Appunti completi di microbiologia

Batteriologia struttura batterica

I batteri sono costituiti da:

• Capsula: componente polisaccaridica, non sempre presente in tutti i batteri con varie funzioni tra cui quella di adesione;
• Parete cellulare: parete rigida costituita da un complesso macromolecolare detto peptidoglicano;
• Membrana plasmatica: bilayer fosfolipidico con proteine associate;
• Al di sotto della membrana si trova il citoplasma (o citosol) che è un ambiente molto meno strutturato rispetto a quello di una cellula eucariotica. Infatti, non è presente una membrana nucleare ma è sostituita da un nucleoide, cioè una struttura con un certo livello di complessità che è costituita quasi sempre da un'unica molecola circolare di cromosoma batterico, meno spesso due. Nel citosol si trovano anche i ribosomi, vescicole di accumulo di materiale lipidico e polisaccaridico che costituiscono una sorta di riserva energetica per i batteri, e poi si trovano i plasmidi, cioè dei piccoli elementi di DNA circolare doppia elica che costituiscono elementi accessori del genoma batterico.

Dunque nel genoma batterico si ha un cromosoma superavvolto che costituisce il nucleoide (sono presenti delle proteine simil-istoniche che permettono il superavvolgimento del DNA) e poi altri elementi accessori extra-cromosomali detti plasmidi. Il plasmide è un elemento circolare molto più piccolo rispetto al cromosoma ma dotato di grande variabilità per quanto concerne la lunghezza in termini di paia di basi, si passa da elementi di circa 2000 bp a plasmidi estremamente più lunghi (200000 bp). Il cromosoma batterico è ancorato, in un punto preciso della sequenza, attraverso alcune proteine, alla parete cellulare e alla membrana plasmatica sottostante. Queste proteine di ancoraggio passano attraverso la membrana plasmatica, si legano al peptidoglicano e permettono la divisione cellulare allontanando le due copie di cromosoma simulando il fuso mitotico delle cellule eucariotiche. Le dimensioni di un cromosoma batterico sono variabili; ci sono batteri che hanno un genoma complesso che può arrivare fino a 6-7 milioni bp. D'altra parte, c'è il caso estremo dei micoplasmi che non superano le 300000 bp (si tratta di batteri privi di parete e con genoma degenerato che dipendono completamente dalla cellula eucariotica che ospitano). Tuttavia, in media i genomi hanno una dimensione variabile tra 1-5 milioni bp.

Generalmente un batterio che ha dei plasmidi può essere "curato" con tecniche di genetica batterica, cioè possiamo fare in modo che il batterio perda i plasmidi in quanto i batteri possono vivere senza. I plasmidi sono degli elementi accessori che contengono delle informazioni genetiche addette al:

• Miglioramento della fitness di un batterio
• Miglioramento della capacità di resistenza agli antibiotici
• Miglioramento delle capacità di colonizzare un ambiente o un tessuto.

A seconda del gene che contengono, questi plasmidi vengono definiti plasmidi di virulenza se sono in grado di determinare maggior virulenza nel batterio (e quindi determinare un patogeno più aggressivo e virulento). Oppure, se contengono geni che codificano per la resistenza agli antibiotici, vengono chiamati plasmidi di resistenza o di resistenza multipla agli antibiotici. Qualche volta i plasmidi presentano entrambe le componenti, di resistenza e di virulenza, ma normalmente sono separati.

Un'altra componente del batterio sono i ribosomi. Questi sono la componente strutturale nella quale avviene la rilettura gene per gene e la sintesi proteica, quindi il prolungamento della catena polipeptidica. I ribosomi dei batteri sono costituiti da due subunità, una più grande e una più piccola, e sono estremamente simili a quelli eucariotici, anche se sono leggermente più piccoli. Questo è molto importante nel caso di un farmaco antibatterico. Si immagini di avere una molecola in grado di bloccare la sintesi delle proteine nei batteri: questo farmaco agisce legandosi a proteine che compongono i ribosomi batterici. Tuttavia, essendo questa una struttura non specifica per i batteri, verrà impedita la sintesi proteica anche nelle cellule eucariotiche, determinando un'elevata tossicità del farmaco. Bisogna per questo motivo trovare sempre un target, sia nel caso dei batteri che dei virus, assente nelle nostre cellule quindi il più diverso possibile dalle funzioni presenti nelle cellule eucariotiche.

