Appunti biologia molecolare

UBIQUITAZIONE REPLICAZIONE DEL DNA

Ci sono tre modelli della replicazione del DNA:

1. Modello SEMICONSERVATIVO
2. Modello CONSERVATIVO
3. Modello DISPERSIVO

PROCESSO:

1. La polimerizzazione del DNA avviene sempre in direzione 5' → 3';
2. L'elicasi si muove in una sola direzione, srotolando progressivamente l'elica;
3. I due filamenti antiparalleli non possono essere duplicati nello stesso modo;
4. Uno viene sintetizzato nella stessa direzione in cui si muove l'elicasi, cioè in direzione 5' → 3' e viene chiamato FILAMENTO GUIDA;
5. L'altro non possiede un gruppo ossidrile 3' al punto di biforcazione e quindi non può essere sintetizzato seguendo l'elicasi, per questo viene chiamato FILAMENTO IN RITARDO;
6. Il filamento in ritardo viene, invece, sintetizzato in direzione opposta a quella in cui si muove la FORCELLA di REPLICAZIONE, mediante la sintesi progressiva di una serie di piccoli frammenti, detti FRAMMENTI DI OKAZAKI.

DNAtelomerico sono riconosciute da proteine che legano sequenze specifiche di DNA che attraggono un enzima, chiamato TELOMERASI, che ricostituisce queste sequenze ogni volta che una cellula si divide. Essa riconosce la punta di una sequenza ripetuta esistente di un telomero e la allunga in direzione 5’→3’, usando un ostampo di RNA che è un componente dello stesso enzima usato per sintetizzare nuove copie dellaripetizione. La porzione enzimatica della telomerasi assomiglia alle TRASCRITTASI INVERSE, enzimi che sintetizzano DNA usando uno stampo di RNA. Dopo l’estensione del filamento di DNA parentale da parte della telomerasi, la replicazione del filamento in ritardo all’estremità del cromosoma può essere completata, usando appunto queste estensioni come stampo per la sintesi del filamento complementare, da parte di una DNA polimerasi. Questo meccanismo, aiutato da una nucleasi che accorcia l’estremità 5’, assicura che

l'estremità 3' del DNA di ciascun telomero sia sempre più lunga dell'estremità 5' con la quale è appaiata, lasciando un'estremità sporgente a singolo filamento. Questa estremità sporgente a forma un'ansa all'indietro per infilare il suo terminale a singolo filamento nel DNA duplex della sequenza telomerica ripetuta creando una struttura chiamata ansa t. Essa fornisce all'estremità normale di un cromosoma una struttura unica che la protegge dagli enzimi di degradazione e la distingue chiaramente dalle estremità delle molecole rotte di DNA che la cellula ripara rapidamente.

Meccanismo d'azione delle TOPOISOMERASI: Man mano che la forcella si muove lungo il DNA a doppio filamento, crea degli avvolgimenti. Ad ogni 10 coppie di basi corrisponde un giro completo intorno all'asse della doppia elica parentale. Quindi affinché la forcella si muova, l'intero cromosoma davanti

ad essadovrebbe ruotare velocemente. Questo richiederebbe un'enorme quantità di energia per cromosomi lunghi quindi si usa un metodo diverso: si forma un perno nell'elica di DNA ad opera di proteine dette DNATOPOISOMERASI. Queste DNA topoisomerasi vengono viste come una nucleasi reversibile che si legatramite legame covalente ad un fosfato del DNA, rompendo così un legame fosfodiestere su un filamento di DNA. Ci sono 2 tipi di topoisomerasi:

1. TOPOISOMERASI I: produce una temporanea rottura a singolo filamento; questa rottura permette alle due sezioni dell'elica di DNA su entrambi i lati della rottura di ruotare liberamente l'una rispetto all'altra, usando il legame fosfodiestere nel punto opposto del filamento come perno.
2. TOPOISOMERASI II: forma un legame covalente con entrambi i filamenti dell'elica di DNA, producendo una rottura a doppio filamento transitoria nell'elica. Questo enzima è attivato da siti sui cromosomi in cui

Due doppie eliche si incrociano. Una volta che una molecola di topoisomerasi II si lega a questo sito di incrocio, la proteina usa l'idrolisi di ATP per svolgere in modo efficiente la seguente serie di reazioni:

1. Rompe reversibilmente una doppia elica per creare un varco nel DNA;
2. Fa passare la seconda doppia elica vicina attraverso la rottura;
3. Risalda la rottura e si dissocia dal DNA.

In questo modo le DNA topoisomerasi II possono separare in modo efficiente due cerchi di DNA interconnessi. La stessa reazione impedisce anche il grave problema di aggrovigliamento del DNA che sorgerebbe altrimenti durante la replicazione.

SCHEMA DEI PASSAGGI ENZIMATICI NELLA REPLICAZIONE DI E. COLI

1. La topoisomerasi fa rilassare il filamento;
2. La proteine iniziatrice si lega al complesso ori-C;
3. Due elicasi (una per ciascuna forca replicativa) denaturano e svolgono un tratto della doppia elica;
4. Le single-strand binding proteins stabilizzano il DNA ad elica singola, senza coprire le basi;

LA RNA polimerasi (primasi) si lega all'elicasi e sintetizza un innesco di circa 30 paia di basi (FILAMENTO LEADING);

La DNA Polimerasi III lo estende da 5' a 3';

Ad ogni passaggio la DNA P III rimuove gli appaiamenti sbagliati tramite un processo chiamato PROOF-READING;

La DNA P I degrada l'innesco ed estende il filamento adiacente procedendo da 5' a 3' (FILAMENTO LAGGING);

La ligasi salda i filamenti adiacenti senza aggiungere alcun nucleotide.

