Animali invertebrati: Appunti di Genetica

SCREEN REGIONE SPECIFICO

Possono essere usati per fare screen per non-complementazione, vale a dire:

!

Screen per non-complementazione allelica cerchiamo nuovi alleli mutati di geni già noti

• !

Screen per non-complementazione non-allelica è un doppio eterozigote per mutazioni su due

• geni diversi che ci mostra il fenotipo e questo evidenzia una stretta interazione funzionale tra i due

geni

Lo schema è lo stesso: se immaginiamo che la mutazione del gene a ci dia un fenotipo vitale e fertile, è

sufficiente mutagenizzare i maschi, incrociarli per femmine. In F1 abbiamo una popolazione di individui

potenzialmente eterozigoti, che saranno eterozigoti anche x l’allele a. quindi andiamo a cercare qui

individui che potrebbero portare una nuova mutazione m nel medesimo locus a.

Non è frequente, dipende molto dalla mutagenesi, la possibilità di trovare mutazioni che diano effetti di

non-complementazione non-allelica, quindi effetto di interazione funzionale. Lo schema comunque è lo

stesso. È uni schema teorico se la mutazione a in omozigosi ci dà sterilita o letalità. Dobbiamo

mutagenizzare i maschi, incrociarli per femmine selvatiche, ottenere una popolazione di individui

potenzialmente eterozigoti, incrociarli per individui eterozigoti recanti l’allele a, e facendo così ¼ degli

individui potrebbe presentare il fenotipo (allelica o non allelica).

Non ci son marcatori che marcano in vari cromosomi, in realtà possono esistere ma nella maggior parte dei

casi sono i marcatori molecolari. Quindi in un caso di screen regione-specifico è abbastanza semplice

perché noi sappiamo già dove è questa mutazione e possiamo già a priori preparare un pannello di

marcatori strettamente associato all’allele a, caratterizzando gli stessi marcatori del ceppo in cui facciamo

mutagenesi. Quindi per la genotipizzazione, che nel primo caso non è tanto importante ma nel secondo

caso sì, possiamo sapere quali sono i marcatori associati alla mutazione a e gli alleli associati alla mutazione

a. Se noi usiamo dei ceppi di origini diverse che recano alleli differenti, possiamo nella progenie G2

identificare chi è il mutante.

Quando abbiamo una particolare regione cromosomica come target del nostro lavoro, possiamo creare dei

marcatori che regolano incroci dei topi simile a quello che si fa per esempio con Drosophila.

Come esempio di screen regione specifico: è il lavoro con cui è stato messo a punto l’utilizzo della ENU

come mutageno del topo. Si chiama Locus Specific Test (LST) e sostanzialmente con questo lavoro sono

andati a cercare mutazioni alleliche di una serie di mutazioni in geni che danno omozigosi con fenotipo

visibile. Quindi lo scopo era quello di mettere a punto il trattamento di esposizione agli agenti alchilanti

basandosi su fenotipi osservabili facilmente, quindi nella condizione del primo schema.

Sono tutte mutazioni che danno fenotipo visibile a carico di vari organi:

albino è una mutazione che porta alla depigmentazione del pelo, sono sostanzialmente bianchi

• brown è un’altra colorazione del pelo

• pink-eye dilution è un’altra colorazione dell’iride

• chinchilla

• piebald spotting sono delle chiazze di pelle glabra della pelliccia

• agouti è una colorazione particolare della pelliccia

• short-ear è l’orecchio piccolo

•

Questi sono i fenotipi. Quindi sostanzialmente topi che avessero tutti questi marcatori, tutte queste

mutazioni in omozigosi, sono stati usati in uno schema di questo tipo, andando a identificre nuovi alleli per

valutare la frequenza con cui siamo in grado di trovare nuovi alleli di geni noti per un trattamento con

agenti alchilanti.

La conseguenza interessante è, a parte la messa a punto del protocollo di mutagenesi, il fatto che ha

permesso di creare delle serie alleliche e per alcuni di questi geni, in particolare per uno, la cosa è risultata

di interesse.

Parliamo del gene short ears (se), codificante per la proteina BMP5 che fa parte della superfamiglia dei

TGFβ (tumor growth factor beta), in particolare un membro della famiglia dei fattori BMP (Bone

Morphogenetic Protein). Sono fattori diffusibili, e sono conservati in tutta la scala evolutiva; in Drosophila

ce n’è uno che si chiama Dpp (Drosophila decapentaplegic). In realtà sono proteine fondamentali perché

partecipano a una marea di processi molto importanti e il loro meccanismo di azione è importante per la

cell-cell communication. Tra l’altro sono dei morfogeni, e sono facilmente diffusibili.

In Drosophila per esempio Dpp è fondamentale per lo stabilirsi dell’asse dorso-ventrale durante la

embriogenesi precoce. Nei mammiferi è importante per la simmetria Left/Right. In più sono

importantissimi per le interazioni tra tessuti mesenchimali ed epiteli, la crescita, morte e differenziamento

delle cellule di specifici tipi tissutali ecc.

BMP5 è un membro della famiglia, e avere identificato una nutrita serie allelica di questo gene, ha

permesso di fare una serie di considerazioni e di realizzare una analisi struttura-funzione che ha confutato e

confermato una serie di evidenze.

Intanto avere identificato molti alleli, di cui alcuni con perdita di funzione forte come mutazioni non senso

che interrompevano la codificazione della proteina molto precocemente o frameshift, ha chiarito intanto

che BMP5 sicuramente non ha un ruolo essenziale. Altre proteine BMP invece sono essenziali.

