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possono avere un’altra mutazione unc-13. Tra gli individui F1 che sopravvivono soprattutto se hanno un

apprezzabile fenotipo unc avremo o nuove mutazioni di unc-13 o nuove mutazioni in altri geni che però

indotti in eterozigosi con l’allele di unc-13 danno il fenotipo unc e soprattutto non vengono contro-

selezionati dall’agente selettivo.

Perché questi animali sopravvivono? unc-13 è un gene coinvolto nella trasmissione colinergica. L’agente

blocca l’acetilcolinesterasi che è l’enzima che nello spazio intersinaptico rimuove l’ACh quindi regola il

momento in cui la trasmissione dell’impulso deve cessare. Se non abbiamo acetilcolinesterasi, l’ACh non

viene degradata e quindi continua a generare un potenziale d’azione nel neurone post-sinaptico. Perché un

animale che ha un deficit della trasmissione colinergica è in grado di sopravvivere a un agente che

impedisce il blocco della trasmissione colinergica? Un animale in cui avviene la non produzione di un

quantità normale di ACh o una perdita di efficienza in uno dei passaggi che portano l’Ach dal momento in

cui è prodotta al momento in cui è rilasciata nello spazio intersinaptico riesce a sopravvivere perché di fatto

ha meno ACh nello spazio intersinaptico.

Hanno trovato una serie di funzioni.

Schema di un bottone presinaptico: membrana post-sinaptica che esprime il recettore dell’Ach. Questa

viene prodotta attraverso vari step di reazioni biochimiche, viene accumulata attivamente nelle vescicole

sinaptiche che vengono trasportate lungo i microtubuli dell’assone. Queste vescicole devono raggiungere, e

lo fanno in modo molto regolato, la membrana pre-sinaptica. Solo se la raggiungono legati ad essa da

particolari complessi proteici riescono a realizzare esocitosi e rilasciare ACh nello spazio intersinaptico.

UNC-13 (pallino nero) è una proteina fondamentale per ancorare la vescicola pre-sinaptica alla membrana

pre-sinaptica permettendo l’esocitosi.

Tra i geni identificati ci sono x esempio:

unc-64 che fa parte di un complesso con cui unc-13 interagisce fisicamente per creare il complesso

• che consente l’ancoraggio della vescicola sulla membrana e la esocitosi. Quindi ha una funzione

strettamente correlata, si contattano fisicamente all’interno dello stesso complesso. Doppio

eterozigote unc-13 unc-64 sopravvive al tossico

snb-1 (sinaptobrevina) che codifica per una proteine che fa parte del complesso unc-13/unc-64 ma

• non contatta fisicamente unc-13, però fanno parte dello stesso proteico. Quindi sopravvive anche

l’eterozigote unc-13 snb-1

mutazione in funzioni non strettamente correlate per esempio UNC-104 che è una proteina

• chinesina fondamentale x il trasporto attivo della vescicola lungo il binario rappresentato

dall’apparato microtubulare dell’assone

Perciò troviamo sia geni che codificano proteine che interagiscono fisicamente con la proteina codificata

dal gene esca (unc-13), cioè quello la cui mutazione sensibilizza il background e lo rende borderline. Ma

troviamo anche funzioni che codificano per proteine che fanno parte dello stesso complesso pur non

interagendo fisicamente con esso ma anche funzioni più lontane per esempio funzioni che rendono

efficiente il trasporto della vescicola che poi si ancorerà al complesso. Questo allontanarsi funzionalmente

dallo step specifico “avvelenato” nel background genetico sensibile che usiamo come esca fa sì che un po’ si

diluisca l’informazione: non sono stati trovati ad esempio geni coinvolti nella produzione dell’ACh. Non

sono riusciti ad andare oltre (come nel multivulva).

Questo genere di screen quando è possibile realizzarlo con strumenti raffinati è molto informativo. Se poi

possiamo applicare una selezione e lavorare su grandi numeri allora sono screen ce portano alla dissezione

completa del pathway.

