Appunti Biochimica delle molecole di interesse agroalimentare

Biochimica delle molecole di interesse agroalimentare

Relazione tra struttura chimica e funzione biologica

La struttura della molecola ha un significato notevole. Prendiamo in considerazione C6H12O6, che può essere sia glucosio che fruttosio in base alla loro diversa struttura. Il fruttosio appare più dolce rispetto al glucosio perché interagisce con le papille gustative in modo diverso. Ho quindi una diversa interazione che genera un diverso segnale causato a sua volta da una diversa struttura che causa diverse interazioni e quindi c'è una risposta differente.

Altro esempio sono i coenzimi NAD e NADP, molto simili per la loro struttura a differenza del gruppo fosfato. Tuttavia, hanno ruoli ben diversi: NAD è coinvolto nelle reazioni cataboliche mentre NADP è coinvolto a livello delle reazioni anaboliche. La loro azione dipende anche dal differente sito di legame della deidrogenasi: alcune saranno deidrogenasi NAD dipendenti e altre NADP dipendenti. Un esempio di deidrogenasi NADP dipendente è la shikimato deidrogenasi.

Altro esempio è la differenza tra amilosio e cellulosa: entrambi sono polisaccaridi derivati dal glucosio, tuttavia il primo ha legami α1-4 mentre il secondo β1-4. I due polimeri, l'amilosio, hanno però ruoli molto differenti tra loro: ha una funzione di riserva mentre la cellulosa ha una funzione di sostegno e rigidità. La differente conformazione alfa o beta del legame fa dipendere l'interazione dei polimeri con la molecola d'acqua. Infatti, dalla cellulosa vengono escluse le molecole d'acqua mentre dall'amilosio no.

Metabolismo

Il metabolismo è definito come la somma di tutte le reazioni biochimiche che avvengono in una cellula. Diversissimi enzimi possono essere raggruppati in poche categorie:

• Ossidoreduttasi (compiono reazioni redox)
• Transferasi (trasferiscono gruppi funzionali)
• Idrolasi (compiono reazioni di idrolisi)
• Liasi (tagliano alcuni legami ad esempio carbonio-carbonio)
• Isomerasi (svolgono reazione di isomerizzazione)
• Ligasi (creano nuovi legami tramite idrolisi della ATP)

Le vie del metabolismo primario convergono in pochi prodotti finali come i nucleotidi o acidi grassi. Molte vie metaboliche primarie sono essenziali per la produzione di energia o fissazione del carbonio. Proprio perché essenziali, le vie metaboliche primarie sono generalmente presenti in tutti i gruppi tassonomici, o almeno sono condivise in tutti i membri di un gruppo tassonomico. Un microrganismo semplice procariota unicellulare può essere usato quindi come modello per tutti i metaboliti primari, ad esempio Escherichia coli.

Le vie del metabolismo secondario invece divergono in tantissimi prodotti e molecole diverse: le cellule producono una grande quantità di molecole organiche come i metaboliti secondari, che non prendono parte direttamente alla crescita e allo sviluppo della cellula e sono tendenzialmente distribuiti in modo diverso nei vari gruppi tassonomici. Non è possibile utilizzare unità unicellulari semplici come modello per le vie secondarie. Uno studio approfondito e biotecnologico di questi metaboliti permette la loro applicazione. Ci sono decine di migliaia di metaboliti secondari. Questa conoscenza permetterebbe di capire quali precursori fornire all'organismo per poter sintetizzare metaboliti secondari di interesse.

Biosintesi di aminoacidi

Può avvenire dal citrato, e con il ciclo dell'acido citrico, da dove otteniamo come intermedi ossalacetato e alfa-chetoglutarato (metaboliti della glicolisi e del ciclo di Krebs). Questi sono precursori di alcuni amminoacidi con alcune semplici reazioni, che producono amminoacidi alifatici (da ossalacetato ad esempio aspartato e asparagina, da alfa-chetoglutarato ad esempio glutammato e glutammina). La capacità di sintesi degli amminoacidi varia a seconda degli organismi: le piante riescono a sintetizzare tutti gli aminoacidi, mentre l'uomo può sintetizzare circa 20 o comunque meno, quindi è necessaria un'integrazione con aminoacidi essenziali, ovvero amminoacidi che vengono assunti con la dieta.

