Appunti degli studenti per corsi ed esami del Prof. Forlani Fabio

Introduzione. Il significato della diversità molecolare. Aspetti generali del metabolismo. Le diverse categorie di reazioni enzimatiche. Aspetti generali del metabolismo secondario. Gli amminoacidi come precursori di molti metaboliti secondari. Biosintesi degli amminoacidi (aspetti generali). Caratteristiche generali degli amminoacidi aromatici. Biosintesi degli amminoacidi aromatici. La via dell'acido shikimico (formazione dell'anello). La via dello shikimato (sintesi corismato). Ramo del prefenato e sintesi di fenilalanina e tirosina. Diversità tra batterifunghi e piante del ramo del prefenato. Ripasso: le reazioni di transaminazione. Sintesi di tirosina da fenilalanina: fenilalanina idrossilasi (fenilchetonuria). Regolazione della via dello shikimato nei batteri e nelle piante (cenni). Riassunto: precursori della sintesi degli amminoacidi aromatici. EPSP sintasi, sito di azione del glifosato. Meccanismo attività del glifosato. Residui amminoacidici della EPSP sintasi coinvolti nella interazione con il glifosato. EPSP sintasi glifosato-tolleranti. Piante glifosato-resistenti Aspetti positivi e negativi dell'utilizzo del glifosato (cenni). Approfondimento: espressione ricombinante di proteine (cenni). Mutagenesi sito-diretta delle proteine (cenni). Procedura canonica generale dal gene alla pianta transgenica (cenni). Trasformazione mediata da Agrobatterio. I "Double Strand Breaks" (I parte). I "Double Strand Breaks" (II parte). Editing del genoma tramite il sistema CRISPR/Cas9 (cenni). Il fenilpropano: struttura di base dei fenilpropanoidi e di tirosina e fenilalanina. La via generale dei fenilpropanoidi. Fenilalanina ammonio liasi e tirosina ammonio liasi. Il cofattore MIO. Approfondimento: il sistema GS/GOGAT. La cinnamato idrossilasi. Approfondimento: gli enzimi della superfamiglia dei citocromi P450. Approfondimento: gli enzimi della superfamiglia dei citocromi P450. Le reazioni tipiche della biosintesi dei fenoli. Acetil-CoA, precursore per la porzione polichetidica dei flavonoidi. Acetil-CoA carbossilasi. Calcone sintasi. Dal calcone gli altri flavonoidi. Le altre polichetide sintasi di tipo III. Regolazione trascrizionale e promotore della calcone sintasi. Approfondimento: struttura generale di un promotore (cenni). Approfondimento: importanza biotecnologica dei promotori. Approfondimento: analisi dei promotori (cenni). Ruoli naturali dei flavonoidi: la vicenina-2. Ruoli naturali dei flavonoidi: coinvolgimento nella nodulazione. Ruoli naturali dei flavonoidi: gli antociani e i colori. Approfondimento: omica funzionale (metabolomica). Precursori metabolici dei terpenoidi. La via del mevalonato (MVA). Acetoacetil-CoA tiolasi e HMG-CoA sintasi: forme colesterogeniche e chetogeniche. HMG-CoA reduttasi: forme con diversa sensibilità alle statine. Dal mevalonato al IPP e DMAPP: ruolo del PPi. La via del metil-eritritolfosfato (MEP). La DXP reduttoisomerasi, target della fosmidomicina. Statine e fosmidomicina: strumenti per lo studio dell'origine metabolica dei terpenoidi. Localizzazione cellulare e tassonomica delle vie MVA e MEP. Biosintesi dei terpenoidi: la fase di allungamento: preniltransferasi e localizzazione cellulare. Biosintesi dei terpenoidi: le fasi di arrangiamento primario e secondario. Biosintesi dei terpenoidi: le fasi di arrangiamento primario e secondario (cenni) (II parte). Il taxolo (paclitaxel): scoperta, origine, biosintesi (cenni), localizzazione cellulare. Approfondimento: immunomarcatura. Il taxolo (paclitaxel): causa della citotossicità, ruolo fisiologico, diversa