Questo screen deriva da screen per non complementazione che in questo caso era volto alla ricerca di

nuovi alleli di unc-13 perché vogliamo fare uno studio struttura-funzione di unc-13. Abbiamo perciò

bisogno di isolare il maggior numero possibile di alleli di unc-13. In questa classe di animali che hanno un

fenotipo unico e sopravvivono all’agente selettivo possiamo avere gli omozigoti unc-13. In realtà si sono

accorti che tra le mutazioni trovate c’erano sì delle mutazioni unc-13 ma anche mutazioni in anche in altri

siti (la sinaptobrevina, unc-64 ecc). Quando sono andati a studiare cosa succedeva si sono accorti che la

seconda mutazione non cadeva in unc-13 ma di fatto non complementava. Più che non complementare la

funzione di unc-13 le due mutazioni non consentivano che il processo funzionasse.

I due singoli eterozigoti invece per unc-13 e sinaptobrevina muoiono se esposti all’agente selettivo perché

in questi due gnotipi la singola eterozigosi o di unc-13 o di sinaptobrevina o di unc-104 non blocca

sufficientemente la efficienza del processo, cioè c’è tanta ACh nello spazio intersinaptico. Quindi la non

rimozione dall’Ach che è a livelli normali uccide l’animale per una sorta di tetano muscolare, cioè per una

eccitazione cronica di tutti i fasci muscolari.

Mutagenizzare l’ermafrodita e non il maschio pone una complicazione cioè la possibilità che io generi

mutazioni sullo stesso cromosoma su cui è unc-13 perciò le due mutazioni sono in cis e questo può rendere

la cosa non conveniente: il mio interesse è isolarla in questo screening e poi studiarla da sola la mutazione.

Se io ce l’ho in cis con unc-13 l’unico modo di separarla è farle ricombinare.

Con questo genere di screen possiamo identificare funzioni, geni che codificano proteine che interagiscono,

oppure che non interagiscono fisicamente ma che fan parte dello stesso complesso proteico oppure che

lavorano nello stesso processo ma in punti differenti non troppo lontani. Questo porta spesso a una

gradualità del fenotipo da non-complementazione extragenica cioè il fenotipo del doppio eterozigote. Cioè

il fenotipo originato in questi animali anche quando non esponiamo al tossico è un fenotipo uncordinate

che può vere maggiore forza. I parametri x stabilire la forza di un fenotipo sono espressività e penetranza.

Giocando su questi due parametri possiamo avere già a priori una indicazione di quanto le due funzioni

lavorano in vicinanza. Cioè i doppi eterozigoti di mutazioni per geni che codificano per proteine che

interagiscono fisicamente in genere danno fenotipi più forti perciò maggiore penetranza e/o maggiore

espressività (maggior frazione di individui con fenotipo forte). Man mano che ci allontaniamo, quindi su

geni che codificano per proteine del complesso ma che non interagiscono fisicamente o ancora di più siu

geni che regolano uno step differente ma non troppo lontano del processo biologico, danno fenotipi che

possono avere una minore espressività, cioè aumenta la quantità di individui con fenotipo più leggero,

oppure abbiamo una indicazione di penetranza incompleta. Questo vuol dire che non tutta la progenie

doppia eterozigote mostrerà il fenotipo. Queste sono le interazioni quindi che possiamo non identificare.

SCREEN PER LETALITÀ SINTETICA

Non è propriamente uno screen in BG genetico-sensibile perché la letalità sintetica è un fenomeno che è

stato identificato in lievito data anche la possibilità di analizzare la progenie aploide che non è comune a

tutti gli organismi. Per cui singoli omozigoti danno un fenotipo ma non di letalità, cioè danno un fenotipo

vitale, ma i doppi omozigoti danno un fenotipo letale.

