Appunti biologia molecolare

Appunti di biologia molecolare

La biologia molecolare studia le funzioni biologiche a livello molecolare delle macromolecole informazionali.

Definizioni

• Acidi nucleici: molecole che codificano l’informazione genetica DNA e RNA.
• Gene: segmento di DNA che contiene le informazioni necessarie per la produzione di una proteina.
• Genoma: insieme delle sequenze di DNA di un organismo. Ci sono genomi a DNA tipici degli organismi unicellulari e pluricellulari e genomi a RNA tipici di alcuni virus.

Il genoma umano

Il genoma umano, similmente ai genomi di tutti gli animali pluricellulari, è costituito da due componenti distinte:

1. Genoma nucleare: contiene circa 3 miliardi di nucleotidi raggruppati in molecole lineari dette cromosomi:
   • 22 coppie di autosomi cioè cromosomi uguali.
   • 1 coppia di cromosomi sessuali X e Y (XX nelle donne e XY negli uomini).

   Le cellule sessuali, o gameti, sono aploidi, contengono cioè solo una copia per cromosoma (23 cromosomi in tutto) a differenza delle cellule somatiche che sono diploidi e contengono quindi due copie per ciascun cromosoma (46 cromosomi in tutto).

2. Genoma mitocondriale: è una molecola di DNA circolare di circa 16 mila nucleotidi, presente in copie numerose nei mitocondri, gli organelli che generano energia utilizzata dalla cellula. Inoltre contiene informazioni per la sintesi di molecole di rRNA e tRNA.

Il progetto genoma umano

L'obiettivo di questo progetto è quello di determinare la sequenza nucleotidica dell’intero genoma nucleare umano. È un progetto pubblico ed è finanziato da governi e organizzazioni di tutto il mondo. Fino ad oggi è stato sequenziato circa l’84% del genoma umano ad esclusione di alcune regioni telomeriche (estremità dei cromosomi) e prossimali ai centromeri (centro del cromosoma).

Ogni essere umano ha una propria sequenza genomica individuale, ad eccezione dei gemelli omozigoti. Le principali differenze tra i genomi di due individui diversi sono:

• Polimorfismi: posizioni nella sequenza contenenti nucleotidi differenti.
• Microsatelliti: sequenze ripetute di nucleotidi differenti in numero tra un individuo ed un altro.

La sequenza del genoma

La sequenza nucleotidica del genoma è presente su ciascuno dei due filamenti della doppia elica del DNA. I due filamenti sono antiparalleli, uno è in direzione 5’→3’, l’altro in direzione 3’→5’:

5’- …AGATCGATACGAAAGTAC… - 3’
3’- …TCTAGCTATGCTTTCATG… - 5’

Dato un filamento è possibile costruire l’altro per complementarità. Il genoma contiene tutte le informazioni necessarie al funzionamento di un intero organismo. Ogni cellula contiene una copia del genoma. Alcune informazioni sono utilizzate allo stesso modo da ogni tipo di cellula, altre sono caratteristiche di determinati tipi di cellule. Esempio: Un neurone ed un leucocita (globulo bianco) contengono lo stesso genoma e quindi le stesse informazioni ma non le utilizzano tutte allo stesso modo.

La sequenza di un genoma è apparentemente una successione casuale di nucleotidi; in realtà sono distinguibili diversi tipi di elementi, strutturati in maniera ben precisa, ciascuno preposto ad una ben determinata funzione. Questi elementi sono:

• Geni: segmento di genoma contenente l’informazione per la sintesi di una proteina. L’espressione dei geni coinvolge un intermediario, chiamato RNA messaggero, che copia la sequenza del gene e la porta fino al citoplasma, dove viene tradotta affinché avvenga la sintesi della proteina (nei ribosomi). Non tutti i geni però codificano proteine, alcuni di essi, infatti, specificano vari tipi di RNA non codificante. Tra i geni ci sono delle regioni definite intergeniche che non hanno una funzione e per questo vengono chiamate junk DNA (DNA spazzatura). Parte del contenuto dei geni non viene trascritto ma può coordinare la stessa espressione genica. Tra queste regioni figurano i promotori, i terminatori e gli introni.
• Pseudogeni: sono copie non funzionali di geni. Essi sono geni inattivati in seguito ad una o più mutazioni nella loro sequenza nucleotidica. Una volta che uno pseudogene è diventato completamente non funzionale si degraderà per accumulazione di ulteriori mutazioni.
• Sequenze ripetute: la grande maggioranza del DNA intergenico è rappresentata da sequenze ripetute di vario tipo. Questo DNA ripetitivo può essere suddiviso in due categorie:
  • Ripetizioni intersperse: esistono 4 tipi SINE, LINE, Elementi LTR e Trasposoni a DNA. DNA ripetuto in tandem. Ciascun tipo di queste ripetizioni sembra derivare da un elemento trasponibile, cioè un segmento mobile di DNA in grado di spostarsi da una posizione ad un’altra del genoma lasciando una propria copia.
• Microsatelliti: sono ripetizioni in tandem di DNA in cui l’unità ripetuta è generalmente breve, fino a 13 bp (bp = base pairs – paia di basi). Non si sa se hanno una funzione, si sa solamente che derivano da un errore nel processo di replicazione del genoma durante la divisione cellulare, quindi potrebbero rappresentare semplicemente un prodotto inevitabile della replicazione genomica.

