Animali invertebrati: Appunti di Genetica

Lezione 5 (26/03)

Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans è il primo sistema modello che analizziamo. C. elegans è un nematode, un verme cilindrico, la superficie del corpo non presenta differenziamenti particolari. Ci sono due sessi: uno che sono gli organismi più grandi è ermafrodita sufficiente, quindi produce gameti maschili e femminili e si autofeconda, e l'altro è il sesso maschile, più piccoli. La comparsa del sesso maschile è legata a eventi rari di non disgiunzione degli X. La presenza di maschi è importante perché possiamo programmare degli incroci per creare assetti genotipici specifici, quindi se sono presenti i maschi si ha esincrocio.

Ciclo vitale

L'ermafrodita adulto depone uova fecondate o da se stesso o attraverso l'accoppiamento con un maschio, inizia quindi lo sviluppo embrionale che dopo circa 14 ore dà luogo alla larva al primo stadio larvale L1. Ci sono quattro stadi larvali (L1, L2, L3 e L4), dopo L4 si ottiene il primo adulto. Il corpo cresce e si ha un differenziamento degli organi interni fino a che l'adulto è in grado di nutrirsi e di fecondarsi. Questo nematode cresce sotto terra e si ciba di batteri; in laboratorio questo organismo viene allevato su capsule Petri di agar su cui vengono sparse colture dense di E. coli. Esiste, oltre al ciclo vitale normale, un ciclo alternativo che viene seguito quando gli animali sono in assenza di cibo, si chiama ciclo dauer. Questo ciclo è diventato un modello fisiologico di studio in quanto è una sorta di quiescenza, stasi che può essere applicato a organismi più complessi.

Caratteristiche genetiche

• Dimensione genoma: 97 Mb
• Numero cromosomi: 5 autosomi + cromosomi sessuali
• Numero geni: 19.000
• Percentuale di omologia con la specie umana: 25%
• Dimensione media di un gene: 5 Kb, 5 esoni per gene
• Trasposoni: molti tipi, attivi in alcuni ceppi
• Anno di sequenziamento genoma: 1998

Nel 2002, Brenner, Horvitz e Sulston hanno ricevuto il premio Nobel per la Medicina per il loro studi su C. elegans, in quanto hanno fondato il suo utilizzo come organismo modello. Brenner è stato il primo a utilizzare e caratterizzare morfologicamente questo nematode, ha fatto il primo screen genetico dimostrando che tale organismo ha marcatori morfologici (necessari per poter fare incroci controllati) che ci permettono di utilizzarlo come organismo modello. Horvitz ha fatto uno screening con cui ha caratterizzato un meccanismo fisiologico e patologico fondamentale, l'apoptosi. Fu il primo a dimostrare che esiste un meccanismo di morte programmata, che ha un ruolo fondamentale nella formazione di un organismo completo e funzionante. Sulston ha studiato C. elegans descrivendo il fatto che era possibile, nel caso di un organismo così semplice e formato da un numero relativamente piccolo di cellule, conoscere e descrivere le intere linee cellulari dell'animale. Infine, Fire e Mello hanno dimostrato l'esistenza dell'RNAi in C. elegans.

Il sistema modello

L'utilizzo dei sistemi modello è una tappa fondamentale della ricerca biomedica che permette di descrivere i meccanismi fisiologici. Strutturare un organismo come sistema modello permette di creare all'interno di quel sistema biologico tutti gli strumenti per poter studiare meccanismi che possano avere una ricaduta su conoscenze necessarie per curare o prevenire malattie. Brenner parte dal presupposto che se dobbiamo studiare un processo biologico, vale la pena cercare il sistema modello più semplice in cui studiare il processo di interesse. Partendo da questo presupposto viene scelto C. elegans date le sue peculiari caratteristiche:

• Semplicità;
• Brevi tempi generazionali: in 3 giorni si ha una nuova generazione;
• Piccole dimensioni che permettono di allevarlo in capsule Petri con mezzo agarizzato, inoltre quando servono grandi quantità è possibile allevarlo in cultura liquida (screen su larga scala);
• Possibilità di crioconservazione (embrioni);
• Possiede molti tessuti/organi presenti anche in animali più complessi come muscoli, sistema nervoso, epidermide, tratto gastro-intestinale, gonadi, anche se molto più semplici, tranne il sistema scheletrico e sistema di immunità acquisita.

