Appunti completi di genetica

Citogenica: i cromosomi

I cromosomi non sono altro che DNA complessato con proteine istone e non a formare la cromatina, che è a sua volta arrangiata spazialmente a formare i cromosomi. I centromeri e telomeri sono elementi importanti nella struttura dei cromosomi perché fondamentali per la segregazione in mitosi ed in meiosi.

Centromeri e telomeri

Il centromero è responsabile della precisa segregazione dei cromosomi duplicati nelle cellule figlie durante la mitosi e la meiosi. Verso la fine della profase, su entrambi i lati del centromero di ciascun cromosoma, si formano delle strutture specializzate chiamate cinetocori che si attaccano a speciali microtubuli.

Il fuso mitotico è costituito da diversi tipi di microtubuli:

• Microtubuli astrali: si irradiano a partire da ciascuno dei due poli del fuso mitotico;
• Microtubuli polari: costituiscono dei legami che collegano i due poli del fuso mitotico;
• Microtubuli del cinetocore: collegano i cromosomi metafasici a ciascuno dei due poli, ed a livello del piano equatoriale del fuso mitotico, connettendosi al paio di cinetocori presenti per ciascun cromosoma.

I telomeri sono regioni all'estremità di un cromosoma lineare indispensabili alla replicazione ed alla stabilità di un cromosoma, sono generalmente eterocromatiche. La maggior parte delle sequenze telomeriche può essere raggruppata in due tipologie:

• Sequenze telomeriche semplici: individuate alle estremità delle molecole del DNA cromosomico, risultano specie-specifiche, e sono costituite da un motivo semplice di poche basi ripetuto in tandem. Conferiscono stabilità alle estremità del cromosoma.
• Sequenze associate ai telomeri: si trovano più lontano rispetto all’estremità dei cromosomi, sequenze di DNA complesse, ripetute, che si estendono per molte migliaia di paia di basi dall’estremità del cromosoma.

Quantitativo di materiale genetico

Il quantitativo di materiale genetico ci permette di dividere le cellule in:

• Cellule diploidi 2n: cellule con due assetti cromosomici, es. le cellule somatiche.
• Cellule aploidi n: cellule con soltanto un assetto cromosomico, es. le cellule gametiche.

I cromosomi si dividono in:

• Cromosomi omologhi: negli assetti diploidi (2n), sono i due membri di una stessa coppia di cromosomi, uno di origine materna ed uno di origine paterna.
• Cromosomi non omologhi: negli assetti diploidi (2n), non sono i membri di una stessa coppia di cromosomi.
• Cromosomi sessuali o eterocromosomi: a differenza delle altre coppie di cromosomi non devono essere necessariamente uguali. Generalmente vengono indicati come X ed Y, e si differenziano in base a:
  • Dimensioni;
  • Localizzazione del centromero;
  • Dimorfismo tra i due membri della coppia.

Nella maggior parte degli animali superiori uno dei due sessi viene chiamato eterogametico perché presenta due cromosomi sessuali che sono abbastanza differenti l’uno dall’altro. X è un grande cromosoma sub-metacentrico, contenente numerosi geni. Y è un piccolo cromosoma acrocentrico, che sembra contenere pochi geni attivi fra i quali il gene per il fattore di determinazione del testicolo. Questo determina la mascolinità nei mammiferi placentali.

I maschi hanno solo un cromosoma X e quindi sono costituzionalmente emizigoti per i geni del cromosoma X. Le femmine diventano funzionalmente emizigoti per i geni del cromosoma X dopo la formazione, allo stadio di blastula, del corpo di Barr che consente la compensazione del dosaggio genico. Le femmine di mammifero sono quindi dei mosaici genetici, costituite da un insieme di linee cellulari che presentano un fenotipo relativo al cromosoma X paterno, e di linee cellulari che presentano un fenotipo relativo al cromosoma X materno.

Autosomi: sono tutti gli altri cromosomi.

Metodologie di studio dei cromosomi

Cellule in interfase

In interfase il DNA è despiralizzato, sotto questa forma i singoli cromosomi non sono individuabili e conseguentemente non possono essere identificati. Nelle cellule di alcuni tessuti animali, l’organizzazione della cromatina è tale da evidenziare un dimorfismo sessuale che facilita l’identificazione e lo studio dei cromosomi sessuali. La Cromatina Sessuale o Corpo di Barr è visibile solo nelle cellule in interfase e si colora di scuro con i coloranti nucleari.

