4. Genetica dello sviluppo e del differenziamento, lo sviluppo del tessuto muscolare

Un altro fattore interessante era Pax3

tra i primi geni attivati nel somite in vivo e in vitro dopo il trattamento con le molecole segnale. Ci si chiedeva se l'attivazione di Myo D passasse attraverso questo fattore di regolazione: realizzando dei retrovirus con il gene Pax 3 si è visto che una volta espresso nelle cellule del somite, veniva attivato anche Myo D e veniva avviata la miogenesi. Quindi l'espressione di Pax 3 determina l'avvio del programma miogenico indipendentemente da altri segnali esterni.

Si è visto che l'espressione ectopica di Pax 3 induce l'attivazione di Myo D e della miogenesi anche nei fibroblasti del derma e in espianti della porzione dorsale del tubo neurale, cioè anche in altri tipi cellulari non commited nell'embrione.

Esperimenti in sistemi di mammiferi

Se e dove erano espressi i geni miogenici, messi in evidenza con gli studi su altri modelli animali, MyoD e i suoi omologhi, tutti (Myf5, Miogenina e Mlf-4)

sono espressi fin da stadi precoci dello sviluppo embrionale nel topo, al giorno 8 viene espresso Myf5, subito dopo miogenina, ci troviamo ancora in stadi precoci in cui i somiti sono presenti, ma immaturi, al giorno 9 viene espresso Mlf4 e per ultimo MyoD al giorno 10.5. Precocemente MyoD e Myf5 sono espressi in linee cellulari differenti, vengono a crearsi diversi territori d'espressione, successivamente MyoD viene espresso nella maggior parte delle cellule Myf-5, questo può essere osservato tramite un KI di lacZ in Myf5 in eterozigosi. Si è proceduto a mutare i geni residenti MyoD e Myf5, il restituisce come fenotipo, un topo KO di MyoD, che sviluppa una muscolatura normale, il gene sembrava non necessario alla miogenesi in vivo, si osservava solo un ritardo di 2 giorni nello sviluppo degli abbozzi degli altri, in questi embrioni il gene Myf5 funzionava di più. Si ipotizza quindi, che fosse Myf5 ad avere un ruolo essenziale nella miogenesi in vivo, il KO di.Myf5, in homozygosity, resulted in a normal adult with normal skeletal muscle, with small defects including a delay in the generation of intercostal and spinal muscles, due to embryonic formation of myocytes, which occurred only on day 10.5 (normally earlier), but it was not a disabling mutation. These studies did not show strong in vivo myogenic evidence of these genes. At this point, double mutants are studied, obtained through many subsequent crosses, the double mutant MyoD-/- Myf5-/- lacked myoblasts and consequently muscles, myogenesis did not occur, and there was also no expression of myogenin. From this, it is deduced that MyoD and Myf5 act redundantly, in the absence of one, the other compensates for its function, while if both are missing, no other gene can compensate for their function and the embryo does not develop muscles. The KO phenotype in mice is the formation of myoblasts, but not their fusion., Myf5 e MyoD sono tre proteine coinvolte nello sviluppo del muscolo. La miogenina è responsabile della differenziazione delle fibre muscolari e il suo differenziamento terminale viene a mancare nelle fasi più avanzate dello sviluppo muscolare. Gli esperimenti successivi hanno cercato di chiarire le relazioni tra Myf5, MyoD e miogenina nello sviluppo muscolare. Nel topo doppio mutante miogenina-/- Myf5-/- si osserva una mancanza di mioblasti, mentre nel topo Myf5-/- si sviluppa una muscolatura normale. Si ipotizza che la miogenina possa svolgere la funzione di Myf5 quando quest'ultimo manca, esprimendola sotto il controllo delle sequenze regolative di Myf5. Il doppio mutante MyoD-/- miogenina-/- forma mioblasti che si fondono per formare una muscolatura quasi normale, ma con volume ridotto. Tuttavia, non si osserva uno sviluppo post-natale normale e questo genotipo è letale alla nascita.sostituisce in parte la funzione di Myf5, ma solo se è espressa dal locus Myf5, controllata dalle sue sequenze regolative, attive precocemente nel differenziamento, va bene anche un membro diverso della famiglia, ma deve essere espresso al momento giusto dello sviluppo embrionale. Ma un KI di miogenina su Myf5, può complementare la funzione del gene miogenina stesso, quando questo è deleto? Il topo con questo fenotipo, produce miogenina al posto di Myf5, ma non produrrà miogenina dal gene miogenina, questo topo presenta lo stesso fenotipo dato dal KO di miogenina, l'espressione precoce di miogenina non sostituisce l'espressione della stessa al termine dello sviluppo. Secondo il primo modello del MyoD è necessario uno tra MyoD e Myf5, per indurre il controllo della miogenesi, formazione iniziale dei mioblasti, se sono entrambi assenti, i mioblasti non si formano, la funzione di Myf5 può essere esplicata in parte anche dal KI di miogenina in Myf5.mentre il differenziamento terminale è portato avanti da miogenina, senza la quale il differenziamento non è possibile. La ridondanza tra MyoD e Myf5 è stata studiata, come uno dei primi casi in cui è stato messo in evidenza un fatto diffuso, in questo caso riguardava geni molto omologhi, una probabile spiegazione può essere data dal fatto che, geni simili, possano legare sul DNA sequenze targeting molto simili, anche se non completamente e con affinità diverse, è una ridondanza funzionale, ma si ricordi che questi geni determinano ognuno una popolazione cellulare distinta, una popolazione può complementare l'assenza dell'altra? Viene condotta un'ablazione in vivo delle cellule che esprimono Myf5, tramite modificazioni mirate del locus, viene impiegato un KI del gene cre, nel locus Myf5, nel locus del gene R26 espresso ubiquitariamente, viene inserito un gene suicida, che codifica per una tossina potentissima, che uccide.lacellula che la produce, il promotore è separato dal gene, da una sequenza di STOP, fiancheggiata da due siti Lox, che non permette la trascrizione della tossina, a meno che non venga eliminata, quando la mutazione suicida si trova nello stesso topo che porta il KI di cre nel locus Myf5, viene trascritto il gene suicida, nelle cellule che esprimono Myf5, che vengono uccise, in questo modo il fenotipo dell'animale, descrive l'effetto della mancanza delle cellule esprimenti Myf5. In un altro locus ubiquitariamente attivo, viene costruito un (fosfatasi alcalina), innocuogene reporter AP per la cellula, il cui prodotto può essere messo in evidenza tramite un saggio colorimetrico, il gene è preceduto da una sequenza di stop trascrizionale floxata, l'espressione di AP sarà rilevabile solo in presenza della ricombinasi cre, quindi le cellule Myf5, saranno visualizzate come AP+. L'incrocio tra cre e il gene reporter AP, permette di