Esempio: unisce una serie di approcci interessanti. L’argomento è il chiarimento di una funzione di un gene

che si chiama MEC-8. Questo codifica per un fattore di splicing necessario nei fenomeni di exon skipping

(saltare un esone), cioè nella regolazione degli splicing alternativi. È un processo estremamente importante

perché consente a un unico gene di produrre potenzialmente più funzioni proteiche, molto o poco diverse.

MEC-8 perciò regola splicing alternativi, i mutanti nulli si questo gene hanno leggeri difetti a livello dei

neuroni sensoriali e dei muscoli somatici. Hanno un fenotipo vitale con caratteristiche fenotipiche

osservabili ma non molto forti. È stato identificato un suo target che è unc-52 quindi avrà a che fare con la

trasmissione neuromotoria e che codifica una proteina presente anche in altre specie quindi conservata

evolutivamente, che si chiama perlecan ed è una componente della matrice extracellulare. Questa è una

sorta di comparto cellulare la cui importanza sta diventando sempre più evidente. Quello che veniva visto

fino a poco tempo fa come spazio amorfo che riempie lo spazio tra le cellule è un universo di funzioni

proteiche che sono fondamentali per una marea di processi, dal contatto cellulare (può essere un modo per

tenere unite le cellule ma nella grande maggioranza dei casi questo significa la creazione di complessi tra

proteine espresse dalle due cellule che creano comunicazione tra le due e quindi la induzione di

trasmissione del segnale in una delle due cellule) a complessi proteiche che regolano la diffusione di alcune

proteine che si ritengono capaci di diffondere, secrete dalle cellule, in realtà spesso questa diffusione non è

libera ma è regolata dalla interazione di questi fattori con proteine della matrice extracellulare che ne

regolano lo spostamento.

perlecan perciò è un componente essenziale della matrice extracellulare, e l’allele isolato come capace di

dare letalità sintetica in un doppio mutante unc-52/mec-8 si è scoperto in realtà portare una mutazione

non senso all’interno dell’esone 17 o dell’esone 18 del gene perlecan. Gli alleli mutanti identificati perché

capaci di dare un meccanismo di letalità sintetica, quindi morte del doppio omozigote con mutazioni nel

gene MEC-8, si è scoperto essere alleli di unc-52 (perlecan) che recano una mutazione non senso o

nell’esone 17 o nell’esone 18.

Quindi mutazioni mec-8 omozigoti sono vitali e fertili con un leggero fenotipo neuromuscolare, mutazioni

non senso in uno di due esoni di perlecan non hanno fenotipo letale (singoli omozigoti). Perché insieme

danno fenotipo di letalità sintetica (doppio omozigote)? Perché mec-8 agisce skippando questi due esoni

cioè non fa includere gli esoni 17 e 18 quando funziona bene nel trascritto maturo. Perciò skippa gli esoni

che portano i nonsenso: per questo gli alleli unc-52 producono perlecan, perché se mec-8 funziona quei

due esoni vengono eliminati dal trascritto.

Questa identificazione ha invogliato i ricercatori a cercare di vedere se esistono altri geni di cui mec-8

regola lo splicing alternativo. Perciò hanno fatto uno screen per letalità sintetica per trovare i geni target di

questo fattore di splicing.

Dobbiamo lavorare in condizioni di omozigosi di mec-8, che porta a individui con un leggero fenotipo ma

comunque vitali e fertili.

Mutagenizzano una P0 di individui omozigoti x mec-8 e omozigoti x una mutazione in un altro gene, unc-36,

che in questa strategia di mutagenesi viene usato come marcatore (non c entra niente con mec8) e

consente di capire se abbiamo isolato una mutazione correlata a mec-8 o meno. In realtà questi individui

ermafroditi mutagenizzati recavano anche un mini-cromosoma in cui erano stati clonati i cDNA selvatici di

mec-8 e di unc-36: un extracromosoma a segregazione irregolare (non ha una segragazione perfetta, ogni

tanto viene perso con una frequenza apprezzabile). Questi sono perciò individui perfettamente normali,

cioè hanno complementazione sia di mec-8 che di unc-36, non hanno alcun fenotipo unc e non hanno alcun

fenotipo mec-8 perciò sono animali sani.