Cellule in metafase

La metafase è il momento più idoneo per lo studio di cromosomi. In quanto la cromatina è nel suo stato di massima condensazione e ciascun cromosoma è ben visibile al microscopio sotto forma di due cromatidi fratelli tenuti insieme dal centromero.

Cellule in meiosi

Hanno permesso di evidenziare inversioni ed interscambi, piccoli riarrangiamenti, stimare le frequenze di crossing-over (contando i chiasmi), in Metafase II si può stimare il tasso di non disgiunzione. Nel maschio le divisioni meiotiche iniziano alla maturità sessuale e continuano fino in età avanzata; sono quindi più facilmente studiabili. Nella femmina le divisioni meiotiche iniziano durante la vita fetale e poi si arrestano fino alla maturazione sessuale.

Identificazione dei cromosomi

Morfologia dei cromosomi e markers

Uno dei metodi più semplici per identificare i cromosomi omologhi è basato sulla posizione del centromero. Alcune specie animali presentano un assetto cromosomico autosomico completo in cui ciascun cromosoma omologo non risulta morfologicamente distinto. Nel bovino, nella capra, nel suino e nel cane, gli autosomi sono morfologicamente gli stessi e differiscono solo per le dimensioni. Per queste specie l’identificazione degli omologhi richiede una misura accurata e la costituzione di un ideogramma. I markers cromosomici quali satelliti o costrizioni secondarie sono ben evidenti nel gatto (il cromosoma E1 presenta un satellite nel braccio corto).

Criteri di classificazione dei cromosomi

• Posizione del centromero:
  • Metacentrici: il centromero si trova al centro del cromosoma;
  • Acrocentrici: il centromero si trova in prossimità di un’estremità del cromosoma;
  • Telocentrici: il centromero è più vicino ad un’estremità che all’altra.
• Lunghezza del cromosoma

Una volta classificati a dovere i cromosomi possiamo realizzare:

• Cariotipo o cariogramma: presenta l’immagine di tutti i cromosomi di una sola cellula. I cromosomi di un intero corredo, dopo essere stati evidenziati con i procedimenti suddetti, vengono fotografati. Dalle foto poi i singoli cromosomi vengono ritagliati ed ordinati, appaiando gli omologhi, seguendo i criteri suddetti di classificazione.
• Idiogramma: schema in cui ogni cromosoma è mostrato nella sua intera lunghezza con la posizione del centromero indicata da una costrizione. Rappresenta ogni cromosoma idealizzato, il cui schema è derivato dallo studio di più cellule e riporta un solo elemento per ciascuna coppia di cromosomi.

Autoradiografia

I cromosomi possono essere identificati in base alle dinamiche di divisione cellulare perché alcuni di essi si replicano più lentamente di altri durante la fase S del ciclo cellulare. Prima della raccolta cellulare viene aggiunta alla coltura una sostanza radiomarcata per un breve lasso di tempo. In questo modo solo i cromosomi che si replicano più lentamente vengono radiomarcati e quindi possono essere identificati.

Tecniche di colorazione differenziale

Permettono di evidenziare per i cromosomi omologhi di un assetto 2n un unico pattern (disegno) di bande. Queste tecniche hanno consentito di identificare i singoli cromosomi e di individuare specifiche zone sul cromosoma stesso. Prima della messa a punto delle tecniche di colorazione differenziale era difficile evidenziare inversioni o traslocazioni reciproche.

Per osservare i cromosomi, a seconda dei trattamenti e delle colorazioni utilizzate, possono essere visualizzate diverse tipologie di struttura:

• Eucromatina: evidenziata da metodiche di marcatura cromosomica che determinano bande chiamate G, Q, ed R corrispondenti a DNA trascritto. Il bandeggio R, messo a punto dopo quello Q e G, si presenta come se fosse un “negativo” di queste ultime.
• Eterocromatina costitutiva: viene colorata in maniera selettiva ed intensa mediante una metodica di marcatura detta bandeggio C o di centromero. È una frazione di cromatina situata nella regione centromerica ed anche in altre regioni. È presente in tutti i cromosomi di tutte le specie. Contiene sequenze altamente ripetute di DNA e si replica molto tardivamente durante la fase di sintesi S del DNA.
• Regioni telomeriche: vengono individuate mediante la metodica del bandeggio T (regioni terminali). Si usano le lettere P e Q per designare rispettivamente il braccio corto e lungo di ciascun cromosoma.