La semplicità e lo sviluppo altamente stereotipato permette ai ricercatori di seguire e studiare processi biologici con una risoluzione a livello di singole cellule. C. elegans è caratterizzato da un numero stereotipato di cellule, ci sono 959 cellule nei vermi ermafroditi e 1031 nei maschi. Il modo in cui C. elegans si muove, un movimento coordinato serpentino, è importante in quanto può essere utilizzato come marcatore.

Embriogenesi

Sulston ha studiato e seguito l'embriogenesi di C. elegans e ha dato un nome a ogni passaggio e cellula che si viene a creare. P0 è lo zigote, prima cellula diploide. La prima divisione mitotica (che divide gli zigoti in due cellule) è asimmetrica: le due cellule figlie non sono identiche, non lo sono in dimensioni né per il contenuto di determinanti genetici (contenuto proteico e di RNA nel citosol non è uguale). Il citoplasma e la cellula uovo segregano in maniera differenziale una moltitudine di fattori che fanno sì che se le due cellule figlie, che si chiamano AB e P1, vengono separate, non si ottengono due vermi completi, quindi tali cellule non sono totipotenti. Sulston seguì tutte le divisioni mitotiche dando un nome a tutte le cellule e ai loro discendenti. Da AB deriva ABa e ABp, da P1 deriva EMS e P2. Partendo dallo zigote ha seguito tutte le divisioni cellulari riuscendo a stabilire in maniera invariante che ogni cellula dava solo un determinato tipo di cellule che si definiva durante le divisioni cellulari attraverso meccanismi di vario genere, intrinseci ma anche estrinseci (comunicazione tra cellule). Questo permette di determinare la deriva di ogni cellula di ogni stadio larvale e ciò permette uno studio a singola cellula (unico organismo per cui è possibile tale studio). Ogni cellula ha una sua identità, per ogni tipo di lineage cellulare sono chiariti quali meccanismi genetici lo determinano e quali meccanismi intervengono durante il differenziamento delle varie cellule che da quel lineage derivano. Da ogni lineage deriva un determinato tipo cellulare.

Grazie all'identificazione di ogni lineage cellulare, Horvitz è riuscito a fare lo screen genetico che gli ha permesso di scoprire non solo i meccanismi di morte cellulare ma anche i determinanti genetici che la causano (come geni che codificano per le caspasi o per geni antiapoptotici come BCL2). Ciò fu possibile perché si resero conto che durante lo sviluppo determinate cellule invariabilmente morivano, in posizioni stereotipate, perché erano cellule figlie di particolari lineage che a un certo punto dello sviluppo dovevano morire. Avendo quindi un fenotipo stereotipato, è stato possibile immaginarsi uno screen per identificare i geni che lo determinavano.

Anatomia di C. elegans

L'anatomia di C. elegans è divisibile in una porzione anteriore e in una porzione posteriore. È presente una coda che è stata usata come marcatore. Nella porzione anteriore troviamo la faringe, che è stata molto utilizzata come marcatore morfologico. Lo sviluppo del faringe è stato molto studiato, in particolare Horvitz l'ha utilizzato per il suo screen dell'apoptosi in quanto durante la morfogenesi dei vari foglietti che formano il faringe ci sono alcune cellule che invariabilmente a un certo stadio larvale muoiono. La cuticola risulta essere trasparente: è quindi possibile intravedere le strutture interne, questa caratteristica rende il nematode un modello molto utile per esaminare grandi numeri di individui andando in cerca di fenotipi che influenzino potenzialmente tutti gli aspetti dell'anatomia e dello sviluppo (organi e strutture interne comprese), quindi anche una osservazione morfologica diretta può essere utile a seguire il differenziamento dei vari tipi di cellule.

Il faringe continua lungo l'animale con l'intestino. Internamente il verme è composto da un sistema nervoso rudimentale e da sole gonadi, negli ermafroditi sono presenti sia uova che spermatozoi. A metà del corpo dell'ermafrodita in posizione ventrale è presente un organo formato da un piccolo numero di cellule, la vulva, apertura da cui avviene la deposizione delle uova e la fecondazione in presenza di maschi. Essendo il genoma di C. elegans sequenziato, esistono un paio di banche dati, AC e BD, in cui sono ripostati tutti i dati esistenti, tutte le notizie importanti vere o putative, ottenute con il maggior numero di approcci legati a C. elegans che permettono a chi lavora con questo organismo di avere tutte le informazioni utili.