citotossicità in relazione alla struttura della tubulina. Marcatura per fotoaffinità: un approccio per studiare l'interazione ligando-proteina. Come sono stati superati i problemi nella produzione del taxolo. Prospettive di miglioramento nella produzione del taxolo: colture di cellule vegetali transgeniche. Colture cellulari vegetali: procedura generale (cenni). Vantaggi e svantaggi nell'utilizzo delle colture cellulari vegetali per la produzione di molecole di interesse. Ingegneria metabolica: le diverse strategie. Strategia olistica per l'ingegneria metabolica: l'esempio della catarantina. Il caso della vanillina (fermentazione microbica; cenno). Esempi di metaboliti e proteine attualmente in produzione mediante colture cellulari vegetali. Utilizzo delle colture cellulari vegetali come sistema eterologo per la produzione di proteine complesse. Esempio della glucocerebrosidasi come agente terapico della malattia di Gaucher. Altri sistemi cellulari per la produzione di metaboliti: i bioreattori e i biocombustibili (cenni). L'esempio del bioidrogeno (dark fermentation, photofermentation e loro combinazione). Le potenzialità dei residui lignocellulosici in relazione ad interventi biotecnologici. L'inibizione di una reazione enzimatica (irreversibile, reversibile; competitiva, mista -il caso particolare della non competitiva-, incompetitiva -detta anche acompetitiva-, costante di inibizione, analisi inibizione mediante cinetica allo stato stazionario). Il significato del valore di IC50 e sua estrapolazione da grafici dose-risposta. Il saggio colorimetrico per la fosfatasi. Le fosfatasi e la fosfatasi alcalina intestinale e i suoi ruoli principali. Vitamine liposolubili: vitamina K. Origine biosintetica e ruolo della vitamina K. Ruolo fillochinone nella pianta. Ruolo menachinoni nei batteri. Distinzione funzionale tra ubichinone e menachinoni. Vitamina D (colecalciferolo, ergocalciferolo, calcitriolo). Origine biosintetica del colecalciferolo. Vitamina A (il retinolo e i suoi derivati acidi e aldeidici). Ruolo del retinale nel sistema della visione (rodopsina e fotopsine). Dalla struttura primaria all'individuazione di possibili domini transmembrana: il casostudio della batteriorodopsina. Origine biosintetica del retinale (beta-carotene). Biosintesi del beta-carotene. La carenza di vitamina A. Fortificazione alimentare e biofortificazione. Il Golden Rice. I costrutti utilizzati per produrre il Golden Rice (prototipi, GR1 e GR2). Specie reattive dell'ossigeno ed altre specie radicaliche di rilevanza biologica. Generazione biologica delle specie radicaliche (fosforilazione ossidativa; NADPH ossidasi; reazione di Fenton) Reattività dei ROS e meccanismi. Danni ossidativi: DNA. Danni ossidativi: perossidazione lipidica. Danni ossidativi: ossidazione dei tioli proteici. Danni ossidativi: ossidazione generica delle proteine. Meccanismi di difesa da stress ossidativo (superossido dismutasi; catalasi). Glutatione e glutatione perossidasi. Riciclo di glutatione ridotto a partire dal diglutatione: glutatione reduttasi. La questione aperta del riciclo del glutatione radicalico formatosi per azione del glutatione sui ROS (glutaredossine). Altre proteine coinvolte nella rimozione del glutatione radicalico: un possibile modello con una rodanesi. Note aggiuntive sul Docking Molecolare (cenni). Glucosio 6-fosfato deidrogenasi e ruolo nella produzione di NADPH. Deficit di glucosio 6-fosfato deidrogenasi e relazione con favismo e malaria. Il ciclo redox indotto da isouramil e divicina. Molecole tioliche come omologhi funzionali del glutatione. Significato e valutazione del potere