Altri amminoacidi derivano dal 3-fosfoglicerato (serina, glicina, cisteina) o dal PEP o dal piruvato (alanina principalmente). Dal PEP derivano fondamentalmente gli aminoacidi aromatici, con l'aiuto di un'altra molecola ovvero eritrosio-4-fosfato che deriva dalla via dei pentoso fosfato. Tutti e tre gli aminoacidi aromatici sono essenziali nei mammiferi. Gli amminoacidi aromatici contengono un anello. Tecnicamente anche l'istidina ha un anello imidazolico che ha un carattere aromatico, ma non viene considerata tra questi. Fenilalanina e tirosina hanno un anello che proviene dal metilbenzene (toluene), mentre il triptofano ha una struttura che deriva dall'indolo. Gli anelli hanno una struttura planare molto stabile grazie alle moltissime strutture di risonanza nell'anello aromatico. La delocalizzazione degli elettroni fa sì che l'anello aromatico abbia una buona proprietà ottica con assorbimento della luce a circa 270-280 nm.

Soprattutto il triptofano ha una buona proprietà di fluorescenza intrinseca: energia assorbita a 280nm viene riemessa ad energia minore (lunghezza d'onda maggiore, a 340 nm). La fluorescenza viene rilevata da un fluorimetro. Tramite questa fluorescenza possiamo analizzare lo stato di denaturazione della proteina. La proteina globulare si disavvolge e ho tendenza a esporre i gruppi aromatici, normalmente all’interno, al solvente. Ho quindi un aumento di fluorescenza. Esperimento: riscaldo la cuvetta e valuto la relazione con la fluorescenza: normalmente noto che aumentando la temperatura aumento anche la fluorescenza (maggiore di denaturazione).

Nelle piante, la via di sintesi degli amminoacidi è molto importante. Nelle piante, il 20% del carbonio viene utilizzato per gli amminoacidi attraverso questa via, che utilizza PEP ed eritrosio-4-fosfato. Questa via può essere definita come via dello shikimato, ed è presente nelle piante ma assente negli animali. Nelle piante, tutti gli enzimi della sintesi degli amminoacidi aromatici sono nei plastidi. Infatti, quando questi enzimi vengono sintetizzati possiedono un peptide chiamato "transit peptide", che è costituito da circa 40 residui amminoacidici e permette l’indirizzamento ai plastidi.

Formazione shikimato e corismato

La via dello shikimato porta a un intermedio che è lo shikimato (metabolita che dà il nome alla via) e un altro intermedio che è il corismato (molto importante perché porta alla ramificazioni del triptofano e alla sintesi della fenilalanina e tirosina tramite ramificazione del prefenato). La prima reazione è la condensazione aldolica tra PEP ed eritrosio-4-fosfato, con liberazione di un gruppo fosfato e formazione di DAHP (enzima è la DAHP sintasi). Più precisamente è una reazione di trasferimento di un gruppo alchilico (alchil transferasi) dal fosfato all'altra molecola. L’enzima è quindi non una ligasi ma in realtà è una transferasi. Questo è il principale punto di regolazione della via fondamentalmente attraverso inibizione a feedback negativo. Nelle piante, invece, questo punto della via è regolato a livello trascrizionale.

A questo punto, questa struttura lineare tende spontaneamente a ciclizzare formando un eterociclo, che non è la forma più favorevole però per fare le reazioni successive. Attraverso una deidrochinato sintasi e l'utilizzo di una molecola di NAD+ e perdita di un gruppo fosfato, viene sintetizzato tre 3-deidrochinato (si forma un chetone a seguito di ossidazione dell’ossidrile, poi perdita di gruppo fosfato, e anche temporaneamente apertura dell'anello per riarrangiarsi e richiudersi a formare la nuova molecola). Qui il NAD+ è proprio un cofattore della reazione: viene temporaneamente ossidato e ridotto durante il ciclo catalitico della reazione, nella stessa reazione enzimatica.

Attraverso due reazioni si forma shikimato. La prima reazione è la perdita di una molecola d'acqua attraverso la 3-deidrochinato deidratasi, con conseguente formazione di un doppio legame. La seconda reazione è svolta da una shikimato deidrogenasi NADP dipendente e si ha la riduzione del carbonile a ossidrile utilizzando una molecola di NADPH e formando in questo modo lo shikimato. Il nome shikimato deriva dallo shikimi (anice stellato giapponese).