Questa P0 è stata mutagenizzata, autofecondazione, quindi sostanzialmente avremo in F1 che la maggior

parte degli animali non hanno una mutazione (oppure ha mutazioni che non selezioneremo perché non ne

abbiamo evidenza e non ci interessano). Alcuni degli individui saranno mutanti eterozigoti x una mutazione

di potenziale interesse. Come hanno fatto a capire tra tutti gli F1 generati quali potevano essere

interessanti? A questo livello non capiscono quali sono gli individui eterozigoti per una mutazione di

interesse e quelli che non hanno mutazioni di interesse o quelli eterozigoti per mutazioni che non

interessano. Hanno solo gli F1. Questi vengono fatti autofecondare perciò e la selezione può essere fatta

solo con un lavoro certosino analizzando la progenie di singoli individui F2.

Quindi vengono fatti nascere gli F2, vengono presi quanti più individui di F2 possibile e vengono posti

ciascuno in una piastra singola x avere in essa la progenie di singoli individui di F2.

Ovviamente gli individui di F1 che non hanno alcuna mutazione o che hanno mutazione in eterozigosi in

geni non correlati, non segregano nessun genotipo che abbia a che fare con mec-8. Quindi nella maggior

parte dei casi gli F2 saranno individui +/+ oppure saranno individui eterozigoti/omozigoti per mutazioni non

correlate cioè che non interagiscono con mec-8. Se io analizzo la progenie F3 di singoli individui di F2 fatti

così, la maggior parte degli individui saranno omozigoti mec-8, omozigoti per unc-36 ma non hanno nessun

fenotipo mec-8 e nessun fenotipo legato a unc-36 perché c’è l’extracromosoma che complementa sia la

funzione mec-8 che la funzione unc-36. Perciò se non c’è fenotipo unc vuol dire che c’è l’extracromosoma e

quindi viene complementato unc-36 e mec-8.

Questo extracromosoma con una frequenza apprezzabile però viene perso. Analizzando una cinquantina di

individui F3 figli di un singolo F2 ci saranno degli individui che hanno perso l’extracromosoma e quindi che

hanno perso la copia genica che complementa il fenotipo unc-36 e quindi saranno unc. Ma se sono unc,

vuol dire che hanno perso anche il cDNA di mec-8. Se però sopravvivono vuol dire che o non è presente

nessuna mutazione, o se invece c’è una mutazione in eterozigosi/in omozigosi non ha niente a che fare con

mec-8 e non produce letalità sintetica con mec-8.

Invece ci sono in F2 degli individui che recano una mutazione che ha a che fare con mec-8 (la hanno

chiamata sym, cioè synthetically lethal with mec-8) generata da questa mutagenesi: abbiamo alcuni animali

di F1 che la recano in eterozigosi, facciamo autofecondare, prendiamo individui di F2, li mettiamo in singola

coltura. Quei rari individui di F2 che hanno sym in omozigosi sopravvivono perché hanno

l’extracromosoma. Quindi di fatto anche se mutanti omozigoti sym e mutanti mec-8 in realtà hanno una

copia extra di mec-8 che complementa, ma quando vado ad analizzare una progenie F3 di un individuo

triplo omozigote questa mi genererà tripli omozigoti: a questo punto guardo una certa quantità di individui

F3 (l’ordine di grandezza è sulla cinquantina) in modo tale da sfidare la perdita del mini-cromosoma, perché

la maggior parte degli individui in F3 hanno il mini-cromosoma e non hanno infatti un fenotipo unc, ma

quando questi perdono il mini-cromosoma, allora si manifesta la letalità sintetica. Me ne accorgo dal fatto

che pur guardando tanti animali F3 non vedo mai comparire individui con fenotipo unc. È un lavoro tedioso

perché sono costretto per diagnosticare la presenza di una mutazione interessante a guardare tanti

individui F3 derivati ognuno da singoli individui F2, in modo tale da mettermi nella condizione di guardare

un numero di animali che sia al di sopra della frequenza con cui statisticamente si perde l’extracromosoma.