Nei batteri sono presenti anche i corpi di inclusione; cioè degli accumuli di carattere proteico o polisaccaridico che assumono una struttura amiloidea, ossia una struttura non ordinata di deposizione proteica. La membrana plasmatica, come negli eucarioti, è costituita dai fosfolipidi, molecole anfipatiche con una testa idrofila composta dal gruppo fosforico e una o più code idrofobiche costituite da lipidi, ovvero acidi grassi.

Parete cellulare e differenze tra Gram+ e Gram-

La parete cellulare di peptidoglicano dei Gram+ rispetto alla parete cellulare dei Gram- è molto più spessa. Gram+ e Gram- è un modo per distinguere due classi di batteri in modo molto generico: quando la parete è più sottile si colora in maniera negativa col colorante Gram (-), quando è più spessa si colora in maniera positiva (+). I Gram-, pur avendo uno strato di peptidoglicano più sottile, hanno una doppia membrana, una interna e una esterna (sopra la parete). La membrana esterna è diversa dalla membrana interna poiché, oltre al bilayer fosfolipidico e le proteine (integrali, transmembrana e associate alla superficie), possiede una componente lipopolisaccaridica o LPS (presente solo nei batterei Gram-). Nella membrana esterna esiste una componente idrofila che si proietta verso l'esterno ed è data da un polisaccaride, e una componente idrofobica che sta immersa nel foglietto fosfolipidico e si chiama lipide A, da qui il nome LPS, lipopolisaccaride.

Passaggi per distinguere i batteri Gram- dai batteri Gram+

• Si fissano i batteri in un vetrino (si scalda la superficie per asciugare il campione biologico).
• Si aggiunge il colorante di Gram "crystal violet" che fa diventare viola scuro tutti i batteri.
• Si elimina l'eccesso di colorante e si aggiunge un liquido "aggrappante" che blocca il colorante sulle superfici.
• Si decolora con alcool, per cui il colorante va via, tranne quello che, grazie al trattamento con lo iodio, è rimasto attaccato al peptidoglicano del batterio. Nella parete sottile dei Gram-, l'alcool riesce a portare via tutto (e quindi diventano di nuovo non colorati), mentre nella parete più spessa dei Gram+ l'alcool non riesce a portare via tutto (e quindi restano viola).
• Si effettua una contro-colorazione con altri coloranti tipo fuxina o catramina che fa assumere ai Gram- (decolorati) una colorazione fuxia, mentre quelli con parete batterica più spessa restano viola-blu perché non subiscono la contro-colorazione.

Nei Gram- sono presenti sulla membrana esterna delle proteine dette porine che creano un canale attraverso il quale il batterio può assorbire i metaboliti destinati alla membrana interna e il citosol del batterio, ad esempio per consentire la fosforilazione ossidativa (produzione di energia).

Dalle proprietà fisiche della parete dipende anche la definizione anatomo-patologica dei batteri:

• Cocchi: batteri Gram+ e meno spesso Gram- di forma sferica
• Micrococchi: batteri Gram+ di forma sferica accoppiati a due a due
• Streptococchi: batteri Gram+ associati in catenelle
• Stafilococchi: batteri Gram+ associati a grappolo
• Bacilli: batteri Gram+ a forma di bastoncino
• Vibrioni: bacilli Gram- a forma di virgola
• Spirilli: batteri a struttura elicoidale molto rigida
• Spirochete: batteri dalla struttura sottile e particolarmente flessibile

Nei batteri non è presente il citoscheletro, ma è presente una parete rigida che permette al batterio di mantenere la sua struttura anche in ambienti iper- e ipotonici senza determinare lisi cellulare (in ambiente ipotonico, cioè quando la quantità di soluti è maggiore all'interno della cellula, si ha richiamo di acqua dall'esterno, quindi iperosmosi e idrolisi cellulare come accade nel caso dei globuli rossi anch'essi privi di citoscheletro).