Formazione corismato

Altri tre passaggi portano alla formazione del corismato. Il primo passaggio è la fosforilazione in posizione 3 dello shikimato tramite l'enzima shikimato chinasi, poi interviene la EPSP sintasi che aggiunge un'altra molecola di PEP con perdita di un gruppo fosfato (anche qui è una transferasi perché ho il trasferimento del gruppo piruvico dal PEP allo shikimato-3-fosfato), e infine grazie alla corismato sintasi viene prodotto corismato (l'enzima contiene come cofattore un trasportatore di elettroni con un gruppo flavinico). Corismato è un intermedio metabolico molto importante, che fornisce lo scheletro per amminoacidi aromatici e anche per alcuni metaboliti secondari. È il precursore anche dell’acido salicilico, degli ubichinoni (la porzione ciclica chinonica deriva dal corismato), della vitamina K (menochinone e fillochinone con la loro parte ciclica), della Vitamina E (partecipa alla parte della struttura della testa).

Sintesi del triptofano a partire da corismato

Nella prima reazione viene introdotto un atomo di azoto, importante perché servirà per sintetizzare la struttura indolica. L'enzima antranilato sintasi catalizza la reazione che porta alla formazione di antranilato a partire da corismato. Viene utilizzata glutammina come donatore di un gruppo amminico (che formerà la struttura indolica). La glutammina, donato il gruppo amminico, si trasforma in glutammato. Il gruppo amminico non è quello in posizione alfa ma è quello terminale della glutammina. È necessario poi anche un PRPP ovvero fosforibosilpirofosfato, che deriva dalla via dei pentoso fosfato. La porzione fosforibosilica viene trasferita dal pirofosfato tramite l'enzima antranilato fosforibosiltransferasi. Detto in altri termini, l’antranilato è caricato con un fosforibosile.

Successivamente questo fosforibosile in forma ciclizzata viene linearizzato con una reazione di isomerizzazione. Avviene quindi un riarrangiamento che è possibile con la struttura lineare aperta che va a formare la struttura indolica: è una decarbossilazione che fornisce l'energia necessaria per sintetizzare il nuovo legame. Si forma così indolo legato a 3-glicerolofosfato. Interviene quindi PLP (cofattore della triptofano sintasi) che catalizza la formazione di triptofano in due passaggi: prima fuoriesce la gliceraldeide-3-fosfato e poi viene sostituita da una serina con liberazione di una molecola d'acqua. In tutto ciò, l'enzima rimane sempre legato alla struttura indolica anche quando è libero o non legato da serina o gliceraldeide-3-fosfato.

L'enzima triptofano sintasi nei batteri è costituito da due subunità: una che catalizza la prima reazione e una che catalizza la seconda reazione. Le subunità alfa e beta sono molto vicine e intrappolano l'indolo all'interno della struttura durante la reazione. L'indolo è una molecola importante perché è una molecola segnale nei batteri, ad esempio per la formazione di biofilm o resistenza a condizioni avverse. Nelle piante e nei funghi queste funzionalità vengono svolte da due domini distinti della stessa proteina, e non su due subunità diverse. Si pensa che tutti gli enzimi coinvolti nella via da corismato a triptofano si trovano in un unico complesso enzimatico di molte subunità. Non si è sicuri perché le condizioni di estrazione non sono così blandi da poter estrarre tranquillamente questi enzimi in un unico complesso. Si è visto che in alcuni sistemi batterici e fungini i siti attivi di questa via sono organizzati in domini di un'unica catena polipeptidica (cosa che succede quando una via è particolarmente importante e ha un alto flusso metabolico). Un metabolita prodotto in una tappa si trova già pronto in posizione per poter svolgere la seconda tappa e così via. Grande vantaggio in termini di velocità di reazione.

Sintesi di fenilalanina e tirosina da corismato

Nelle piante, la sintesi avviene nei plastidi, in una via chiamata ramificazione del prefenato. Nella prima reazione è coinvolta una isomerasi (corismato mutasi) dove dal corismato si forma prefenato per spostamento di un gruppo piruvico. A questo punto possiamo avere una decarbossilazione ossidativa a formare 4-idrossifenil piruvato (enzima prefenato deidrogenasi) oppure interviene una deidratasicon decarbossilazione e rimozioni di OH- per formare fenilpiruvato. Nel primo caso, il 4-idrossifenilpiruvato tramite una aminotransferasi subisce una reazione di transaminazione (cambiati gruppo chetonico di un chetoacido con un gruppo amminico di un aminoacido) da parte del glutammato e diventa tirosina. Nel secondo caso avviene un'altra reazione di transaminazione con glutammato con formazione di fenilalanina, che a differenza della tirosina non ha un gruppo OH in para ed è quindi più idrofobico.

