Appunti completi per l'esame di Biologia Cellulare

Il ciclo cellulare

Il ciclo cellulare è il processo universale attraverso cui le cellule si riproducono e da cui dipende l’accrescimento e lo sviluppo di tutti gli organismi pluricellulari. Il concetto di cellula è stabilito fin dalla metà dell’800, ma come le cellule si dividessero rimase un’idea confusa fino al 1880 quando Flemming visualizzò i cromosomi al microscopio. È negli anni ‘50 con la scoperta del DNA che si chiariscono gli eventi che controllano il ciclo cellulare, in particolare attraverso studi autoradiografici si dimostrò che la replicazione del DNA avviene in una precisa fase chiamata fase S.

Le fasi del ciclo cellulare

In totale il ciclo cellulare si compone di 4 fasi:

• G1 = Crescita e preparazione alla replicazione del cromosoma
• S = Sintesi di DNA
• G2 = Preparazione alla mitosi
• M = Mitosi

Il ciclo cellulare deve essere considerato come una sequenza di eventi organizzati nel tempo. I vari eventi sono legati tra loro e quelli più tardivi non si attuano se non sono stati correttamente completati gli eventi precedenti.

Meccanismi di controllo del ciclo cellulare

Negli ultimi 20 anni una delle domande fondamentali della biologia cellulare è stata quali fossero i meccanismi che controllano e regolano la divisione cellulare. La risposta a questa domanda ha richiesto molti anni di ricerca su differenti organismi modello, ognuno dei quali con particolari vantaggi sperimentali, e impiegando numerose tecniche.

Fattori di regolazione del ciclo cellulare

Le prime evidenze che alcuni fattori agenti in trans regolassero il ciclo cellulare provenivano da esperimenti di fusione cellulare con cellule di mammifero in coltura. Le uova e gli embrioni precoci di Xenopus sono un sistema particolarmente adatto allo studio del ciclo cellulare, in particolare poiché si possono preparare estratti proteici da essi per studi biochimici. L’MPF (Maturation Promoting Factor) controlla l’entrata degli ovociti di Xenopus in meiosi così come controlla l’entrata delle cellule embrionali in mitosi. Un altro importante esperimento dimostra come il citoplasma di cellule di mammifero ferme in mitosi, iniettato in ovociti di Xenopus fermi in G2, porti alla maturazione di questi senza l’aggiunta di progesterone. Queste indicazioni suggeriscono che l’MPF controlli l’entrata degli ovociti in meiosi e quella delle cellule somatiche in mitosi, per cui MPF è diventato l’acronimo di Mitosis Promoting Factor.

Il ruolo delle cicline

La composizione molecolare di questo MPF deriva dagli studi pioneristici di Masui. Una parte si concentra su studi di carattere biochimico in embrioni di riccio di mare, volti all’identificazione di quelle proteine la cui sintesi segue l’attivazione dell’MPF. In questa maniera sono state isolate una serie di proteine denominate cicline. Parallelamente sono stati eseguiti esperimenti in lievito di genetica e di biologia molecolare per scoprire la subunità catalitica dell’MPF.

Il livello di queste proteine sale e cresce in concomitanza di determinati stadi del ciclo cellulare. La concentrazione di cicline mitotiche è massima durante la fase M, ma decresce in anafase, per poi essere accumulate durante l’interfase seguente. Il comportamento di queste proteine è dovuto al fatto che esse sono specificatamente degradate in momenti diversi del ciclo cellulare. Tutte le cicline contengono una sequenza omologa presso l’N-terminale, chiamata destruction box. Forme mutanti di cicline che mancano per la destruction box non vengono più degradate.

Modelli di studio: i lieviti

Per utilizzare i lieviti come modello di studio sono stati per prima cosa isolati dei mutanti chiamati cdc ovvero “cell division cycle”. Si tratta di mutanti temperatura sensibili, cioè capaci di crescere a T di 25°C, ma non a temperature più elevate. Mutanti diversi si mostrano bloccati in punti specifici del ciclo cellulare e distinguibili in base alla morfologia (ad esempio in Cerevisiae le dimensioni della gemma indicano uno stadio specifico del ciclo).

Questo approccio genetico fu iniziato su S. cerevisiae da Lee Hartwell e poi da P. Nurse su S. pombe. S. pombe si riproduce per scissione e l’entrata in mitosi è finemente regolata ed è correlata alle dimensioni cellulari. L’identificazione dei mutanti cdc e l’isolamento dei corrispondenti geni “wild type” è avvenuta mediante trasfezione di librerie genomiche di lievito all’interno dei mutanti. Attraverso gli esperimenti di complementazione si è riusciti a isolare il gene che recuperava il fenotipo di quelle cellule che presentavano il blocco della proliferazione. Cellule mutanti quindi continuavano ad accrescersi ma non si dividevano.