Schema della proteina:

Tutti i fattori BMP sono codificati come pro-proteina che viene poi tagliata proteoliticamente per dare la

forma attiva. C’è un pro-dominio e un dominio maturo. La proteina matura viene ottenuta per taglio

proteolitico a livello della sequenza RXXX. È risultato essere fondamentale anche nello splicing di altri geni.

questo significa che lo splicing di questo introne è fondamentale perché la funzione della proteina rimanga.

Analisi di tanti alleli ottenuti con questa mutagenesi. Gli unici tre alleli che non riescono a dare un trascritto

maturo della corretta dimensione danno fenotipo. Se li confrontiamo con un altro allele che ha tutta una

serie di varianti di splicing, in realtà questo allele non dà un fenotipo altrettanto forte rispetto agli altri,

perché questo allele provoca la comparsa di un errore nello splicing ma mantiene almeno una parte di

trascritto corretto. Invece negli altri vediamo che a carico della porzione di trascritto che codifica per il

dominio maturo non è presente un trascritto di corrette.

Inoltre la analisi di alcuni di questi alleli ha permesso di confermare una serie di informazioni che erano già

state ottenute attraverso analisi strutturale di proteine BMP, non in particolare BMP5. La proteina attiva in

realtà si ottiene per taglio proteolitico della pro-proteina e attraverso il ripiegamento tridimensionale è

stabilizzata da ponti disolfuro. Complessivamente nella famiglia di BMP sono circa 7 i residui di cys coinvolti

per lo più nei ponti disolfuro che stabilizzano il ripiegamento della proteina stessa.

Qui sono numerati dall’N-ter al C-ter (sono 7). Vediamo lo schema di ponti disolfuro più frequente nella

famiglia. Tra gli alleli trovati in questa mutagenesi, 3 sono missenso ed eliminano alcuni dei residui di cys

coinvolti in questi ponti disolfuro. In particolare sostituzione del secondo, del terzo e del sesto.

La identificazione degli alleli mutanti che danno fenotipo, quindi la proteina non funziona, e questi mutanti

che sono a carico di questi tre residui non fa che confermare in vivo la importanza si questi residui per la

formazione di almeno alcuni dei ponti disolfuro ritenuti importanti per la stabilizzazione della struttura, e

che erano stati in gran parte predetti in base alla analisi strutturale.

Quindi con questo studio sono riusciti a mettere a punto le condizioni di mutagenesi: hanno messo a punto

la dose di ENU, il tempo di esposizione e tutto questo ha permesso poi di realizzarla su geni di

maggiormente complessa caratterizzazione per mutagenesi. Questo lavoro ha anche fornito serie alleliche

di vari geni, in particolare di BMP5, dimostrando come sia possibile fare una analisi struttura-funzione.

Una volta ottenuta la linea con i due vettori integrati, e che quindi saranno cellule resistenti sia a G418 che

a puromicina. Queste cellule possono essere trasfettate con il vettore che esprime la ricombinasi Cre.

A quel punto in queste cellule avviene la ricombinazione sito-specifica tra i due siti loxP. Se i due siti loxP

sono diretti nello stesso orientamento si ottiene la delezione di tutto ciò che è interposto tra i due siti e di

uno dei due siti. Se invece abbiamo creato cellule con i due vettori che integrano i due siti loxP in

orientamento opposto, allora la ricombinazione sito-specifica mediata da Cre genera inversione.

Nel caso della delezione perdiamo tutte le cassette di selezione quindi (sia quella della puromicina sia

quella di G418). Quindi queste cellule saranno puromicina-sensibili e G418-sensibili. Viceversa se abbiamo

generato l’inversione non perdiamo nulla e quindi le cellule saranno resistenti ad entrambi gli antibiotici.

A cosa serve il gene hprt suddiviso in due parti? Sostanzialmente ci consente di fare una terza selezione,

che è la selezione HAT.

Per entrambi i riarrangiamenti in realtà abbiamo la giustapposizione delle due porzioni del gene hprt. In

entrambi i casi frapposto tra la porzione 5’ e la porzione 3’ del gene c’è un sito loxP in modo tale che,

nonostante la presenza del sito loxP, si mantiene la ORF del gene. Per cui se è avvenuto il riarrangiamento

corretto, quindi la ricombinazione sito-specifica mediata da Cre, allora si ricostituisce il gene hprt

funzionante. Dopo il riarrangiamento si ha la giustapposizione delle sue porzioni del gene, però in entrambi

i casi rimane il sito loxP in mezzo alle due porzioni, ma rimane comunque il frame.

Quindi le cellule in cui è avvenuto il riarrangiamento esprimeranno questo enzima, che è la ipoxantin-

guanidin fosforibosiltransferasi. Questo enzima consente di fare una selezione HAT. Questa si basa sulle vie

biosintetiche della sintesi dei nucleotidi. In una cellula sostanzialmente abbiamo un pathway di sintesi delle

basi azotate a patire da componenti semplici: nel caso deIle purine si parte da glicine e deossiribosio, nel

caso delle pirimidine si parte da aspartato e deossiribosio. Questo attraverso una serie di passaggi

enzimatici. Il passaggio enzimatico chiave per questo pathway usa il diidrofolato reduttasi (DHFR) che è

necessario a produrre entrambi i nucleotidi monofosfato con purina, quindi AMP E GMP: questo enzima

porta glicina e deossiribosio all’inositolo monofosfato (IMP) che è precursore diretto/indiretto di entrambi i

nucleotidi monofosfati. Viceversa nel caso dei nucleotidi monofosfato pirimidinici, è necessario