I genomi dei procarioti

I genomi dei procarioti sono molto più differenti da quelli degli eucarioti. Sono molto più piccoli, molto più compatti, sono contenuti in una singola molecola di DNA circolare e alcuni geni possono essere localizzati su molecole indipendenti di DNA più piccole chiamate plasmidi.

Percorso storico del DNA

Le tappe che hanno portato a identificare nel DNA il materiale ereditario:

• 1865 I geni sono dei fattori particolari.
• 1903 I cromosomi sono unità ereditarie.
• 1910 I geni sono localizzati nei cromosomi.
• 1913 I cromosomi contengono degli insiemi lineari di geni.
• 1927 Le mutazioni sono dei cambiamenti fisici nei geni.
• 1931 La ricombinazione è causata dal “crossing over”.
• 1944 Il DNA è il materiale genetico.
• 1945 Un gene codifica una proteina.
• 1953 Il DNA ha una struttura a doppia elica.
• 1958 Il DNA si replica in maniera semiconservativa.
• 1961 Il codice genetico è costituito da triplette di basi.
• 1977 Sequenziamento del DNA.
• 1997 Sequenziamento di interi genomi.

Johan Friedrich Miescher (1844-1895) è stato un biologo svizzero che isolò per la prima volta gli acidi nucleici. Egli evidenziò, infatti, nel 1869, la presenza di vari composti chimici ricchi in fosfato all’interno dei nuclei dei leucociti. La scoperta di tali molecole, che egli denominò nucleina, aprì la strada all’identificazione del DNA come molecola responsabile della conservazione e della trasmissione dei caratteri ereditari.

Un principio “trasformante” converte il ceppo R in S

Questo principio secondo cui il “fattore trasformante” è il DNA conduce alla scoperta di un fattore in grado di trasformare pneumococchi non virulenti in pneumococchi virulenti. Griffith lo chiamò fattore trasformante, fattore in grado di contenere le informazioni di un organismo. Grazie ai successivi esperimenti di Alfred Hershey e Martha Chase si arrivò a capire che le informazioni genetiche sono contenute nel DNA.

La regola di Chargaff

• La quantità di A è uguale alla quantità di T.
• La quantità di G è uguale alla quantità di C.
• La quantità di A+G è uguale alla quantità di T+C.

Le scoperte della Franklin

Il DNA è composto da due catene avvolte ad elica attorno ad un asse e la distanza tra le due catene è di 2 nanometri. Le basi del DNA sono accoppiate in modo complementare: l’adenina si lega alla timina con due legami idrogeno, mentre la citosina si lega alla guanina con tre legami idrogeno. Ogni coppia di basi è costituita dunque da una purina e una pirimidina. Le basi sono all’interno dell’elica, perpendicolari all’asse. Il DNA è composto, oltre che da una base azotata, anche da uno zucchero pentoso e un gruppo fosfato.

Struttura: Zucchero + Base azotata = Nucleoside (legame dell’N1 della base azotata con il C1’ dello zucchero) Nucleoside + Fosfato = Nucleotide (legame estero dell’acido Fosforico con l’ossidrile in C5’ dello zucchero).

Struttura primaria degli acidi nucleici

Come per le proteine, gli acidi nucleici hanno una struttura primaria costituita dalla sequenza di basi e da una direzionalità che presenta un’estremità 5’ libera da un lato ed una 3’ libera dall’altro. Per convenzione le sequenze degli acidi nucleici sono scritte a partire dalla 5’ finendo alla 3’. Secondo questa convenzione i legami fosfodiesteri vanno dal 3’ al 5’.