Transgenesi

Con C. elegans è possibile fare transgenesi in modo abbastanza semplice in quanto la gonade è abbastanza grande ed è ben visibile anche a un microscopio a contrasto di fase. È possibile osservare la parte di gonade in cui sta avvenendo la meiosi della linea germinale. Essendo questa parte di gonade un sincizio, è possibile esporre i nuclei da cui deriveranno le cellule della linea germinale, quindi i gameti, a DNA esogeno introdotto attraverso microiniezione con un ago di vetro.

La microiniezione nel citoplasma della gonade sinciziale permette di esporre al DNA trasformante più di 100 nuclei precursori delle cellule della linea germinale. Con frequenza non altissima, il DNA esogeno è in grado di integrarsi nel genoma dell'animali, si crea una sorta di "trasfezione transiente", ovvero le cellule della linea germinale si portano dietro nel loro citoplasma degli assetti extracromosomici di transgeni. In genere si creano dei multimeri del transgene che vengono conservati nel citoplasma, quindi non integrati che se sono abbondanti, se pur soggetti a diluizione, possono essere presenti nella generazione successiva.

È possibile fare anche dei transgeni più stabili aumentando la frequenza di integrazione attraverso l'induzione di rotture all'interno del genoma esponendo a radiazioni ionizzanti (a bassa dose) i vermi iniettati. Attraverso i meccanismi riparativi del DNA viene favorita l'integrazione stabile del transgene all'interno del genoma in posizioni casuali.

Screen semplici: fenotipi visibili recessivi (Brenner)

La conoscenza della sequenza dell’intero genoma permette potenzialmente di conoscere la sequenza primaria di ogni proteina ma questo non fornisce alcuna indicazione precisa sui pathways, sui processi biologici e sui tessuti/organi in cui la proteina agisce. Il modo più semplice per ottenere queste informazioni sono gli studi funzionali che hanno nella mutazione lo strumento più importante. Viene utilizzata mutagenesi chimica (indotta da agente mutageno: EMS, ENU, ecc.) o mutagenesi inserzionale attraverso la mobilizzazione dell'elemento trasponibile Tc1 che è l'unico elemento trasponibile in C. elegans, presente in tutti i ceppi ad alto numero, quindi non molto utile come mutageno perché ne abbiamo un alto numero residente nel genoma (difficile identificazione di quale trasposone induce il fenotipo mutante).

Brenner ha fatto una mutagenesi chimica il più possibile saturante, utilizzando etil metansulfonato che produce mutazioni casuali di tipo puntiforme provocando l’alchilazione in particolare della guanina con una frequenza di mutazione di 5x10^-4 - 5x10^-2 per gene. Il gruppo etilico di EMS reagisce con la base guanina creando la base anomala O-6-ethylguanina. Durante la replicazione del DNA, la DNApol seleziona frequentemente la Timina in posizioni corrispondenti alla base anomala. Successive replicazioni del DNA determinano la sostituzione della coppia G-C con la coppia A-T.

Gli ermafroditi (generazione P0) vengono esposti al mutageno e vengono fatti autofecondare. Per cercare di evitare che nello stesso individuo si accumulino contemporaneamente più mutazioni diverse si è sperimentalmente trovato un compromesso riducendo il tempo di esposizione, in modo che in ogni individuo P0 sia presente al limite una mutazione (condizione ideale).

Gli agenti alchilanti alterano un solo filamento del DNA ed è quindi necessario almeno un round di replicazione affinché anche l’altro filamento rechi la sostituzione di base. In generale, l’animale esposto (P0 o G0) viene incrociato in modo da dare origine a una larga progenie F1 che permetta di effettuare lo screen dei gameti della generazione P0 e massimizzare l’ottenimento di animali effettivamente mutanti. La generazione F1 è quella dei potenziali eterozigoti, cioè se qualche gamete all'interno degli animali P0 porta una mutazione allora l'animale che si forma a partire da quel gamete è completamente eterozigote per una mutazione. È come se all'interno di ogni organismo di F1 abbia già clonato una mutazione, abbiamo quindi la possibilità di produrre spermatozoi e cellule uovo eterozigoti per quella stessa mutazione.

Se lascio autofecondare gli animali di F1 allora posso pensare di cominciare a seguire una segregazione mendeliana di quella mutazione. Se è vero che un F1 è eterozigote per la mutazione m, allora nella sua progenie F2 avrò il 25% di individui wt, il 50% di individui eterozigote per la mutazione e il 25% di individui omozigoti per la mutazione. Il fatto di vedere un potenziale fenotipo mutante in F2 è un caso particolare perché è legato al fatto che l'animale abbia un sesso ermafrodita, con qualunque altro organismo dobbiamo scalare di una generazione, questa segregazione in altri organismi è visibile in F3.