Visualizzare il contributo estensivo delle cellule Myf5 alla muscolatura. L'incrocio sperimentale, che genera topi che portano il KI di cre su Myf5, gene reporter AP e KI del gene suicida su R26, mostra la perdita completa delle cellule AP, ovvero Myf5, che sono state uccise dallatossina, ma rimane la miogenesi. Si nota inoltre un aumento dell'espressione di MyoD, una popolazione che non attiva Myf5, è in grado di sopperire alla sua funzione.

A questo punto viene indagata la tramite il KI di cre sotto il controllo del locus di funzione di miogenina, miogenina, in un topo che porta questo allele e il gene suicida (come precedente), verranno uccise le cellule esprimenti miogenina. Questo si traduce nella mancanza di muscoli differenziati, già alla fine dello sviluppo embrionale, giorno 18.5. Miogenina è richiesta comunque, anche se ci sono lineage diversi, entrambi la richiedono. L'attivazione del gene suicida porta a una compromissione muscolare.

generalizzata. È stato utilizzato per comprendere maggiormente la funzione di Myf5, la ridondanza, già KI di LacZ su Myf5, indagata è un fenomeno evolutivo, l'evoluzione ha portato a mantenere le famiglie di fattori trascrizionali, ma allo stesso tempo a differenziarli leggermente, fino al punto in cui acquisiscono funzioni diverse, come il caso della miogenina. Il KI di LacZ è stato studiato in omozigosi e eterozigosi, in topi Myf5-/- LacZ+/+ e topi Myf5+/- LacZ+/-, LacZ colora le cellule in cui è espresso, l'espressione è valutabile a singola cellula, si è andati a comparare la distribuzione di LacZ, nel topo eterozigote (possiede un allele Myf5), e omozigote, nel corso della differenziazione del somite, nella fase in cui vengono determinati i mioblasti e diventano precursori delle cellule muscolari, nell'ambito del miotomo. Nel topo eterozigote, cellule blu (LacZ) migrano dal dermomiotomo, a formare il miotomo e si allineano

sul lato ventrale del somite, nel topo omozigote invece, le cellule blu, migrano in modo aberrante, si fermano ai bordi del dermomiotomo e si localizzano in zone in cui le cellule normali non sono mai visualizzate. È un fenotipo precoce, che si osserva prima della formazione della fibra muscolare. Poco dopo, queste cellule attivano dei geni scorretti. Le cellule che si sono localizzate nello sclerotomo attivano scleraxis, che non è attivo nel muscolo ma nella cartilagine. Le cellule nella regione sottoectodermica (dorsali) attivano dermo-1, che codifica per un fattore attivo nel derma. Le cellule che attivano Myf5 inizialmente sono multipotenti. Se Myf5 viene deleto, rispondono in modo aberrante ai segnali provenienti dalle cellule circostanti e migrano in maniera inappropriata. Nelle nuove sedi, rispondono a nuovi segnali, differenziando a cartilagine e altri tipi di cellule, dove Myf5 si spegne. In assenza di Myf5, la differenziazione muscolare è bloccata. Pax3 si attiva.

Precocemente nel giovane somite, in risposta a segnali molecolari dell'ambiente embrionale che inducono la miogenesi, l'inserzione di Pax3 poteva indurre la miogenesi senza la presenza di segnali esterni. Il KO di Pax3 esiste in natura, come mutazione spontanea, che genera il topo che manca dei splotch, muscoli dell'arto. L'eterozigote presenta macchie bianche nel mantello, questo è dovuto a difetti nella migrazione dei melanoblasti, che originano dalle creste neurali, compartimentalizzate in senso antero-posteriore.

Il trapianto di somiti laterali (che contengono l'abbozzo dell'arto) di topo nell'embrione di pollo, dava origine al muscolo. I mioblasti possono essere resi visibili, utilizzando mioblasti provenienti da un topo con KI di LacZ su Myf5. Se i somiti venivano prelevati da un topo che oltre a portare il marcatore LacZ in eterozigosi, mancavano di Pax3 in omozigosi, non si osserva migrazione dei mioblasti (blu) nell'arto, la

e alla perdita di Pax3. Questo topo presentava una migrazione anomala dei progenitori muscolari durante lo sviluppo. Questa scoperta ha fornito ulteriori chiarimenti sulla funzione di Pax3 nel corretto sviluppo muscolare.