Appunti di Biochimica

M

piccola la K , tanto più è efficiente l’enzima,

M

perché vuole dire che basta una concentrazione

di substrato per raggiungere la metà della

velocità massima.

Menten studiò medicina all’università di Toronto, una delle prime donne, infatti completò la tesi in

USA, perché le donne in Canada a quei tempi non potevano fare ricerca. Lavorò poi in Germania,

dove incontrò Michaelis, e insieme scoprirono che la velocità di una reazione enzimatica è

proporzionale alla quantità del complesso enzima-substrato.

Michaelis-Menten effettuarono un’ipotesi secondo cui l’enzima si associa al substrato in maniera

reversibile formando un complesso ES, ipotizzando che quest’ultimo si scindesse in E e in prodotto

della reazione P. Questa reazione di dissociazione di ES a dare E + P sarebbe più lenta della prima E

+ S a dare ES, quindi è limitante. Pertanto secondo questa teoria la

velocità della reazione dipenderebbe dalla concentrazione del

complesso ES.

1 -1

K è la costante di velocità per la formazione di ES, a partire dall’enzima E e dal substrato S. K è

la costante di velocità per la reazione inversa, quindi la dissociazione dle complesso ES in enzima

2

libero E ed S. La K è la costante di velocità per la conversione del complesso ES nel prodotto P con

rilascio dell’enzima E. I catalizzatori possono essere rigenerati al termine della reazione, E libero si

rigenera e può catalizzare di nuovo la trasformazione di nuovo substrato S in prodotto P.

Immaginando di misurare la velocità di una reazione enzimatica a concentrazioni variabili di

substrato. Si ha una certa concentrazione di enzima e aggiungiamo concentrazioni crescenti di

substrato e misuriamo la velocità, che è la trasformazione del substrato in prodotto. La velocità

dipende dunque dalla concentrazione del substrato, poi si forma il prodotto che allo stesso tempo si

può convertire in substrato. Per questo ultimo motivo è preferibile misurare la velocità inziale della

reazione, che è anche detta V , trascurando la riconversione del prodotto in substrato. Se riportiamo

0 72

in grafico, cioè la velocità subito dopo che l’enzima e il substrato sono stati miscelati, praticamente

si aggiunge il substrato all’enzima e si misura la velocità.

Se mettiamo in un grafico i dati sperimentali della velocità a

concentrazioni crescenti di substrato vediamo che nella parte

iniziale della curva, quindi a bassa concentrazione di substrato, la

reazione è di primo grado , e la velocità quindi

dipende dalla concentrazione del substrato, in questo caso la

maggior parte dell’enzima sarà libera. Quando la concentrazione

del substrato aumenta, aumenta anche il complesso ES, finché

nella parte finale, quando c’è tantissimo substrato, si raggiunge la

velocità massima della reazione, quando si verifica che tutto

l’enzima è complessato da tutto il substrato a dare ES, quindi a

questo punto anche se aggiungiamo altro substrato non c’è un

aumento di velocità. In questa parte finale della curva, la reazione ha

una cinetica di ordine 0 e la curva va a plateau,

quindi la velocità è indipendente dalla concentrazione del substrato,

perché i siti attivi di tutte le molecole di enzima sono saturati. Se

l’enzima lavora a metà della velocità massima a piccolissime

concentrazioni di substrato, significa che l’affinità dell’enzima per

il substrato è alta. La K è una misura inversa dell’affinità

M

dell’enzima per il substrato, più è bassa la K più alta è l’affinità.

M

Il meccanismo generale delle reazioni enzimatiche implica il legame dell’enzima E al substrato S per

formare ES, da cui poi si forma il prodotto. La velocità di formazione del complesso ES sarà la

variazione della concentrazione di S nel tempo, che sarà uguale alla costante di velocità per la

concentrazione di E e la concentrazione di S . Per quanto riguarda la

velocità di dissociazione del complesso ES, vediamo che ES si dissocia mediante due reazioni

distinte, quindi può scindersi di nuovo in E e S, oppure può dare luogo al prodotto, con rilascio di E.

La velocità di dissociazione del complesso ES è la somma della velocità di queste due reazioni,

-1

ovvero la variazione del complesso ES nel tempo, che sarà uguale a k per la concentrazione ES più

2

la k per la concentrazione di ES. Il segno negativo indica che la concentrazione di ES diminuisce via

via che il complesso si dissocia .

Gli enzimi sono in grado di reagire con il substrato in modo efficiente, e presto si raggiunge uno stato

in cui la velocità di formazione del complesso ES è uguale alla velocità della sua dissociazione, e

questo stato è detto stato stazionario (equazione stato stazionario).

Per ricavare la concertazione dell’enzima libero dobbiamo sottrare la concertazione dell’enzima

totale meno la concentrazione di ES. 73

Se la concentrazione del substrato è molto alta, allora la K , che è anch’essa una concentrazione può

M

essere trascurabile. La velocità è messa in relazione con due parametri che sono V e K , che

max M

si possono ricavare dai dati sperimentali. La velocità è costante quando

l’enzima è saturato con il substrato ed è la velocità massima dell’enzima.