Nella maggior parte dei batteri e funghi la transaminazione è l'ultimo step nella via mentre nelle piante e in pochi batteri è il primo step della via: inizialmente ho la reazione di transaminazione tramite l'enzima prefenato aminotransferasi con formazione di arogenato, e poi con una arogenato deidrogenasi o deidratasi ottengo rispettivamente tirosina e fenilalanina. Ho sostanzialmente le stesse reazioni ma con un ordine diverso che mi portano però allo stesso prodotto finale. Negli animali, la tirosina può essere sintetizzata attraverso idrossilazione della fenilalanina attraverso un enzima chiamato fenilalanina idrossilasi, che richiede un cofattore BH4 che è ossidato durante la reazione e che poi verrà di nuovo ridotto da un'altra attività enzimatica NADPH dipendente.

Il difetto della fenilalanina idrossilasi causa la fenilchetonuria (malattia i cui sintomi sono dovuti all’accumulo di fenilalanina, che potrebbe provocare un ritardo nello sviluppo neuronale). L’accumulo di fenilalanina dovuto a un deficit dell’enzima idrossilasi e conseguente carenza di tirosina provoca anche la carenza di alcuni neurotrasmettitori da esso derivati. Dal corismato derivano numerosi gruppi importanti di molecole come i chinoni o fillochinoni eccetera.

Biotecnologie: EPSP sintasi

La EPSP sintasi è un enzima della via dello shikimato ed è il target dell'erbicida glifosato. Il glifosato è una molecola competitiva rispetto al PEP. Il glifosato è un composto ammino-fosforico e può inibire la reazione perché è un analogo del PEP. Per questo motivo è un erbicida non selettivo che agisce su tutte le piante senza distinzioni di specie, che entra nella circolazione floematica. Il glifosato si inserisce nella membrana e viene trasportato dal floema fino ai merisistemi metabolicamente molto attivi e particolarmente suscettibili alla sua azione. Gli effetti sono la perdita di turgore e ingiallimento dei tessuti. Nei terreni, il glifosato può essere utilizzato come erbicida ad esempio poco prima della semina per eliminare le erbe che non ci interessano.

Glifosato prende il nome da glicina e fosfonato, che sono le molecole iniziali per la sua sintesi. L'enzima EPSP è costituito da due domini globulari che possono presentarsi nella conformazione aperta o chiusa. Il substrato shikimato-3-fosfato favorisce la conformazione chiusa dell'enzima al quale il glifosato (o PEP) può andare a legarsi formando un complesso ternario. In presenza del glifosato si blocca nella conformazione chiusa senza riuscire a tornare nella conformazione aperta. Il glifosato instaura un network con tutta una serie di interazioni elettrostatiche con altri amminoacidi che costituiscono il sito catalitico. Abbiamo due classi di EPSP sintasi: la prima è rappresentata da Escherichia coli, la seconda da un ceppo di Agrobacterium. Quello di classe uno si trova in tutte le piante e in alcuni gram negativi, e hanno la caratteristica di essere sensibili alle concentrazioni di micro molare, quelli di classe due invece si trovano in alcuni batteri principalmente gram positivi e tollerano l'azione del glifosato.

La differente resistenza all’erbicida glifosato dipende dalla sostituzione di alcuni amminoacidi tra le due classi differenti. In alcuni studi, la glicina 96 è stata sostituita con un’alanina, e si è visto che questa EPSP sintasi riusciva a tollerare il glifosato ma aveva una bassa efficienza catalitica. Venne sostituita anche la prolina 101 con una alanina, e si è notato un miglioramento sia nella tolleranza al glifosato, sia una discreta efficienza catalitica. Nelle EPSP di classe II, entrambi gli amminoacidi sono sostituiti: glicina 96 è sostituita da un alanina 100 mentre la prolina 101 è sostituita da una leucina 105. La sostituzione Ala100Gly in EPSP di CP4 (batterio isolato dalle fabbriche di glifosato) rimuove la tolleranza del glifosato e viceversa.

Trattare il terreno con il glifosato permetterebbe di eliminare le malerbe prima della loro crescita, per effettuare poi una semina senza malerbe. In questo modo riduco di molto il coinvolgimento del terreno nei processi di coltivazione (ad esempio non devo fare aratura o comunque molto meno, e questo è conveniente perché non sconvolgo le proprietà chimico-fisiche del terreno ogni volta). Un problema che si sta sviluppando è la resistenza agli erbicidi. Utilizzando sempre gli stessi erbicidi infatti, tramite un meccanismo di selezione naturale, si sviluppano sempre più piante tolleranti.