antiossidante nei sistemi biologici/sperimentali e nei sistemi alimentari. Saggi in vitro per la valutazione delle proprietà antiossidanti: saggio ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity). Saggi in vitro per la valutazione delle proprietà antiossidanti: saggio chemiluminometrico (esempio del luminolo e acqua ossigenata); saggio di rimozione del radicale DPPH (2,2-Difenil-1- picrilidrazile); saggio FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power); saggio di Folin-Ciocalteu (contenuto totale dei fenoli). Saggio in vivo per la determinazione dello stato redox cellulare in diverse condizioni: saggio cellulare con il fluorogeno DCFH-DA. Vitamina E (tococromanoli: tocoferoli e tocotrienoli). Fonti e origine biosintetica dei tocoferoli. Tocoferoli nei cloroplasti (plastoglobuli). Meccanismo dell'attività antiossidante dei tocoferoli. La triade antiossidante: alfa-tocoferolo, ascorbato, glutatione. Acido ascorbico (vitamina C). Attività redox dell'acido ascorbico. Origine biosintetica dell'acido ascorbico (animali, piante). Ruoli dell'acido ascorbico in piante e animali. Zeaxantina, violaxantina de-epossidasi e acido ascorbico (cenni). Acido ascorbico come cofattore delle idrossilasi alfa-chetoglutaratodipendenti. L'acido ascorbico, il collagene e lo scorbuto. Gli acidi grassi essenziali, linoleico e linolenico (cenni). Organo di riserva dei semi delle dicotiledoni e delle monocotiledoni. Macrocomposizione negli organi di riserva dei semi (endosperma, cotiledoni). Frazionamento di Osborne delle proteine di riserva dei semi. Le albumine 2S (struttura e relazione con proprietà allergeniche). Mappatura degli epitopi (cenni). Le globuline 7S. Le globuline 11S. Le prolammine: gruppi di prolammine e struttura. Le prolammine del mais: le zeine. Le vie generali di smistamento delle proteine ai compartimenti cellulari. Le tipologie di corpi proteici in relazione alle prolammine. La struttura dei corpi proteici contenenti zeine. La definizione delle superfamiglie delle prolammine e delle cupine. Il glutine di frumento e le sue proprietà tecnologiche-funzionali. Le proteine del glutine: glutenine e gliadine. Principali gruppi di gliadine e loro analisi mediante elettroforesi acida (A-PAGE). Proprietà tecnologico-funzionali del glutine associate alle glutenine e alle gliadine. Principali additivi chimici per migliorare la "forza" dell'impasto (bromati, iodati, acido ascorbico) e loro meccanismo di azione. Principali additivi enzimatici per migliorare la "forza" dell'impasto (glucosio ossidasi, transglutaminasi microbica). Utilizzo della transglutaminasi nella trasformazione alimentare (transammidazione e deammidazione). Principali allergeni proteici della farina di frumento (cenni). Approccio generale per identificare allergeni proteici (allergenomica)(cenni). Aspetti generali e molecolari della malattia celiaca. Possibili applicazioni per ridurre la celiachia (probiotici, nuove cultivar di frumento, "glutenasi", modificazione chimica ed enzimatica delle proteine del glutine). Proteine vegetali "tossiche". La tossicità dei semi di Ricinus communis e Abrus precatorius (ricina, abrina). Le proteine che inattivano i ribosomi (RIP). Attività N-glicodidasica delle RIP. Test per la valutazione della depurinazione dell'RNA. RIP di tipo 1 e RIP di tipo 2. RIP di tipo 2: sintesi e processamento della ricina. Meccanismo della citotossicità della ricina. L'attività antivirale delle RIP. La struttura generale di un anticorpo (cenni). Le immunotossine. L'importanza delle osservazioni dei processi nei sistemi viventi come spunto per applicazioni biotecnologiche.