Gli ermafroditi dopo essere stati esposti a mutageno per 4 ore (tempo ottimizzato) vengono posti su una piastra di agarosio per una fase di recupero. In seguito, gli animali, che sono quelli della generazione P0, vengono suddivisi in 10 piastre con 10 adulti per ogni piastra. Questi animali vengono fatti deporre per un certo periodo di tempo in modo tale da accumulare 100 uova fecondate per ogni piastra, queste uova dopo qualche giorno daranno vita agli individui F1 eterozigoti. La F1 viene fatta deporre e successivamente sottoposta a WASH OFF, per evitare che le piastre siano sature di individui dopo aver fatto deporre gli ermafroditi adulti per un certo periodo di tempo li lavano via senza eliminare gli embrioni poiché gli embrioni sono molto leggeri e rimangono incollati alla patina di batteri.

A questo punto abbiamo piastre con embrioni di F2, se in qualche piastra c'era un individuo F1 recante una mutazione eterozigote, allora nelle piastre di F2 ci saranno degli individui omozigoti per quella mutazione che se è vitale e mostra un fenotipo, che sarà recessivo, lo posso osservare. Questi animali che hanno fenotipo mutante sono identificabili e studiabili, vengono messi in piastra singolarmente per vedere se sono fertili e se lo sono per osservare se danno una progenie che abbia il fenotipo che era mostrato dall'individuo F2 che hanno clonato, cioè messo in coltura singola. Hanno così creato delle famiglie. Se abbiamo un individuo che reca un fenotipo mutante in F2 ci aspettiamo che tutta la progenie in F3 abbia quel fenotipo, ammesso che la penetranza del fenotipo sia completa. Se abbiamo una mutazione molto forte posso aspettarmi che il 100% della progenie dell'individuo fondatore della famiglia (=clone=linea isogenica) abbia il fenotipo, se abbiamo una mutazione meno forte è possibile che la penetranza fenotipica non sia completa. Brenner trovò che tra gli individui di F3 fondatori di linee isogeniche che recavano un fenotipo, il 10% era BREED TRUE, cioè segregava veramente, ovvero solo il 10% di individui di F3 recanti fenotipo hanno dato una progenie che mostrava il fenotipo, questo ci dice che il fenotipo segrega con il genoma, è quindi una vera mutazione. Il 30% di individui di F3 erano sterili, quindi anche se presentavano il fenotipo non erano in grado di trasferirlo alla progenie, quindi non era possibile fondare una linea. Il 60% degli individui presentava fenotipo spurio, ovvero la progenie non presentava fenotipo, quindi il fenotipo osservato nei genitori era una sorta di fenocopia o comunque un difetto non legato a una mutazione.

Tra i parametri della messa a punto della mutagenesi c'è l'esposizione dell'adulto a una età tale per cui è massima la produzione dei gameti, ciò vuol dire che se ho ben dosato l'esposizione avrò una condizione ideale che mi permette di avere una mutazione per gamete. Se ciò è fatto in una fase in cui P0 è ancora potenzialmente capace di produrre un elevato numero di gameti massimizziamo l'efficienza della mutagenesi. In base a regole empiriche e all'esperienza, questa è considerata la dimensione di mutagenesi (schema protocollo sopra) che dovrebbe essere sufficiente a isolare la mutazione di nostro interesse. Lo scopo di Brenner però non era quello di isolare una sola mutazione, ma di scoprire il maggior numero di mutazioni su tutto il genoma che dessero un fenotipo visibile, che non uccidessero l'animale e che non dessero sterilità, quindi fu necessario analizzare più di dieci piastre. Se vogliamo però trovare una mutazione in un determinato gene ci può bastare l'analisi di 10 piastre dato che seguendo questo protocollo si arriva ad analizzare 2000 uova di F2, di cui un quarto potrebbero essere potenziali omozigoti per una mutazione di interesse.

Utilizzando questo approccio Brenner e colleghi isolarono un alto numero di mutanti principalmente legati all'aspetto dell'animale.

Mutanti dimensionali

• Small (sma-1), più corti;
• Long (lon-1), più lunghi;
• Dumpy (dyp-1), più corti e più tozzi, fenotipo fondamentale in quanto legato a alterazioni della compensazione del dosaggio, che porta a un uguale livello di espressione genica i geni legati al cromosoma X che non è presente in egual numero di copie all'interno dei due sessi.