratterizzato dalla formazione del sincizio e dall'espressione delle proteine contrattili. L’azacitidina attiva nei fibroblasti questo programma differenziativo.

Meccanismo dell'azacitidina

L’azacitidina è un nucleoside modificato, in cui il ribosio porta una citidina, una base azotata simile alla citosina, ma che non può essere metilata. La metilazione della citosina è alla base del meccanismo di metilazione delle isole C G nei promotori dei geni. Nelle cellule in divisione, l’azacitidina viene internalizzata durante la duplicazione del DNA al posto della citosina ma non può essere metilata, per cui c’è una globale demetilazione del DNA nei fibroblasti che porta all’attivazione del programma genetico miogenico.

Identificazione dei geni miogenici

L’ipotesi era che la riprogrammazione miogenica dei fibroblasti fosse dovuta all’attivazione di uno o più geni, quindi questo esperimento rappresentava uno strumento importante per identificare quali geni fossero necessari per attivare il programma di differenziamento dei mioblasti. Si ipotizzava che fossero i geni responsabili anche del differenziamento durante lo sviluppo.

L’obiettivo era individuare gli mRNA, quindi i geni, che fossero espressi differenzialmente nei fibroblasti convertiti a mioblasti rispetto ai fibroblasti normali. Per prima cosa, si sono isolati gli mRNA delle cellule 10T1/2 trattate e non trattate con azacitidina, si sono retrotrascritti gli mRNA delle cellule trattate per ottenere il cDNA che poi si è fatto ibridizzare con gli mRNA delle cellule non trattate, presenti in eccesso per avere la saturazione.

Dall’ibridazione si ottengono dei cDNA delle cellule trattate ibridizzati con gli mRNA delle cellule non trattate, che corrispondono ai geni trascritti in entrambe le cellule, e dei cDNA delle cellule trattate non ibridizzati perché l’mRNA complementare non è presente nelle cellule non trattate, che corrispondono ai geni trascritti solo nelle cellule trattate. In seguito, sono stati separati gli ibridi a doppio filamento dai filamenti singoli. I cDNA non ibridati sono stati convertiti in double strand per la clonazione e per generare delle sonde utilizzate per lo screening di una library di cDNA retrotrascritti a partire dalle cellule trattate, in modo da avere il cDNA delle cellule trattate con tutta la sequenza codificante di ciascun gene. Sono stati individuati alcuni geni tra cui Myo A, MyoB, Myo C e Myo D.

MyoD e la sua importanza

A questo punto si voleva capire quali di questi geni fossero necessari per la conversione dei fibroblasti in mioblasti. I singoli geni e diverse combinazioni, sotto forma di cDNA sotto il controllo di un promotore forte, sono stati transfettati in cellule 10T1/2 per vedere in quali casi venisse innescato il programma miogenico. In questo modo si è scoperto che ne bastava uno, MyoD, per avere l’attivazione del programma e la conversione a mioblasto.

È stata una scoperta importante, perché è stato il primo caso in cui si è visto come un gene regolatore codificante per un fattore trascrizionale potesse innescare in una cellula già differenziata in altro un intero programma genetico che dà origine a fibre muscolari identiche a quelle fisiologiche. MyoD da solo è capace di innescare la riprogrammazione.

Funzionamento di MyoD

MyoD codifica per un fattore trascrizionale con dei domini HLH (helix-loop-helix) responsabili del legame con il DNA, è il dominio che dà la specificità di legame del fattore trascrizionale a delle sequenze consenso sul DNA chiamate E-boxes. MyoD ha degli omologhi, che sono stati scoperti trovando gli mRNA omologhi con un peso diverso da quello di MyoD, in particolare sono stati identificati tre omologhi: miogenina, Myf 5 e MRF4, in cui il dominio HLH è conservato, costituiscono i principali fattori trascrizionali miogeni.

Oltre che per il legame con il DNA, i domini HLH sono importanti per la dimerizzazione dei fattori trascrizionali, che possono formare omo e eterodimeri di diverso tipo. Il dimero di MyoD che lega il DNA è, ad esempio, un eterodimero formato da MyoD e E12, un’altra proteina con dominio HLH. L’eterodimero è in grado di legare il DNA e, insieme ad altri fattori, di attivare la trascrizione dei geni muscolari. Quando si sottrae il siero dalla coltura di fibroblasti convertiti in mioblasti, l’eterodimero lega il DNA e vengono trascritti i geni che determinano il differenziamento in fibra muscolare.

Nelle cellule proliferanti, MyoD e E12 dimerizzano con un’altra proteina Id, con un dominio HLH. In questo caso, l’eterodimero manca di un dominio basico importante per il legame con il DNA.