Questa perdita fa sì che mec-8 non sia più complementato quindi se qui c’è effettivamente una mutazione

che da letalità sintetica con mec-8, allora questi individui muoiono. Non compaiono individui unc. Quando

c’è un fenotipo unc gli animali si avvitano su se stessi ed hanno un comportamento anomalo, quindi è

facilmente riconoscibile, perciò è un marcatore per noi.

Seguendo questa strategia, sono stati identificati almeno 5 loci che sono geni i cui trascritti il cui splicing

alternativo è regolato da mec-8, sono perciò i target di un fattore di splicing.

L’autofecondazione genera il 25% di omozigoti +/+, 25% di omozigoti sym/sym, ma genera anche il 50% di

eterozigoti sym che ovviamente ci perdiamo perché gli F2 fatti così li metto via come non interessanti. Per

questo si fa la coltura di singoli individui F2 per avere tutta la progenie di un solo individuo di F2 in quella

piastra. È importante aumentare la quantità di progenie che devo guardare. È fondamentale perché il

sistema di marcatori che ci consente di seguire lo screen è il mini-cromosoma che si perde con una

frequenza apprezzabile ma ci vuole una progenie di almeno una cinquantina di individui come ordine di

grandezza. Devo essere sicuro di avere abbastanza individui di F3 da poter avere la perdita del mini-

cromosoma perché se ne guardo pochi e non vedo fenotipi unc in realtà potrei avere guardato una

progenie troppo piccola che non mi ha generato individui unc e io finisco quindi per mappare un gene che

non c’entra niente. MAPPATURA DI MUTAZIONI PUNTIFORMI

Anche con C. elegans rimane il problema di come mappare queste mutazioni. Hanno dovuto mettersi nelle

condizioni di usare il maggior numero possibile di loci marcatori. In realtà sono state isolate le mutazioni

unc che sono le più utilizzate sparse per il genoma visto che è un fenotipo che insorge quando mutano vari

processi biologici (contrazione muscolare, trasmissione neuromuscolare, afferenze sensoriali che si

traducono in una risposta motoria). La mappatura per ricombinazione o l’assegnazione di una nuova

mutazione ad un cromosoma cioè a un gruppo di associazione viene effettuata in genere con marcatori

morfologici però non ci sono abbastanza marcatori morfologici per riuscire a mappare abbastanza ... Sono

quindi stati cercati marcatori molecolari con studi pilota e anche nel caso di C. elegans si è arrivati a

valutare la frequenza di SNPs circa a 1/800-1000 bp. Però per riuscire a usare marcatori molecolari è

necessario avere le linee pure.

Siccome la ricerca con C. elegans è parecchi decenni che va avanti ma non tanto quanto con Drosophile è

stato possibile organizzarsi ed isolare delle linee pure da usare come riferimento a questo scopo: una è una

linea isolata in Inghilterra e una alle Haway. È stato fatto in breefing in modo da aumentare al limite avere

la omozigosi totale di tutto il genoma. Un genoma viene usato per mutagenesi, l’altro genoma che porta

alleli differenti al maggior numero possibile di loci SNPs è stato usato per la mappatura per ricombinazione.

Nelle banche dati c’è tutto il sistema di SNPs con cui si può mappare.

Esempio. Cromosoma 1 suddiviso in varie regioni. Ingrandimento di una regione dove ci sono i vari

polimorfismi identificati in seguito a sequenziamento genomico. Hanno ottimizzato per ogni SNP i primer

che permettono di amplificarlo.