Struttura secondaria del DNA

Tale struttura non è casuale ma è dovuta ai legami idrogeno che si formano tra le basi. Ci sono circa 10 basi per giro d’elica. Watson e Crick proposero che la doppia elica fosse stabilizzata dalla formazione di legami a idrogeno tra le basi presenti sui filamenti opposti secondo lo schema A-T e G-C.

Stabilità della doppia elica

• La formazione della doppia elica è favorita da:
  • Interazioni idrofobiche derivanti dall’appaiamento delle basi e dalla formazione di legami a idrogeno tra le coppie di basi.
• La formazione della doppia elica è sfavorita da:
  • Repulsione elettrostatica dei fosfati che si trovano sullo scheletro dei filamenti.
  • Dall’entropia conformazionale.
  • Formazione di legami a idrogeno con l’acqua.

RNA

L’RNA è costituito da un singolo filamento, i nucleotidi non sono tutti uguali ma differiscono per la base. Ci sono 4 tipi differenti di basi:

• Adenina
• Citosina
• Guanina
• Uracile

L’informazione contenuta negli acidi nucleici è codificata nella sequenza di basi che compongono il filamento. L’RNA ha una struttura secondaria e terziaria. Esiste sotto forma di tre maggiori tipi: tRNA o RNA transfer, rRNA o RNA ribosomiale, mRNA o RNA messaggero. Altre forme meno importanti servono nello splicing dell’RNA.

• RNA transfer (tRNA): sono costituiti da 73-90 nucleotidi e servono alla sintesi delle proteine. DNA ed RNA a singolo filamento tendono ad assumere una conformazione random coil. Comunque tali molecole a filamento singolo contengono regioni con sequenze auto complementari (tRNA) dove la molecola può formare zone a doppio filamento con tRNA che contiene basi modificate.
• RNA ribosomiale (rRNA): contenuto nel ribosoma, un organello cellulare coinvolto nella sintesi proteica e consiste di due subunità, una piccola ed una grande (dove l’rRNA è parte integrante).
• RNA messaggero (mRNA): l’mRNA è una copia-stampo per la sintesi delle proteine. Viene assunta una struttura del tipo A o a singolo filamento. L’mRNA non contiene basi modificate.

Differenza tra DNA e RNA

1. Nel DNA le basi sono legate al 2’ desossiribosio con un legame n1’ glicosidico a formare un desossinucleotide.
2. Nell’RNA le basi sono legate al ribosio per formare un nucleotide con un legame n1’ glicosidico.
3. I desossiribonucleotidi sono degli esteri fosforici in posizione 5’ dei desossinucleosidi.
4. I ribonucleotidi sono dei monoesteri fosforici dei nucleosidi.

Gli acidi nucleici sono dei polimeri dei fosfati dei nucleotidi. I polimeri DNA e RNA sono formati da legami fosfodiestere tra gli OH 5’ di un nucleotide e il 3’ di un idrossile seguente. I nucleotidi sono acidi forti in quanto i due pKa del fosfodiestere sono tra 0,7 ed 1 e tra 6,1 e 6,3. Di conseguenza lo scheletro dell’RNA e del DNA sono normalmente carichi negativamente.

Struttura terziaria del DNA

A causa dell’estrema lunghezza del DNA la sua struttura terziaria è molto complessa e prevede dei superavvolgimenti (il DNA di batteri, mitocondri, plastidi e alcuni virus è costituito da un anello chiuso) cioè il DNA assume un aspetto incurvato o avvolto.

Il DNA

La maggior parte delle cellule contiene istruzioni complete per costruire un essere umano, il DNA è in gran parte nel nucleo, ma ce n’è dell’altro nei mitocondri delle cellule. Nel nucleo, il DNA è disposto in 23 coppie di “pacchetti” a forma di bastoncino chiamati cromosomi (una serie proviene dalla madre, l’altra dal padre). Ogni cromosoma contiene un filamento di DNA. I cromosomi sono costituiti da cromatina che consiste in fibre contenenti DNA e proteine. Quando una cellula non è in divisione, la cromatina si trova sotto forma di lunghi filamenti, mentre durante la divisione queste fibre si condensano e si rendono visibili come strutture distinte per forma e dimensioni. Specie umana: 46 cromosomi. I cromosomi sono presenti in coppie nelle cellule somatiche e i membri di una coppia sono i cromosomi omologhi. Se una cellula contiene 2 cromosomi di ogni tipo, cioè due serie di cromosomi, si dice che possiede un corredo cromosomico diploide; se invece è presente un solo cromosoma di ogni coppia di omologhi, si dice che il corredo cromosomico è aploide.

