Appunti biochimica

Riassunti per l'esame di biochimica

Enzimi e catalisi enzimatica

Introduzione

Gli enzimi sono specifici catalizzatori che catalizzano una reazione, ovvero permettono a molte reazioni di procedere a una velocità maggiore. Ciascuna delle reazioni è catalizzata da un enzima specifico, fatto su misura per svolgere il suo particolare compito.

Ruolo degli enzimi

Un catalizzatore è una sostanza che aumenta la velocità di una reazione chimica senza subire trasformazioni durante l'intero processo (rimane inalterato). La maggior parte dei catalizzatori biologici sono proteine: queste sono dette enzimi. La sostanza su cui agisce l'enzima è detta substrato di quell'enzima. I catalizzatori, inoltre, non influiscono sulla posizione dell'equilibrio di una reazione; lo stato di equilibrio viene solo raggiunto più velocemente.

Stato di transizione e come agisce un catalizzatore

La termodinamica non ci dice nulla riguardo la velocità di reazione. In un diagramma di energia libera del sistema in funzione della coordinata di reazione, si può notare che il valore di energia libera in uno stato standard dei prodotti è più basso di quello dei reagenti.

Ciò che può avere maggiore importanza nel determinare la velocità di un processo è quello che accade nella transizione dai reagenti ai prodotti. In una reazione di primo ordine una molecola raggiunge solo occasionalmente lo stato energetico nel quale il processo può avvenire. Analogamente, in una reazione di secondo ordine, non tutte le collisioni fra i reagenti possono essere produttive, poiché alcune collisioni non possiedono energia sufficiente, oppure perché le molecole che collidono possono non essere orientate in modo corretto l'una rispetto all'altra, in modo da poter reagire. La maggior parte delle collisioni non porta a una reazione.

Quindi, viene considerata l'ipotesi che esista una barriera energetica e ciò viene detto stato attivato o di transizione. Lo stato di transizione è una sorta di passaggio attraverso il quale la molecola che reagisce deve passare. In questo passaggio, la molecola è spesso sottoposta a tensioni oppure risulta distorta, o anche possiede una particolare struttura elettronica. Può anche corrispondere alla condizione che si ha quando le molecole collidono in modo corretto. Sia lo stato iniziale che lo stato finale hanno meno energia rispetto allo stato di transizione. Per far avvenire la conversione, la molecola deve passare attraverso questo stato di transizione ad alto contenuto energetico.

L'energia di attivazione, ∆G° l'energia libera supplementare che le molecole debbono possedere per raggiungere lo stato di transizione. Se assumiamo che le molecole del reagente sono in equilibrio tra lo stato iniziale e quello attivato, la concentrazione delle molecole attivate in ogni istante sarà data da: K=e^-∆G°/RT. È la concentrazione di molecole che possiedono l'energia di attivazione necessaria e [A]° la concentrazione totale di queste molecole, si può definire la costante di equilibrio come: A^-∆G°/RT=[A]°e.

Una volta che la molecola raggiunge lo stato di transizione, essa avrà a disposizione due percorsi, cioè potrà ritornare allo stato iniziale oppure oltrepassare la barriera di energia di attivazione. La costante di velocità di una reazione chimica dovrà essere proporzionale alla popolazione di molecole che è in grado di raggiungere lo stato di transizione: k=Qe^-∆G°/RT. Il fattore Q, la cui unità di misura è s^-1, rappresenta la frequenza con cui viene superata la barriera.

L'equazione si può riscrivere: k=Q'e^-∆G°/RT; dove Q' è un termine preesponenziale il cui valore è Qe^∆S°/R. Quindi si presume che sia sempre positivo e le reazioni procedono più velocemente ad alte temperature.

La barriera energetica si oppone alla reazione in entrambe le direzioni: K=(Qe^-∆G°/RT)/(Qe^-∆G°/RT)=e^{(-∆G°-∆G°)/RT}.

La differenza di ∆G° è uguale al ∆G°, che a sua volta rappresenta la variazione complessiva di energia libera associata alla reazione. La costante di equilibrio K di per sé non può dirci nulla sulla velocità di un processo: essa dipende solo dalla differenza di energia libera tra lo stato iniziale e lo stato finale.

