Appunti completi di microbiologia

TECNICHE DI GENETICA BATTERICA

I batteri sono in grado di trasferire da una cellula all'altra l'informazione genetica attraverso

trasformazione, coniugazione, trasduzione e anche conversione lisogenica, si tratta di tecniche di

genetica batterica molto utili nella trasformazione dei batteri insieme alle tecniche di biologia

molecolare. Dopo il trasferimento laterale dell'informazione genetica deve naturalmente avvenire

integrazione nel genoma del batterio perchè si abbia un ricombinante e questo può avvenire per

ricombinazione sito-specifica o omologa. La differenza importante tra questi meccanismi naturali

del trasferimento laterale dell'informazione genica è la dimensione del DNA che si può trasferire,

quindi si utilizzeranno tecniche diverse a seconda del tipo di DNA che si vuole analizzare. I batteri

trasferimento laterale dell’informazione

per adattarsi utilizzano il genetica e sono in grado di

modificare drasticamente l'aspetto genomico per adattarsi rapidamente a un nuovo ambiente e

per fare questo usano spesso l'informazione genetica di chi è già presente in questo ambiente, quindi

riescono ad acquisire informazione genetiche da chi è già adattato e da chi ha già quell'informazione

genetica per sopravvivere con successo in una determinata condizione.

La trasformazione:

Il DNA che viene acquisito dalla cellula trasformata è il così detto DNA nudo ossia un frammento

al di sotto di 10mila bp, derivato da una cellula morta. Ossia se si vuole fare una trasformazione in

laboratorio si deve partire dal DNA purificato, il DNA sarà poi introdotto nella cellula batterica,

e in essa eventualmente ricombinerà. In natura, per far si che questa trasformazione avvenga, i

frammenti devono essere sufficientemente lunghi ossia tra le 700 bp e 10000 bp (non meno di 500

perchè se no non può ricombinare, RecA non funziona se la sequenza di omologia non è abbastanza

lunga). In laboratorio noi trasformiamo essenzialmente cellule con DNA circolare perchè una

volta inseriti in una cellula ospite saranno in grado di replicare e mantenersi in essa, soprattutto se il

plasmide codifica per una resistenza antibiotica e noi manteniamo costante la presenza di

quell’antibiotico in modo da mantenere il plasmide all'interno della cellula (senza antibiotico-

resistenza la cellula non può replicare). Si possono trasferire anche frammenti lineari che

dovranno poi ricombinarsi per potersi replicare; non potendosi replicare autonomamente, come il

DNA circolare, se noi trasformiamo delle cellule con frammenti lineari, questi devono per forza

integrarsi nel genoma della cellula o per ricombinazione omologa RecA dipendente o per

ricombinazione sito-specifica (se il frammento lineare è un trasposone o possiede delle sequenze a

inserzione) o attraverso recombineering (ricombinazione omologa dei fagi). In natura perchè ci sia

trasformazione i batteri devono essere competenti, i batteri regolano la propria competenza, cioè

regolano la loro capacità di acquisire del DNA esogeno e questa competenza a volte è

costantemente assente, oppure può essere presente ma soltanto in alcune fasi della replicazione delle

cellule batteriche come in condizioni di stress dove la cellula riduce le sue "difese" all'ingresso di

DNA esogeno perchè potrebbero portare geni che portino il batterio a uscire da quella condizione di

stress. In laboratorio si utilizzano batteri che generalmente non sono mai competenti e vengono

indotte queste competenze, quindi la prima cosa che bisogna fare in laboratorio è rendere le cellule

batteriche competenti in modo che possano acquisire del DNA che è stato purificato in precedenza.

Si ipotizzi ora il caso in cui si debba trasferire un DNA circolare (un plasmide) che ha una sua

origine di replicazione e che una volta trasferito per trasformazione potrà replicare autonomamente

nella nuova cellula, quello che ci interessa è che questo DNA una volta trasferito nella cellula da

trasformare sia mantenuto stabilmente e per fare ciò dobbiamo avere sempre un sistema di

selezione. Per sapere quante cellule sono realmente trasformate dopo aver fatto il trasferimento

bisogna in qualche modo selezionare i ricombinanti eliminando quelle che non hanno ricevuto il

DNA o quelle in cui il DNA non si è integrato, l'unico modo per fare ciò è selezionare per

caratteri portati da quel DNA. Quindi in una trasformazione a prescindere da ciò che noi vogliamo

trasferire, quale che sia la funzione di interesse, quel DNA deve contemporaneamente trasferire un

antibiotico resistenza, cioè deve trasferire una funzione che si può rapidamente selezionare. Lo

schema di base è quello di preparare i batteri, renderli competenti (quindi in grado di accettare il

DNA esogeno), purificare del DNA esogeno ad esempio dei plasmidi che conterranno un marcatore

ad esempio il gene CAT, ossia un acetiltransferasi che blocca l'attività del Cloramfenicolo (un

antibiotico) e ne annulla l'effetto sui batteri che integrano il plasmide.

La trasformazione si può fare attraverso due modalità: la trasformazione chimica (o propriamente

detta) e l'elettrotrasformazione più comunemente detta elettroporazione. La differenza sta nella

modalità con la quale vengono preparate le cellule per diventare competenti e la modalità per il

trasferimento del DNA all'interno della cellula .