Quando la concentrazione del substrato è uguale alla K , la velocità è uguale

M

alla velocità massima diviso due.

Questo ci permette di calcolare la V e la K da un grafico, tuttavia si preferisce calcolare i dati da

max M

una retta e non da una curva, pertanto si trasforma l’equazione della velocità in equazione della retta,

tenendo conto dei due rispetti parametri V e K .

max M

Questa nuova equazione ci permette di

ottenere dai dati sperimentali, quindi

dalla concentrazione di S e dalla

velocità, una retta, dalla quale poi

possiamo calcolare i valori di V e

max

K . Se y = 0 allora possiamo ricavare

M

l’intercetta con x. 74

La concentrazione del substrato sull’asse delle x si esprime come

1/concentrazione del substrato e i valori molto alti di concentrazione del

substrato non sono sperimentalmente facili da avere perché in un esperimento

pratico non si possono mettere alte concentrazioni di substrato sempre, quindi è

comodo estrapolare la retta, che passa per i punti

sperimentali e che permette di ricavare V e K . Quando

max M

X=0 si può trovare b ricavando la V , invece quando y=0

max

possiamo ricavare dal valore di intercetta con la x, il valore

di km, infatti: Y=0 → x=-1/K :

M

Per esempio l’esochinasi (enzima che fosforila) ha come substrato l’ATP, o il D-glucosio o il D-

fruttosio ma ha più affinità per il glucosio poiché la Km risulta più bassa. L’esochinasi è in grado di

convertire il glucosio in glucosio-6fosfato, il quale poi rimane intrappolato nelle cellule finché il

valore glicemico non è tornato a livelli normali. Per questo è importante che nel cervello ci sia un

ingresso continuo di glucosio nelle cellule, anche perché le cellule del cervello sono dipendenti dal

glucosio, metabolizzano preferenzialmente il glucosio. In mancanza di glucosio si ricorre ai corpi

chetonici che sono il prodotto dall’ossidazione

degli acidi grassi. Quindi l’esochinasi che fa

entrare il glucosio nelle cellule ha un’affinità

molto alta per quest’ultimo.

K è una concentrazione, a livello biologico le

M

affinità si esprimono nell’ordine del nano

molare, mentre sperimentalmente si arriva anche

al millimolare, più è bassa più è alta l’affinità.

La Km è la concentrazione del substrato al quale

il 50% dei siti attivi sono impegnati.

Se dovessimo calcolare la V e K dai dati riportati in tabella, dobbiamo applicare

max M per poi ottenere 1/V e 1/[S].

Si usano le concentrazioni

appropriate e riportiamo in

grafico i valori, indicando

cos’è l’asse y e cos’è l’asse

x. Si identifica l’intercetta

-1

che è per l’asse x -0.155 mM , mentre per l’asse y 12. Se l’intercetta con allora

Se l’intercetta con allora 75

Un inibitore ostacola la reazione enzimatica rallentandone la velocità di reazione, è una sostanza che

interferisce con l’azione dell’enzima. Esistono inibitori reversibili, che si legano all’enzima e poi

possono essere rilasciati, lasciando l’enzima nella condizione originale; irreversibili, reagiscono con

l’enzima causandone il cambiamento in una proteina che non è più enzimaticamente attiva. Uno di

questi può anche creare un legame covalente permanente, per cui in entrambi i casi non è più possibile

ripristinare l’enzima originario. Vedendo un grafico di cinetica enzimatica, in presenza o assenza di

inibitore si può riconoscere qual è la retta che rappresenta la cinetica enzimatica in presenza

dell’inibitore, si può anche capire se l’inibitore è di tipo competitivo oppure no, in base alla cinetica.

L’ inibizione competitiva è propria di una classe di inibitori con strutture molto simili al substrato,

che ingannano l’enzima poiché questo li riconosce, gli inibitori si legano al suo sito attivo ma l’enzima

non può trasformarli in prodotti, quindi l’enzima viene bloccato. Quindi l’inibitore può occupare il

sito attivo dell’enzima, bloccandone l’accesso al substrato. In presenza

di un inibitore competitivo possiamo scrivere due reazioni mutuamente

esclusive. L’equilibrio per la dissociazione del complesso enzima

inibitore è L’enzima in grigio è una

proteina globulare e c’è una competizione per chi si lega al sito attivo

tra substrato (giallo) e inibitore (arancione). Partendo dall’enzima

libero, il substrato o l’inibitore possono legarsi all’enzima, ma siccome

si possono legare allo stesso sito attivo, lo

possono fare una sola volta e quindi competono. La cinetica enzimatica in presenza di un inibitore

competitivo cambia come riportato nel grafico.

La retta blu è in assenza di inibitore, la retta verde

ha una concentrazione dell’inibitore e quella rosa

ha due volte la concentrazione dell’inibitore della

retta verde: l’intercett