Un catalizzatore abbassa la barriera energetica di una reazione, aumentando di conseguenza la frazione di molecole che hanno abbastanza energia per raggiungere lo stato di transizione e rendendo la reazione più veloce in entrambe le direzioni. Tuttavia, la presenza di un catalizzatore aumenta la velocità di reazione diretta e di quella inversa, ma non influenza lo stato di equilibrio. Affinché la reazione possa avvenire, le molecole che sono coinvolte nella reazione devono sottostare a tensioni e distorsioni che richiedono molta energia. Il catalizzatore è in grado di ridurre questo fabbisogno energetico costringendo le molecole reagenti in uno stato intermedio, che somiglia allo stato di transizione, ma possiede un'energia più bassa a causa del bilancio energetico favorevole per il legame con il catalizzatore. Il risultato è che due barriere più basse sostituiscono una singola barriera di energia di transizione di valore elevato. Lo stato intermedio corrisponde al minimo di energia libera, mentre lo stato di transizione corrisponde al massimo. Questo stato intermedio è uno stato metastabile della molecola.

Modelli interazione enzima-substrato

L'enzima lega una molecola di substrato in una regione dell'enzima stesso detta sito attivo. Si tratta di una tasca o di una fenditura delimitata da catene laterali di residui aminoacidici che partecipano al legame con il substrato. In alcuni casi l'enzima presenta uno ione metallico che favorisce l'azione catalitica.

Modello a chiave-serratura: un enzima alloggia il suo substrato specifico come una serratura la propria chiave.

Modello ad adattamento indotto: al sito attivo dell'enzima si adatta meglio una molecola di substrato indotta ad assumere una conformazione che si avvicina allo stato di transizione.

Quindi, un enzima è in grado di legare uno o più substrati, abbassare l'energia dello stato di transizione e promuovere l'azione catalitica. Quando il processo è completato, l'enzima è in grado di rilasciare il prodotto o i prodotti e ritornare al suo stato originale, pronto per un altro ciclo catalitico.

Cinetica enzimatica: Michaelis Menten

Un'equazione in grado di descrivere una reazione a un substrato e un prodotto catalizzata da un enzima è:

La formazione catalizzata del prodotto, accompagnata dalla rigenerazione dell'enzima, rappresenta pertanto una semplice reazione di primo ordine e la sua velocità sarà determinata unicamente dalla concentrazione di ES e dal valore della k₂. Se si potesse misurare V e [ES] per un enzima e un substrato, si ottiene la k₂. Tuttavia, [ES] non è una concentrazione misurabile. Si può misurare la concentrazione del substrato e la concentrazione totale dell'enzima, che è data da:

Quanto più ES è presente, tanto più velocemente esso si dissocerà a dare i prodotti oppure a dare nuovamente i reagenti; pertanto, quando si fa partire la reazione miscelando enzima e substrato, all'inizio la concentrazione di ES aumenterà ma poi rapidamente verrà raggiunto uno stato stazionario, il cui complesso rimane costante. Lo stato stazionario persisterà fino a quando il substrato non sarà stato quasi completamente consumato. Si può così misurare la velocità di reazione dopo che lo stato stazionario si è stabilito e prima che [ES] sia variata di molto. In stato stazionario, la velocità di formazione e di demolizione di ES sono uguali.

Si raggruppano in rapporto tra le costanti di velocità dell'equazione in una singola costante K_M:

A questo punto, bisogna inserire [E]_t nell'equazione, al posto di [E]:

Infine si può ottenere un'espressione di V in funzione di [E]_t e di [S]:

Equazione di Michaelis-Menten

Questa equazione finale è detta Equazione di Michaelis-Menten e K_M è chiamata costante di Michaelis. Un certo enzima che agisce su un certo substrato possiede una specifica K_M, le cui unità di misura sono quelle di una concentrazione. Nel grafico di V in funzione di [S], a elevate concentrazioni di substrato dove [S] è molto maggiore di K_M, la reazione si approssima a una velocità massima (V_max) dovuta al fatto che le molecole di enzima vengono saturate (ovvero ogni molecola di enzima è occupata dal substrato e impegnata nel compiere la catalisi).