Un altro tipo di mutanti denominati wee, si dividevano prima del previsto, e questo indicava l'implicazione di ulteriori geni. Isolato il plasmide ricombinante si analizzò il frammento di DNA contenuto nel plasmide, e si verificò che si trattava di una chinasi. In questa maniera si isolò la prima chinasi ciclina dipendente. Il gene fu chiamato cdc2 per quanto riguarda S. cerevisiae e cdc28 nel S. pombe. Furono ottenuti anticorpi contro tale proteina e fu possibile eseguire esperimenti di immunoprecipitazione, che oltre a confermare l'attività chinasica della proteina, dimostrarono anche che l'immuno precipitato non conteneva solo la proteina chinasica, ma anche una ciclina.

Una volta identificata la chinasi ciclina dipendente gli studi si sono rivolti verso gli eucarioti superiori, e la distanza evolutiva complicava non poco la strategia di lavoro. Fortunatamente la grande conservazione della proteina permise di utilizzare la medesima strategia di complementazione (utilizzando ovviamente una banca genomica umana) e ottenere nuovamente la proteina e il gene di interesse. Una volta sequenziato anche il gene umano, si vide che la conservazione della similitudine aminoacidica raggiungeva il 63% fra lievito e uomo. La chinasi umana fu chiamata cdk1, e si dimostrò in grado di sostituire funzionalmente quella di lievito. Il gene era quindi conservato sia dal punto di vista strutturale che funzionale.

Conservazione del meccanismo di controllo

Come detto negli esperimenti di immunoprecipitazione con anticorpi contro cdc2 si isolava anche una proteina di 45KD che era una ciclina. Fu isolato anche il gene richiesto per la traduzione di tale proteina e venne identificato come cdc13, una ciclina necessaria per l'entrata in mitosi. Divenne quindi evidente che l'MPF era un eterodimero composto da una ciclina e da una chinasi. Le CDK sono i regolatori del ciclo cellulare, e regolano non solo l'entrata in mitosi, ma anche l'entrata in fase S. Anche le altre fasi richiedono cicline per poter avviarsi, e si è visto che tutta una batteria di cicline entrano in gioco nelle diverse fasi e sono specifiche per ciascuna di esse. Questo è importante per permettere di dirigere l'attività di fosforilazione su determinati substrati, modificando la specificità di substrato delle chinasi. Questi elementi base del ciclo cellulare sono conservati in tutti gli eucarioti ed hanno perciò un’origine che risale alla comparsa della cellula eucariotica, 1500-2000 milioni di anni fa.

Regolazione del complesso MPF

In seguito sono stati scoperti ulteriori geni che regolano l'attività dell'MPF, soprattutto la sua attivazione all'inizio dei processi mitotici o nel checkpoint G2, durante il quale si ha un grosso accumulo di MPF, ma che deve rimanere temporaneamente silente. Sempre nel lievito, in S. pombe, si individuarono i due principali geni di regolazione del complesso MPF ovvero Wee1 e cdc25. Questa regolazione del complesso cdc2/ciclina B vede il gene wee1 inibire l'attività del complesso, al contrario del gene cdc25 che attiva il complesso.

Fino a che il complesso deve essere mantenuto inattivo, si ha l'espressione del gene wee che codifica una chinasi che fosforila una tirosina in posizione 15 (aminoacido conservato sia in lievito che mammifero, cosa che suggerisce che oltre al complesso anche il meccanismo di regolazione sia conservato), e tale fosforilazione blocca il complesso. Infatti, la tirosina si trova dentro il sito catalitico della chinasi e dal momento che l'attività chinasica prevede l'impiego di ATP, la repulsione elettrostatica del gruppo fosfato portato dalla tirosina inibisce adesso l'entrata nel sito catalitico dell'ATP. La mutazione del gene wee causava il fenotipo omonimo in quanto il complesso MPF risulta sempre attivo e promuove costitutivamente l'entrata in mitosi.

Anche la treonina in posizione 161 sulla ciclina può venire fosforilata, dalla chinasi prodotta dal gene cak, ma questa fosforilazione è a carattere attivatorio in quanto sembra causi cambiamenti strutturali del complesso che favoriscono l'esposizione del sito catalitico. Entrambe le fosforilazioni avvengono in G2, in modo che il complesso sia inibito, ma facilmente attivabile. La fosfatasi cdc25 attiva invece il complesso MPF rimuovendo il gruppo fosfato sulla tirosina 15. Esperimenti di mutagenesi sito-specifica che sostituiscono la Tyr-15 in fenilalanina, che non può essere fosforilata, producono mutanti con fenotipo wee, poiché provocano un'attivazione costitutiva nel complesso MPF.