Caratteristiche chimiche della parete batterica

Il peptidoglicano ha delle differenze nei Gram- rispetto ai Gram+. La parete dei Gram+ non è soltanto più spessa ma anche più articolata da un punto di vista chimico. La differenza più evidente è che nei Gram+ è presente una pentaglicina (catena di glicine) mentre nei Gram- non è presente. Mentre hanno in comune degli ammino-zuccheri che sono N-acetilglucosammina (NAG) e l'acido N-acetilmuramico (NAM), il peptidoglicano è fatto di catene lineari in cui si alternano continuamente NAM e NAG. Questi due ammino-zuccheri, oltre a polimerizzarsi in modo lineare, hanno corte catene di amminoacidi. Queste catene sono abbastanza simili sia nel Gram- che nel Gram+ e iniziano sempre con L-alanina, poi però si hanno amminoacidi diversi. In particolare, nei Gram- è presente un amminoacido molto particolare (diaminopimelico). Il diaminopimelico è un amminoacido che non è presente nei nostri tessuti, quindi questo è fondamentale per la composizione di un antibiotico che lega questo amminoacido senza intaccare le nostre cellule. Molti antibiotici comunemente utilizzati sono diretti contro la biosintesi del peptidoglicano. La D-alanina alla fine dei 4 amminoacidi si lega in modo diretto con il diaminopimelico nella catena controlaterale nei Gram-, e in modo indiretto con un ponte di pentaglicina con un L-lisina nella catena parallela nei Gram+. Si forma di fatto un canestro con più maglie concentriche che saranno più numerose nei Gram+ in quanto il peptidoglicano è più spesso.

Nel peptidoglicano si hanno inoltre una serie di molecole che originano da un ancoraggio nella membrana plasmatica. Tra queste ci sono gli acidi lipotecoici che sono associati esclusivamente ai Gram+ e sono delle importanti molecole perché mediano l'adesione alle superfici. Esistono anche dei polisaccaridi (da non confondere coi lipopolisaccaridi) e anche questi possono mediare adesione e altre funzioni sulla superficie dei Gram+. In questi ci sono anche numerose lipoproteine che sono associate alla membrana nella componente lipidica e hanno delle ramificazioni proteiche verso l'esterno (spesso sono antigeni di virulenza coinvolti nella patogenicità batterica).

Nei Gram- si ha una membrana plasmatica simile ai Gram+, il peptidoglicano è molto più contenuto per dimensione, si hanno delle lipoproteine con la componente lipidica idrofobica immersa nel contesto della membrana esterna. Si trovano anche dei canali o porine che permettono il passaggio facilitato (a volte in maniera ATP dipendente, a volte no) di soluti dall'esterno al periplasma (che è lo spazio tra le due membrane, interna ed esterna). La cosa più rilevante nei Gram- sono i lipopolisaccaridi, cioè dei polisaccaridi che hanno una regione cool (lipide A) comune a tutti i lipopolisaccaridi immerso nel foglietto fosfolipidico.

Nel periplasma (presente solo nei Gram-) sono presenti proteine molto importanti, spesso sono enzimi biosintetici che sono connessi con la sintesi del peptidoglicano stesso ma servono anche per costruire altre strutture sulla superficie dei batteri (come le fimbrie), come nel caso delle proteine accompagnatrici o chaperonine che sono in grado di riconoscere una proteina che deve raggiungere l'esterno della cellula e la legano per trasportarla in superficie. Sono presenti anche le binding proteins, proteine che non avendo un'attività enzimatica legano molecole particolarmente importanti che sono appena passate attraverso le porine dall'esterno della cellula e che devono essere trattenute e veicolate all'interno della cellula batterica. Ci sono enzimi degradativi che talvolta sono utili, come nel caso di proteasi o fosfolipasi, ma ci sono casi in cui questi enzimi servono a idrolizzare i tessuti dell'organismo ospite (Pseudomonas, Clostridium e altri batteri che esplicano in tal modo la loro azione patogena causando gangrene). Infine, troviamo enzimi detossificanti che sono causa della resistenza agli antibiotici, come nel caso delle beta-lattamasi che idrolizzano le molecole di penicillina, vanificando la funzione antibiotica.

La membrana plasmatica è, come nelle cellule eucariotiche, un mosaico fluido. Ma questo non significa che le proteine si possano muovere al suo interno autonomamente; c'è una distribuzione polarizzata e ordinata delle proteine sulla superficie batterica. Anche in questo caso si tratta di una membrana semipermeabile che lascia passare l'acqua ma non i soluti; inoltre, a livello dei canali di membrana, si crea un gradiente di protoni che genera energia permettendo il movimento.

Flagelli e motilità batterica

I flagelli servono al batterio per muoversi e usano la forza protono-motrice, ossia i protoni sono il carburante per far muovere delle strutture proteiche multimeriche con diversi polipeptidi che sono assemblati a costruire dei dischi che, in presenza di una spinta ad ingresso di idrogeni, spinge la rotazione dei dischi. Questo "motore" è collegato a un canale, quindi con la rotazione dei dischi gira anche l'intero canale; questo canale fa girare a sua volta l'intero flagello. Dal punto di vista strutturale, i flagelli hanno strutture molto simili. Queste strutture sono associate alla membrana plasmatica nei Gram+ mentre nei Gram- sono associati alla membrana interna.