Considerando una reazione a più passaggi

La k₂ viene sostituita da una costante, k_cat:

Questa costante incorpora le costanti di velocità di tutte le reazioni di ES e E+P.

Quindi i due parametri importanti sono K_M e k_cat. K_M misura la concentrazione di substrato alla quale la velocità di reazione è pari a V_max/2. K_M può essere definita come l'affinità di E per S: bassa K_M = alta affinità, alta K_M = bassa affinità. Un enzima con alta K_M richiede una maggiore concentrazione di substrato per raggiungere una data velocità di reazione rispetto a un enzima con una bassa K_M, quando k_cat è la stessa.

k_cat [s^-1] rappresenta una misura diretta della formazione del prodotto operata dalla catalisi, in condizioni ottimali (enzima saturato). Quindi questa costante misura il numero di molecole di substrato trasformate da una molecola di enzima in un secondo. Essa viene anche detta numero di turnover. È una misura dell'efficienza dell'enzima.

k_cat/K_M corrisponde alla costante di velocità del secondo ordine della reazione E + S in condizioni di bassa concentrazione di substrato. Questa costante di velocità ha un valore massimo teorico, che è determinato dalla frequenza con cui le molecole di E ed S possono collidere. Una reazione che si verifica a questa velocità si dice che sia "limitata dalla diffusione": ogni incontro fra le molecole porta alla reazione, e nient'altro oltre la velocità degli incontri molecolari limita la velocità di reazione stessa. È stato calcolato che tale reazione dipende da parametri della teoria della diffusione, e il valore massimo è 10⁸ - 10⁹ M^-1s^-1.

Il modo più comodo per determinare K_M e k_cat è attraverso il grafico di Lineweaver-Burk (il grafico dei doppi reciproci) o quello di Eadie-Hofstee.

Grafico di Lineweaver-Burk

Ponendo in grafico 1/V in funzione di 1/S si ottiene una linea retta. Quando 1/S=0, [S] è infinitamente grande e la velocità di reazione è al suo valore massimo. Quindi si può ricavare 1/V_max dall'intercetta della retta con l'asse 1/V.

Avendo V_max e [E]_t, possiamo calcolare k_cat, guardiamo l'intercetta con l'asse 1/[S] che dà -1/K_M.

Grafico di Eadie-Hofstee

Viene posto in grafico V in funzione di V/[S].

La maggior parte delle reazioni comporta l'interazione di due o più substrati, spesso con la formazione di più prodotti. Le reazioni a più substrati vengono suddivise nelle tre seguenti categorie a seconda dell'ordine con cui i substrati vengono legati: casuali, ordinate e "ping-pong".

Tipi di meccanismi di legame

Meccanismo casuale: sia l'uno che l'altro dei due substrati può legarsi per primo, sebbene in molti casi il legame iniziale di uno dei due può essere favorito e, una volta legato, promuovere l'attacco dell'altro substrato.

Meccanismo ordinato: un substrato deve legarsi per primo affinché il secondo possa a sua volta legarsi in quantità significative.

Meccanismo "ping-pong": si lega il primo substrato, viene rilasciato un prodotto, entra quindi il secondo substrato ed esce il secondo prodotto.

Inibizione enzimatica

Molte molecole inibiscono gli enzimi, ed agiscono in molti modi diversi. Inibizione reversibile e irreversibile. La prima implica un legame non covalente dell'inibitore e può sempre essere rimossa allontanando l'inibitore stesso. Nella seconda, una molecola si lega covalentemente all'enzima rendendolo inattivo.

Inibizione reversibile

Inibizione competitiva

Esiste una molecola così somigliante al substrato di una reazione enzimatica che l'enzima è in grado di ospitarla nel proprio sito attivo. Questa molecola (inibitore competitivo) compete con il substrato per il legame al sito attivo. Per tutto il tempo in cui l'inibitore occupa il sito attivo, l'enzima non è disponibile per la catalisi. L'inibitore cambia la K_M apparente dell'enzima.