Target dell'azione chinasica dell'MPF

Una volta scoperto il meccanismo fondamentale di entrata in mitosi, una delle cose che si è cercato di comprendere è quali siano i target dell'azione chinasica dell'MPF. Alcuni sono stati scoperti, e fra questi sono le condensine, che determinano la condensazione della cromatina in cromosomi, le laminine, che causano la disgregazione della membrana nucleare, e anche proteine associate a microtubuli per permettere la formazione del fuso mitotico. È stato dimostrato che la fosforilazione delle laminine causa una depolarizzazione delle laminine e ciò porta a un cedimento strutturale della membrana nucleare.

Uscita dalla mitosi

L'altro punto importante è come la cellula esca dalla mitosi. L'idea è ovviamente che l'attività chinasica del complesso MPF debba essere inattivata, e sebbene inizialmente fosse stato ipotizzato un processo di defosforilazione, non è così, e la sua inattivazione viene causata dalla distruzione della ciclina. La disattivazione dell'MPF avviene in telofase. Nella cellula in metafase i cromatidi fratelli sono tenuti uniti da dei complessi proteici, le coesine, fino al momento di passaggio in anafase dove verranno degradati. Dopodiché i cromatidi possono migrare ai poli cellulari. Le coesine vengono distrutte da un enzima chiamato separasi, che deve agire in un momento preciso, e viene mantenuta inibita da un inibitore chiamato securina, detto anche inibitore anafasico.

L'APC, un complesso proteico denominato Anafase Promoting Complex, ha una funzione duplice. Viene attivato attraverso una fosforilazione da parte dell'MPF (che ha il suo massimo di attività in metafase) e una volta attivato in anafase esplica un’attività di ubiquitina ligasi e provoca poli-ubiquitinazione della securina inducendone la degradazione attraverso il proteosoma. Di tal maniera si attiva la separasi. Oltre a questa funzione, appena la cellula passa da anafase a telofase, l'APC va a ubiqutinare la ciclina B dell'MPF disattivando l'intero complesso. L'ubiquitinazione della ciclina avviene per legame di una coda di ubiquitine su un residuo portato nei pressi di una regione particolare della ciclina denominata destruction box. La bassa concentrazione di MPF che si ha in telofase blocca a sua volta l'attività dell'APC non fosforilandolo e questo costituisce un duplice controllo sull'uscita dalla mitosi. L'APC viene attivato oltre che dalla fosforilazione operata dall'MPF, anche per interazione con un coattivatore che prende il nome di Cdc20 che fa in modo che l'APC sia attivato solo nel momento in cui tutti i cinetocori siano correttamente legati ai bracci del fuso mitotico.

Sistemi di controllo del ciclo negli eucarioti

Tutte le cellule eucariotiche condividono meccanismi di divisione cellulare estremamente simili, e gli studi effettuati su S. pombe hanno permesso di isolare i geni omologhi sia in Xenopus che in mammiferi. Il passo successivo è stato quindi quello di individuare gli step che regolano il controllo dell'entrata in fase S. Il punto di restrizione è il momento in cui le cellule dei mammiferi sono indirizzate a entrare in fase S. La fase G0 è una fase di senescenza, e precede la fase G1 nella quale la cellula si prepara ad entrare nella fase S.

La fase G1 si divide in precoce e tardiva. Le due fasi sono separate proprio dal punto di restrizione. La fase precoce necessita di segnali esterni, i fattori di crescita per proseguire fino al punto di restrizione, passato il quale, si slega dalla loro presenza per proseguire nella fase tardiva. Se il passaggio da fase G0 a G1 era bidirezionale, ovvero una cellula in G0 poteva passare in G1, ma anche il contrario, il punto di restrizione è invece irreversibile. I fattori di crescita si legano a recettori di membrana che attivano le chinasi dette MAPK, che scatenano una cascata di segnale che porta all'avvio di specifici programmi genetici che permettono il passaggio del punto di restrizione.

Disregolazione del ciclo cellulare

La disregolazione del ciclo cellulare è un fatto molto grave, in quanto comporta la comparsa di molte malattie differenti, fra cui il cancro, che nei paesi industrializzati causa 1 morte su sei. I processi molecolari che regolano gli eventi principali del ciclo cellulari sono simili in tutte le cellule eucaristiche e questo è stato dimostrato in molti modelli animali. Anche la duplicazione cellulare è controllata andando a regolare la collocazione temporale di due eventi critici, la duplicazione del DNA nucleare e la mitosi.