Il replicone è un segmento di DNA che possiede un inizio di replicazione e si replica una volta ad ogni divisione cellulare. Il filamento leading e il filamento lagging occupano entrambe le eliche in posizioni diverse.

-SISTEMI DI CORREZIONE E RIPARO DEL DNA

➢ Correzione di bozze (PROOF-READING) = durante la replicazione la DNA polimerasi può eliminare una base incorretta attraverso l'attività 3'-5' fosfodiesterasica

➢ Riparo dei misappaiamenti = la coppie di basi non

corrette sul filamento nuovo vengono riparate da un complesso proteico che segue la polimerasi in duplicazione. La metilazione del DNA consente di distinguere il filamento vecchio dal nuovo.

Riparo per escissione = le basi modificate da agenti chimici successivamente alla replicazione del DNA vengono riconosciute e riparate.

CAUSA DELLE MUTAZIONI:

• Errori di replicazione
• Danni chimici. Il DNA è una molecola fragile e subisce facilmente delle perdite o alterazioni di basi oppure rottura dello scheletro
• Inserimento di trasposoni

RIPARAZIONE DEL MISMATCH: il mismatch repair è parte della replicazione. In E. Coli il DNA viene analizzato per distorsioni da Mut S (un dimero), lo distorce ulteriormente e recluta Mut L, il quale a sua volta ha il compito di reclutare Mut H che taglia il filamento vicino al mismatch. Poi intervengono: elicasi, esonucleasi, DNA P III e ligasi. Il filamento nuovo su cui effettuare il taglio viene riconosciuto dalla metilazione della A nella

sequenza CTAG ad opera della Dam-metilasi. Negli eucarioti il procedimento è diverso e sono diversi anche i componenti necessari: essi hanno degli omologhi di Mut S con più alta specificità. Non hanno Dam-metilasi. Essi riconoscono il filamento stampo dalle incisioni dei frammenti di Okazaki, e sono associate a sliding clamp (proteine che hanno la funzione di promozione o di processamento nella replicazione del DNA. Esse mantengono le DNA polimerasi agganciate al filamento di DNA da replicare)

TRASCRIZIONE DEL DNA:

Si divide in tre fasi:

1. INIZIO: il promotore indica alla polimerasi dove iniziare la trascrizione, quale filamento leggere e la direzione in cui procedere
2. ALLUNGAMENTO: l'RNA polimerasi legge il filamento del DNA stampo in direzione 3' → 5' e produce il trascritto di RNA aggiungendo nucleotidi all'estremità 3'
3. TERMINAZIONE: quando l'RNA polimerasi raggiunge il sito di terminazione, il trascritto di RNA

vieneliberato dallo stampo. I segnali di terminazione sono solo nella sequenza di DNA, ma espletano laloro funzione solo quando sono trascritti in mRNA.

-RNA POLIMERASI: sintetizza RNA in direzione 5’→3’, non necessita di un innesco, utilizza ribonucleasi5’trifosfato e richiede Mg⁺⁺, seleziona ogni nucleotide in base alle regole di complementarietà A:U e G:C ealla geometria della coppia di basi.

Sequenza codificante: sequenza di DNA 5’→3’ = CATENA SENSO (+)

Sequenza stampo: sequenza complementare di DNA in direzione 3’→5’ = CATENA ANTISENSO (+)

(5’) CGCTATAGCGTTT (3’) DNA codificante

(3’) GCGATATCGCAAA (5’) DNA stampo

(5’) CGCUAUAGCGUUU (3’) RNA

Gli enzimi della trascrizione negli eucarioti: l’enzima che sintetizza RNA copiando DNA è una RNA PolimerasiDNA-dipendente. Negli eucarioti esistono tre diverse RNA polimerasi che trascrivono categorie distinte digeni:

▪ RNA

polimerasi I = rRNA 28S; 18S;

RNA polimerasi II = RNA che codifica polipeptidi, snRNA, miRNA

RNA polimerasi III = rRNA, tRNA + altri piccoli RNA

L'enzima RNA polimerasi trascrive il DNA ma non è in grado, da solo, di iniziare il processo di trascrizione, né di scegliere l'esatto punto d'inizio della trascrizione (TSS).

IL PROMOTORE

L'iniziazione ad un promotore eucariotico coinvolge un gran numero di fattori che si legano a diversi cis-acting elements. Il promotore è definito come la regione di DNA che contiene tutti questi siti di legame, cioè che inizia la trascrizione con efficienza normale e controllo appropriato.

SEQUENZE CONSENSO DI RNA P II: sono delle sequenze consenso trovate in prossimità dello START point di Pol II, di solito ne sono presenti 2 o 3, la più comune è TATA box. Essa è, appunto, una breve sequenza di DNA a doppia elica a cui si attacca un fattore di trascrizione TFIID (II = 2) (i fattori