K_I = costante di dissociazione per il legame dell'inibitore → K_I = [E][I]/[EI]

V_app = V_max[S]/K_M+[S]

K_M^app = K_M(1+[I]/K_I), K_M aumenta con [I].

V_max invariata.

Una variante dell'inibizione competitiva è il legame non produttivo. In questo caso la molecola di substrato possiede una modalità supplementare di legame all'enzima.

(a) Effetto di un inibitore competitivo (I) sulla velocità di reazione a diverse concentrazioni di substrato. L'aggiunta dell'inibitore fa diminuire la velocità, ma non la V_max. In presenza di inibitore, la K_M apparente è più alta. (b) Grafico di Lineweaver-Burk della reazione mostrata nel punto a). È un'inibizione competitiva perché le rette si incrociano allo stesso valore di V_max. (c) Determinazione di K_M^app e K_I. Se le misure di K_M vengono eseguite a differenti concentrazioni di I si può determinare la K_I dalla pendenza della retta e la K_M reale dall'intercetta della retta nel punto [I]=0.

Inibizione incompetitiva

Si verifica quando una molecola o uno ione si possono legare a un secondo sito sulla superficie dell'enzima (diverso dal sito attivo) in modo tale da modificare la k_cat.

α' = 1 + [I]/K_I'

V = V_max[S]/K_M + α'[S]

K_I' = [ES][I]/[ESI], K_M e V_max diminuiscono con [I].

Inibizione non competitiva

In questo caso l'inibitore si lega ad un suo sito distinto da quello del substrato. Il sito attivo del substrato non è stato influenzato. L'inibitore si lega, sia che ci sia il substrato o meno. V_max diminuisce con [I]. K_M invariata.

L'effetto di (a) un inibitore non competitivo (I) sulla velocità di reazione a diverse concentrazioni di substrato. In questo semplice caso, K_M non subisce variazioni ma V_max diminuisce perché l'enzima in presenza di inibitore non possiede più la stessa efficienza catalitica. (b) Grafico di Lineweaver-Burk della reazione mostrata in a). È un'inibizione non competitiva perché le rette intersecano l'asse 1/V in punti diversi. (c) Determinazione del valore di K_I e della V_max per la reazione non inibita (che darà il valore di k_cat).

Inibizione irreversibile

Sono sostanze tossiche. Questi inibitori irreversibili si legano saldamente al sito attivo.

Regolazione allosterica

L'efficienza con cui i singoli enzimi operano deve essere coordinata e regolata.

Controllo a livello del substrato

Avviene tramite un'interazione diretta dei substrati e dei prodotti delle reazioni enzimatiche con l'enzima stesso. Più alta è la concentrazione del substrato, più rapidamente avviene la reazione. Al contrario, alte concentrazioni di prodotto, esso stesso capace di legarsi all'enzima, tendono a inibire la trasformazione del substrato nel prodotto stesso.

Regolazione a feedback

In una reazione, il prodotto finale potrebbe essere ridotto. Ciò causa un suo accumulo e il substrato iniziale continuerebbe a essere consumato. La cellula deve essere in grado di controllare la formazione del prodotto finale tramite attivazione o inibizione di un passaggio della via metabolica. Il sistema più efficiente per rallentare la formazione del prodotto finale dovrebbe agire sul primo passaggio. Questo processo è chiamato regolazione a feedback o feedback negativo in quanto un aumento della concentrazione del prodotto finale ha come conseguenza una diminuzione della sua velocità di formazione. Ciò previene inoltre l'accumulo degli intermedi.

Enzimi allosterici

Gli enzimi allosterici sono proteine oligomeriche costituite da un sito catalitico per il substrato su una subunità detta catalitica e un sito di legame per il modulatore su una seconda subunità detta regolatrice. I modulatori possono essere positivi o negativi.

Regolazione omoallosterica (cooperatività nel legame del substrato): substrato e modulatore sono identici. Una molecola si lega al sito attivo mentre l'altra si lega al sito regolatore sulla seconda subunità.