TRASFORMAZIONE CHIMICA: abbiamo un ceppo batterico che si vuole trasformare e abbiamo

il DNA già purificato che dobbiamo far passare dentro il batterio per trasformarlo. Per rendere i

batteri competenti, prelevo la mia colonia e semino in un brodo non selettivo, lascio crescere O/N in

agitazione a 37° quindi i batteri avranno raggiunto la fase stazionaria infatti il brodo sarà piuttosto

torbido, questo primo passaggio mi permette di ottenere tanti batteri. Devo diluire la brodocultura

(1:100) quindi ne prelevo una aliquota e la rilancio in una fiasca (di modo che lo scambio di

ossigeno sia massimale per far crescere più velocemente i batteri) in abbondante terreno fresco e li

faccio crescere in agitazione fino alla fase medio-logaritmica. A questo punto si prende l'intera

fiasca e la si mette in ghiaccio e acqua per far abbassare la temperatura il più rapidamente possibile,

porto così la coltura a 4° C che immediatamente blocca la replicazione. Una volta raffreddati

prelevo un' aliquota e la metto in un tubicino eppendorf, centrifugo sempre a 4° C in modo che i

batteri sedimentino andando a formare il pellet (centrifugando acceleriamo la sedimentazione dei

batteri). Elimino il sopranatante che sarà completamente limpido e prelevo il pellet al quale si

aggiunge una soluzione tampone di magnesio-cloruro (o calcio-cloruro) ghiacciata dimezzando il

volume della brodocoltura e rimetto subito in ghiaccio; la soluzione contiene cationi bivalenti che

servono ad aumentare la permeabilità di membrana. Dopo qualche minuto in ghiaccio "lavo" i

batteri ovvero centrifugo e risospendo il pellet più volte, generalmente tre volte, con concentrazioni

scalari di soluzione tampone per eliminare le tracce della brodocoltura e concentrare il più possibile

i batteri che a questo punto sono diventati competenti. A questo punto posso aggiungere il mio

DNA di interesse e li lascio insieme in ghiaccio per circa mezzora dopo di che tratto i miei batteri

facendoli passare velocemente dal ghiaccio a un bagnetto termostatato cioè passano velocemente da

circa -4° a 42° C, questo porta a una risposta allo stress da parte dei batteri che producono le

cosiddette heat-shock proteins quindi abbiamo l'induzione di una serie di fenomeni trascrizionali

che in qualche modo facilitano l'acquisizione del DNA esogeno; questo trattamento non deve

proseguire per più di 40 secondi perchè oltre inizia a uccidere i batteri. A questo punto tutti i batteri

sopravvissuti saranno abbastanza sofferenti quindi bisogna immediatamente dargli del terreno

fresco e ricco di zuccheri per ricostituire l'equilibrio energetico dei batteri in modo che si

riprendano, li lascio in agitazione a 37° C per un'ora per permettere la trascrizione dei geni che gli

servono per la selezione alla quale lo sottoporrò, dovranno produrre la proteina che gli garantirà

l'antibiotico-resistenza di modo che quando li seminerò su piastra con l'antibiotico adeguato potrò

selezionare quelli che hanno acquisito il frammento di DNA esogeno e che saranno quindi in grado

di sopravvivere in presenza di quell'antibiotico.

ELETTROPORAZIONE: Si tende a utilizzare una trasformazione chimica e non

un'elettroporazione quando per ragioni varie il DNA che si deve trasferire non raggiunge livelli di

purezza molto elevati, questo perchè una condizione necessaria per l'elettroporazione è che il DNA

sia molto pulito cioè deve essere risospeso in acqua bidistillata, in assenza di qualsiasi altra

molecola, in particolare in totale assenza di sali. L'assenza di sali nel DNA che deve subire un

elettroporazione è molto importante perchè meno sali ci sono e meno conduzione di corrente ci

sarà, di conseguenza saranno minori i danni subiti dalle cellule batteriche dovuti alla conduzione

elettrica. Per ottenere delle cellule batteriche estremamente pulite e prive di sali per prima cosa

dobbiamo fare in modo che questi batteri arrivino alla fase di preparazione con tutte le loro

competenze metaboliche e biochimiche espresse nei massimi livelli quelli che si raggiungono

durante la replicazione attiva, ossia durante la fase di crescita medio-logaritmica. Pertanto prelevo i

batteri da una singola colonia e li semino in brodo non selettivo e faccio crescere per una notte per

ottenere una coltura stazionaria il giorno dopo. Il giorno dopo rilancio i batteri, cioè vengono diluiti

1 a 100 in brodo fresco ricco di nutrienti e non selettivo che serve per far crescere il batterio il più

velocemente possibile, questa brodocoltura sarà in una fiasca piuttosto grande di modo che in

agitazione a 37° C questo volume sia molto ben ossigenato. Una volta che i batteri raggiungono la

fase medio-logaritmica (fase con un'assorbanza a 600 nm di 0.3-0.4) vanno immediatamente

raffreddati in agitazione a 4° C e ponendo la fiasca in ghiaccio, a questo punto, a differenza della

trasformazione chimica, i batteri vengono lavati in acqua bidistillata ghiacciata priva di sali

riducendo ogni volta di metà il volume della sospensione batterica (diluizioni seriali) fino ad

arrivare a un quattrocentesimo del volume iniziale. Dopo questi passaggi ottengo una crema di

batteri, la carica batterico è quindi elevatissima e questo è molto importante perchè possono essere

elettroporati solo piccoli volumi per volta. I batteri dunque sono pronti per essere elettroporati,

quin