Non disgiunzione dei cromosomi

La non disgiunzione dei cromosomi sessuali avviene negli individui di entrambi i sessi. Quando i gameti normali si fondono con spermatozoi o cellule uovo difettosi, gli zigoti che ne derivano hanno un numero anomalo di cromosomi sessuali, fra le più comuni abbiamo X0, XXX, XXY e XYY.

• Segregazione normale
• Non disgiunzione alla meiosi I
• Non disgiunzione alla meiosi II

Non disgiunzione primaria: quando la non disgiunzione si verifica in un individuo con un assetto cromosomico normale.

Non disgiunzione secondaria: quando si verifica nella progenie di femmine prodotte da una non disgiunzione primaria.

Le mutazioni cromosomiche

• Di struttura
  • Inversione: pericentrica, paracentrica
  • Delezione
  • Duplicazione
  • Inserzione
  • Traslocazione
• Di numero
  • Aneuploidia: nullisomia, monosomia, trisomia (es. 21 di Down, 13 di Patau, 18 di Edwards), tetrasomia
  • Euploidia: monoploidia, triploidia, tetraploidia

Negli eucarioti possono essere visualizzate a livello citologico durante:

• Mitosi
• Meiosi

Genetica

Unità di misura dei genomi

Quantità di DNA nucleare espressa in pb (1pg = 10^-12 g)

Lunghezza totale del DNA espressa in:

• Paia di basi (Pb)
• Kilobasi (1 Kpb=1000pb)
• Megabasi (1 Mb = 10⁶pb)

La struttura chimica del DNA e RNA

Strutture dei nucleosidi (zucchero+base) e dei nucleotidi (zucchero+base+gruppo fosfato) del DNA e RNA. Ad un filamento singolo di DNA dove le molecole di desossiribosio sono legate mediante legami fosfodiesterici tra il carbonio 5’ di uno zucchero e il carbonio 3’ dello zucchero successivo. La natura antiparallela delle 2 catene polinucleotidiche è una caratteristica chiave della doppia elica. Una catena dell’elica è orientata 5’-3’, e l’altra in direzione opposta. Solitamente le sequenze di DNA sono scritte in orientamento 5’-3’. Questo significa che un DNA a singolo filamento inizia con un gruppo fosfato libero legato al carbonio 5’ dello zucchero. I successivi nucleotidi sono aggiunti al filamento mediante legami fosfodiesterici, che uniscono il gruppo ossidrilico al carbonio 3’ di uno zucchero con il fosfato legato al carbonio 5’ di uno zucchero adiacente.

Proprietà del DNA

• La molecola di DNA è una doppia elica destrorsa dal diametro di 2nm;
• Le due catene sono antiparallele;
• Gli scheletri di zucchero-fosfato si trovano all’esterno e le basi all’interno;
• Le basi sono unite da legami a idrogeno;
• Si formano solchi maggiori e solchi minori dove entrano le proteine;
• Il DNA si può denaturare e rinaturare;
• La doppia elica è una struttura stabile;

Composizione della molecola di DNA

• Con questo modello è possibile qualsiasi sequenza di coppie di basi per tutta la lunghezza della doppia elica;
• Il numero di differenti sequenze possibili in una molecola di DNA è virtualmente infinito ed è in grado di poter codificare un’enorme quantità di informazioni;
• In questo modello è già implicito un possibile meccanismo di replicazione della molecola di DNA in modo da produrre due molecole figlie identiche;
• La composizione e l’ordine delle basi del DNA è differente nelle diverse specie;

In ogni caso vengono sempre rispettate le regole di Chargaff che evidenziano una caratteristica costante in tutti i genomi:

1. La quantità molare di (A) è sempre uguale alla quantità molare di (T) e quella di (C) è sempre uguale a quella di (G).
2. Nei genomi esiste un’uguale quantità di purine e di pirimidine, l’unico rapporto che cambia è il rapporto molare (A)+(T)/(C)+(G).