Fino ad oggi con C. elegans non è ancora efficiente la mutagenesi inserzionale: sono stati isolati alcuni

trasposoni endogeni di C. elegans per esempio l’elemento Tc, il problema è che i ceppi usati in laboratorio

portano una enorme quantità di questi trasposoni, troppe decine di copie, per cui alla fine benché la

biologia di questi trasposoni sia stata studiata, sono talmente tante le copie residenti ne genoma che

diventa troppo laboriosa poi l’identificazione di quale inserzione provoca la mutazione di interesse.

Drosophila è stata l’organismo pilota per tutti gli organismi modello. Il sistema della mutagenesi

inserzionale con elementi trasponibili è estremamente raffinato tant’è che una famiglia di trasposoni di

Drosophila, la famiglia marriner, è in fase di studio per cercare di vedere se è possibile usare il trasposone

di Drosophila marriner, mobilizzarlo e inserirlo nel genoma di C. elegans per usarlo come vettore di

trasposizione in C elegens. Il vantaggio è che marriner non è presente nel genoma di C. elegans per cui se

io riesco a mobilizzarlo e produrre mutazioni inserzionali con questo trasposone di Drosophila,

l’associazione mutazione-inserzione è univoca.

Danio rerio

Passiamo ai vertebrati. Danio Rerio è un pesce tropicale perciò il range di temperatura è di 18-24 gradi. È di

acqua dolce e quindi rende l’allevamento abbastanza semplice. È abbastanza piccolo, allo stadio adulto è di

circa 3-4 cm. Ha una buona riproduzione, sia in termini di velocità dello sviluppo sia in termini di fertilità. Si

riescono in pochi giorni a ottenere centinaia di individui. Caratteristica molto importante è che lo sviluppo è

esterno cioè io posso seguire lo sviluppo dalla fecondazione a ogni stadio.

Ha un elevato numero di cromosomi (25). Questo complica un po’ la genetica. Per quanto riguarda il

genoma, più che la dimensione, ciò che lo rende un sistema difficilmente trattabile è che ha un elevato

livello di ridondanza genica. Perciò molto spesso la inattivazione genetica, o per interference o per utilizzo

del sistema antisenso, in realtà molto spesso non porta fenotipi apprezzabili. Questo proprio perché

inattivando in senso lato un gene singolo, spesso non si vede nessun fenotipo proprio perché i geni sono

mediamente molto ridondanti.

Cosa molto positiva invece è la trasparenza degli involucri esterni dell’uovo in tutte le fasi dello sviluppo.

Questo è un aspetto importante perché vediamo le struttura anatomiche interne durante il loro

funzionamento, e questo amplia molto il ventaglio di processi biologici che posso studiare. La trasparenza

permette per la prima volta con Zebrafish di osservare fenomeni fisiologici importanti come il battito

cardiaco e la circolazione del sangue (guardando al microscopio a dissezione, durante la fase prima di

arrivare allo sviluppo, riusciamo a vedere il sangue che circola e il cuore che batte).

Sono teleostei, cioè sono pesci ossei, che però hanno una circolazione chiusa anche se semplice. Il cuore ha

un atrio e un ventricolo che si interpone nel circolo venoso. Hanno un cuore più semplice ma molto vicino a

quello dei mammiferi.

È possibile fare microiniezioni, e sono stati messi a punto dei sistemi di trapianti cellulari. Un altro sistema

modello vertebrato usato per il sistema dei trapianti cellulari è il pollo: si trapiantano cellule di quaglia nel

pollo per studiare il comportamento di particolari tipi cellulari dentro un contesto differente e poterli

seguire durante lo sviluppo. Si riconoscono usando marcatori marcatori specifici o dalle dimensioni dei

nuclei delle cellule. Lo svantaggio è che bisogna fare un vero e proprio intervento chirurgico ( bisogna aprire

l’uovo ecc).

Se uno deve fare uno storage a lunga scadenza di particolari assetti genotipici si può congelare lo sperma e

dopodiché procedere alla fecondazione di femmine.

Le covate sono abbastanza grandi per consentire una analisi fenotipica statisticamente interessante.