L'attività del flagello è controllata. Infatti, questo si muove quando c'è qualche sostanza tossica dalla quale allontanarsi, o riconosce quando ci sono zuccheri che potrebbe sfruttare per il proprio metabolismo e quindi si muove verso la maggior concentrazione di questi zuccheri attraverso un gradiente, ossia si muovono per chemiotassi, ovvero perché seguono delle tracce molecolari che si legheranno a un recettore sulla superficie e questo legame permette la trasduzione di un segnale e questo pathway biochimico dirà al flagello in quale direzione deve ruotare. Se il flagello rileva un segnale che gli interessa, si bloccherà e ruoterà in senso antiorario; la rotazione antioraria del flagello è propulsiva (spinge il batterio). Se invece le molecole sono tossiche, i recettori riconoscono queste molecole e la trasduzione del segnale ordina al flagello di bloccarsi e di ruotare in senso orario (la propulsione non è ordinata) in modo tale da fermarsi e ruotare.

I flagelli sono strutture sovramolecolari (ossia composti da complesse associazioni di diverse macromolecole) organizzati in moduli: una base ad anelli, un uncino ed il filamento flagellare. Sono dei canali cavi per cui gli enzimi situati nel periplasma e gli stessi monomeri di flagellina passano attraverso il canale neoformato e si attaccano all'ultimo monomero adeso al flagello. Ci sono strutture analoghe al flagello che servono a portare proteine da dentro il batterio a un'altra cellula senza passare per la matrice extracellulare (adesine di tipo terzo). Un'altra struttura simile ai flagelli sono i pili, dei canali cavi molto più sottili e dalla struttura semplificata. Essi servono ai batteri per due ordini di ragioni: i pili coniugativi o sessuali permettono il passaggio di plasmidi da un batterio all'altro (da una cellula donatrice a una cellula ricevente), i pili comuni o fimbrie servono per legare recettori e mediano l'adesione, infatti, hanno un ruolo essenziale nella prima fase della colonizzazione dei tessuti, inoltre rappresentano un meccanismo di resistenza alla fagocitosi. Il numero di fimbrie sulla superficie batterica è molto elevato e queste sono antigenicamente diverse tra loro quindi vengono riconosciute differentemente dal nostro sistema immunitario. È prerogativa dei batteri cambiare continuamente gli antigeni di superficie durante un'infezione per fare in modo di sfuggire al S.I. I batteri hanno diversi geni che fanno fimbrie sia sul cromosoma che sui plasmidi; in realtà non cambia tutta la fimbria ma varia la proteina sita all'apice del pilo cioè l'adesina (tip protein) che legherà le componenti glucidiche che abbondano sulla superficie delle cellule eucariotiche e che costituiscono i siti di attacco dei batteri.

Capsula e biofilm

La capsula non è presente in tutti i batteri ed è un elemento estremamente importante per quanto riguarda la capacità dei batteri di interagire con l'ambiente esterno e di aderire a superfici animate e inanimate. È uno dei primi elementi strutturali e funzionali dei batteri che intervengono nei processi di colonizzazione. Per colonizzazione si intende quando più batteri aderiscono su una superficie dove permangono e costituiscono una comunità, costituiscono un biofilm microbico. Dal punto di vista chimico, le capsule sono generalmente polisaccaridi; costituiscono tutto intorno alla cellula e tutto intorno alla colonia batterica un involucro di tipo mucoso (o mucoide). Ha un aspetto amorfo e qualche volta può essere di natura proteica, ad esempio nel caso del Bacillus anthracis responsabile dell'antrace nell'uomo e del carbonchio negli animali.

La capsula è un sistema di adesione, ma allo stesso tempo maschera tante componenti, tra cui le strutture recettoriali che sono sulla superficie del peptidoglicano. Questo fa sì che i batteri non vengano riconosciuti dai sistemi di difesa poiché nasconde gli antigeni di superficie. Inoltre, questa previene la fagocitosi, un processo dal quale i batteri hanno imparato a difendersi da milioni di anni perché sono spesso prede di microrganismi unicellulari eucarioti presenti nell'ambiente. La fagocitosi avviene perché una cellula eucariota riconosce il batterio tramite un'interazione intima tra alcune strutture di superficie e recettori e fattori vari presenti sul batterio; la capsula serve a prevenire o a ridurre l'efficienza di questo riconoscimento. Il terzo ruolo della capsula è la formazione di biofilm, un esempio di biofilm può essere la placca dentale che si forma.