Ripresa del ciclo cellulare

Spostiamo la nostra attenzione alle cellule di mammifero in coltura analizzando quali sono i fattori che, una volta terminata la mitosi, necessari alla proliferazione, continuando il ciclo in fase S, G1 e poi G2. Cellule in coltura tendono a confluire in un monostrato, formato da cellule che competono per i fattori di crescita contenuti nel siero. A questo punto quindi terminano i cicli replicativi, che possono essere fatti partire nuovamente con aggiunta di siero nuovo al mezzo di coltura. Se le cellule escono dal ciclo cellulare entrano in una fase quiescente chiamata G0, mentre se continuano a proliferare e continuano con una nuova fase G1. In fase G0 le cellule possono permanere per giorni e settimane, addirittura per tutto il resto della vita dell’organismo. Al momento della ripresa del ciclo esse ripartiranno direttamente dalla fase S.

Fattori di crescita e ciclo cellulare

La ripresa del ciclo dipende da fattori esterni come abbiamo visto. Durante la fase G1, molto importante, la cellula si prepara ad andare in fase S, e in questo periodo di preparazione deve effettuare molti controlli in quanto, una volta entrata in fase S, viene commissionata a portare a termine il ciclo e non può tornare indietro. La presenza dei fattori di crescita nel mezzo è il segnale di start del ciclo cellulare, e se permangono abbastanza a lungo nel mezzo, faranno sì che le cellule entrino nel ciclo proliferativo anche se essi vengono poi rimossi dal mezzo stesso. Infatti se i fattori di crescita sono presenti abbastanza a lungo da far passare la cellula da una fase precoce di G1 a una fase tardiva di G1, oltrepassando un punto di controllo definito restriction point, la loro rimozione dopo questo evento è ininfluente per il proseguimento del ciclo. I fattori di crescita agiscono sulla cellula tramite recettori di membrana a sette passi collegati a una proteina G trimerica, o recettori legati a proteine tirosina chinasiche, dando via a una cascata di segnale intracellulare.

Via di RAS

La via di RAS, o delle MAPK, prevede il legame di un fattore di crescita con un recettore tirosina chinasico, e a questo proposito porteremo come esempio l’EGF. L’EGF si lega a un recettore, e questo causa la sua dimerizzazione con un secondo recettore sulla membrana. Tale dimerizzazione spinge i due recettori a fosforilarsi a vicenda. Questa fosforilazione rende disponibile il sito attivo della catena polipeptidica dalla parte interna della membrana e permette l’attivazione delle prime proteine della cascata di segnale. La prima proteina a legarsi alla catena attivata è una proteina adattatrice che si chiama GRB2. Viene definita adattatrice poiché questa proteina si lega tramite il dominio SH2 alla tirosina fosforilata del recettore, ma agisce senza fosforilare altre proteine. Invece contiene un dominio SH3 che permette l’ancoraggio di Sos. Sos è una proteina scambiatrice perché va a legare RAS permettendole di scambiare il GDP in GTP rendendola attiva. RAS attivata dà inizio a una cascata di fosforilazioni e quindi all’attivazione delle Map-kinasi (mitogen-activated protein kinases), le quali fosforilano fattori di trascrizione e quindi portano ad attivazione genica associata a proliferazione. Molte altre vie di segnalazione, con effetti differenti, sfruttano questa segnalazione. RAS stessa poi spegne la sua segnalazione autoregolandosi, tramite un’azione endogena di idrolisi del GTP in GDP, che la rende inattiva.

Geni a risposta precoce e tardiva

Dopo l’aggiunta dei fattori di crescita si ha la trascrizione di numerosi geni, che però possono essere suddivisi in due grandi classi:

• Geni a risposta precoce
• Geni a risposta tardiva

L’appartenenza all’una o all’altra classe dipende dalla velocità di comparsa dell’mRNA associato. Dopo l’aggiunta del siero si ha una subitanea comparsa degli mRNA propri dei geni a risposta precoce, mentre i geni a risposta tardiva iniziano a comparire circa due ore dopo l’aggiunta del siero. Il lag della risposta è dovuto al fatto che per i geni a risposta precoce sono già presenti le proteine associate ai fattori di trascrizione, le quali necessitano solo di essere attivate dalla via di Ras. Una riprova di questo sta nel fatto che l’induzione dei geni a risposta precoce, che avviene dopo pochi minuti dopo l’aggiunta dei fattori di crescita.