• Nell’uomo diploide = 46 cromosomi; aploide = 23 cromosomi.

Proteine associate al DNA

• Istoni: sono le proteine più abbondanti nei cromosomi. Il loro ruolo è quello di legarsi al DNA cromosomico carico negativamente, infatti sono proteine molto basiche. Ci sono 5 tipi di istoni associati al DNA eucariotico: H1, H2A, H2B, H3, H4.
• Proteine non istoniche: ne esistono di diversi tipi; alcune hanno ruolo strutturale, altre sono implicate nella regolazione dell’espressione genica (per esempio la RNA Polimerasi). Al contrario degli istoni differiscono notevolmente in numero e tipo, tra un tipo cellulare ed un altro dentro un organismo, in momenti diversi nello stesso tipo cellulare e in organismi diversi.

Compattazione del DNA nel nucleo

Il complesso di entrambe le classi di proteine (istoniche e non istoniche) con il DNA nucleare delle cellule eucariotiche è noto come cromatina. Gli istoni sono presenti in una tale quantità che la loro massa totale nella stessa cromatina è circa uguale a quella del DNA. Essi sono responsabili del primo livello di base dell’organizzazione dei cromosomi, il nucleosoma, un complesso DNA-proteine. La cromatina ha un ruolo fondamentale nella regolazione dell’espressione genica e la capacità degli istoni di legare il DNA è regolata da enzimi intranucleari che possono apportare modificazioni post-traduzionali soprattutto ai residui di lisina e arginina posti nel dominio N-terminale delle proteine istoniche. Gli istoni possono subire 4 tipi di modificazioni:

• Metilazione: la metilazione degli istoni aumenta lo stato di idrofobicità e la basicità delle porzioni N-terminali degli istoni: questo ne aumenta l’affinità per proteine specifiche e fattori di trascrizione. Generalmente la metilazione degli istoni si associa a repressione della genica, tuttavia ci sono esempi in cui la metilazione si associa ad attivazione dell’espressione genica.
• Acetilazione: i processi di acetilazione e deacetilazione sono importanti nella regolazione dell’attività della cromatina. L’acetilazione dei residui di lisina al terminale NH degli istoni rimuove le cariche positive riducendo quindi l’affinità degli istoni per il DNA: per questo l’acetilazione degli istoni facilita i processi trascrizionali, al contrario, la deacetilazione reprime la trascrizione. Acetil transferasi istoniche (HATs) e deacetilasi istoniche (HDs o HDACs).
• Fosforilazione: la funzione della fosforilazione degli istoni non è ancora ben chiara: è stato scoperto però che essa può facilitare l’attacco di HATs.
• Ubiquitazione

Replicazione del DNA

Ci sono tre modelli della replicazione del DNA:

1. Modello semiconservativo
2. Modello conservativo
3. Modello dispersivo

Processo:

1. La polimerizzazione del DNA avviene sempre in direzione 5’→3’.
2. L’elicasi si muove in una sola direzione, srotolando progressivamente l’elica.
3. I due filamenti antiparalleli non possono essere duplicati nello stesso modo.
4. Uno viene sintetizzato nella stessa direzione in cui si muove l’elicasi, cioè in direzione 5’→3’ e viene chiamato filamento guida.
5. L’altro non possiede un gruppo ossidrile 3’ al punto di biforcazione e quindi non può essere sintetizzato seguendo l’elicasi per questo viene chiamato filamento in ritardo.
6. Il filamento in ritardo viene, invece, sintetizzato in direzione opposta a quella in cui si muove la forcella di replicazione, mediante la sintesi progressiva di una serie di piccoli frammenti, detti frammenti di Okazaki, ciascuno polimerizzato in direzione 5’→3’.
7. Le estremità dei frammenti di Okazaki vengono ricongiunte mediante formazione di legami covalenti ad opera dell’enzima DNA ligasi (una topoisomerasi).

La sintesi del filamento ritardato a livello di una forcella di replicazione deve avvenire discontinuamente tramite un meccanismo di cucitura all’indietro che produce brevi frammenti di DNA. Questo meccanismo, però, incontra un problema quando la forcella di replicazione raggiunge un’estremità di un cromosoma lineare: non c’è posto per produrre l’RNA primer necessario per iniziare l’ultimo frammento di Okazaki. Gli eucarioti risolvono questo problema con un metodo ingegnoso: hanno sequenze nucleotidiche speciali alle estremità dei loro cromosomi che sono incorporate in strutture chiamate telomeri. Essi consistono di molte ripetizioni in tandem di una breve sequenza.