Cromatina

È un complesso di DNA e proteine cromosomiche che costituiscono il cromosoma. Le proteine associate al DNA nella cromatina sono:

• Proteine istoniche: le più abbondanti associate ai cromosomi. Sono piccole proteine basiche, con una carica netta positiva che facilita il loro legame al DNA. Sono 5 tipi, H1, H2A, H2B, H3, H4. Le quantità e proporzioni degli istoni rispetto al DNA sono costanti in tutte le cellule di tutti gli organismi eucarioti. Gli istoni svolgono un ruolo cruciale nell’impacchettamento della cromatina e diversi livelli di complessamento rendono i cromosomi capaci di adattarsi dentro il nucleo di pochi micron di diametro.

  Il primo livello di “impacchettamento” implica l’avvolgimento attorno ad un nucleo di istoni con la formazione di una struttura definita nucleosoma. Un corto segmento di DNA è avvolto attorno a 2 molecole per ciascuno dei 4 istoni H2A, H2B, H3, H4. L’ H1, è una sola molecola e si ipotizza che svolga un’attività di linker. Il DNA si avvolge attorno al nucleo Istonico compiendo un giro e 3/4, il che comporta un compattamento di DNA di circa un fattore 7.

  I nucleosomi possono associarsi tra di loro a formare una struttura più compatta, che ha un diametro di 30nm, 1/6 della dimensione precedente chiamata a “collana di perle”.

  Il livello successivo di avvolgimento implica la formazione di domini ad ansa. Formando un angolo con l’asse principale del cromosoma, sono ancorati ad un’intelaiatura strutturale filamentosa all’interno della membrana nucleare chiamata matrice nucleare.

• Proteine non istoniche: tutte le proteine del DNA che non sono istoni. Alcune svolgono un ruolo strutturale, altre un ruolo transitorio. All’interno di un organismo, differiscono a seconda del tipo cellulare, da organismo a organismo e in momenti diversi nello stesso tipo cellulare.

Sulla base della colorabilità dei cromosomi, sono state definite 2 forme di cromatina:

• Eucromatina: rappresenta i cromosomi o le regioni cromosomiche che manifestano un’alteranza normale di condensazione e decondensazione durante il ciclo cellulare, visivamente subisce un cambiamento dell’intensità della colorazione, dal più scuro in metafase al più chiaro in fase S. L’eucromatina è tipicamente trascritta attivamente, ciò significa che i geni in essa contenuti possono essere espressi. Le regioni di eucromatina sono tipicamente prive di sequenze ripetute.
• Eterocromatina: rappresenta i cromosomi o le regioni cromosomiche che generalmente rimangono condensate, attraverso tutto il ciclo cellulare anche in interfase. Assume una colorazione più intensa rispetto all’eucromatina. Il DNA che si trova sotto questa forma replica in ritardo, nella fase S, rispetto al resto del DNA. Esistono due tipi di eterocromatina:
  • Eterocromatina costitutiva: è presente nella stessa posizione su entrambi i cromosomi omologhi di ogni coppia ed in tutte le cellule. Consiste essenzialmente di DNA ripetuto. Ne sono un esempio le regioni centromeriche.
  • Eterocromatina facoltativa: varia di condizione nei diversi tipi cellulari, nei diversi stadi dello sviluppo e talvolta da un cromosoma omologo all’altro. Un esempio è il corpo di Barr cioè un cromosoma X inattivato delle cellule somatiche delle femmine di mammifero.

Il DNA degli eucarioti

Tre diversi tipi di sequenze:

• Uniche: presenti in una o poche copie;
• Ripetute in tandem: ripetizioni non geniche, centromeri e telomeri;
• Ripetute sparse: sequenze geniche e non geniche. Es. trasposoni, sequenze non funzionali: SINE (100-500pb), LINE (diverse migliaia di pb).

Il valore C è la quantità totale di DNA in un genoma aploide (n). Tale quantità è specie specifica e varia in maniera considerevole tra le specie. Non esiste però correlazione diretta tra contenuto in DNA di un genoma e complessità strutturale e organizzazione di una specie, si parla quindi di “paradosso del valore C”.

Replicazione

Le due eliche si separano e ciascuna di esse serve da stampo per la sintesi di una nuova elica complementare. La sequenza delle basi dell’elica di nuova sintesi viene determinata dalla formazione di legami idrogeno specifici tra le basi dell’elica che funge da stampo e quelle dell’elica in via di formazione. Con questo meccanismo l’informazione genetica, codificata nella sequenza delle basi di una molecola parentale, può essere facilmente trasmessa a due molecole figlie.