La femmina è quella sopra, il maschioè quello sotto: la femmina è un po’ più grande.

Nel caso dei pesci la segmentazione è meroblastica cioè è parziale: non tutto l’uovo fecondato cellularizza e

si divide. C’è una separazione tra polo animale (ciò che cellularizza e si divide) e polo vegetale. Quest’ultimo

è la parte ricca di nutrimento, cioè il tuorlo. Lo sviluppo è esterno, e l’embrione e quella che viene poi

chiamata larva si sviluppa tramite le sostanze nutritive accumulate nel tuorlo.

Quindi segmentazioni, poi a circondare il tuorlo si comincia a formare l’animale (testa a sinistra e coda a

destra) e arriva poi la gastrulazione cioè la formazione dei tre foglietti embrionali (mesoderma, esoderma,

ectoderma), neurulazione ecc.

Formazione dei somiti, cioè segmenti ma sono strutture mesodermiche e dai vari punti del somite derivano

il derma, i muscoli, lo scheletro ecc. cioè tutti i derivati mesodermici metamerici.

Man mano che lo sviluppo avanza il tuorlo si riassorbe, quindi viene usato e poi praticamente arriviamo ad

un animale completo che ha terminato lo sviluppo.

Una delle autrici che ha tentato di fare diventare Zebrafish la Drosophila dei vertebrati è proprio Christiane

Nusslein-Volhard dopo aver preso il Nobel per i suoi studi su Drosophila. il primo tentativo è stato proprio

di partire con una mutagenesi in realtà non realizzata direttamente da lei.

Questa mutagenesi è stata la collaborazione tra il laboratorio di Nusslein-Volhard (Tubinga) e un

laboratorio a Boston. L’assunto iniziale era: non ci sono alcuni strumenti genici. All’epoca erano partiti degli

approcci di tipo reverse genetics. Uno di questi veniva da un grande progetto che riguardava vari laboratori,

che avevano cominciato a studiare la funzione dei geni di Zebrafish partendo dal pattern di espressione.

Quindi avevano creato delle librerie di espressione, cioè genoteche di cDNA, ed era partita a tappeto una

analisi del maggior numero possibile di cloni di cDNA, facendo ibridazione in situ (FISH) su vari stadi di

sviluppo. Questo è un approccio descrittivo ma non funzionale: ho solo una indicazione di quali possano

essere le fasi sviluppo, o gli organi o i tessuti dove plausibilmente posso trovare i tratti fenotipici dovuti a

una mutazione o almeno a un approccio antisenso di interference.

Quindi decidono di fare partire un progetto molto grosso di produzione di mutanti, ma senza strumenti

genetici (come il cromosoma bilanciatore, ermafrodita, marcatori dominanti per linee isocromosomici o la

possibilità di fare uno screen a tappeto per geni essenziali o quantomeno noti).

Però una serie di vantaggi ci sono: sviluppo esterno, superficie del corpo trasparente per gran parte dello

sviluppo, cioè sostanzialmente lavoro dinamico alla ricerca di fenotipi: ha uno sviluppo abbastanza veloce

per essere un vertebrato e quindi la osservazione dei fenotipi può non essere complessa.

Uno screen genetico rispetto a qualunque altro tipo di screen (come ad esempio quello molecolare come

approcci di microarray, espressione differenziale ecc.), è uno screen funzionale perché se trovo il fenotipo

lo associo alla perdita di funzione di un gene, quello mi dice il ruolo di quel gene e per di più è uno screen

unbiased, cioè non ha pregiudizi. Se io faccio uno screen di mutagenesi, sia con agenti alchilanti sia con un

sistema di mutagenesi inserzionale, non piloto nulla, vado a posteriori a cercare i fenotipi. Perciò io non ho

pregiudizi nei confronti dei geni che posso trovare. Se questo è condotto in una dimensione

sufficientemente grande posso pensare di trovare tutti i geni coinvolti nel processo di sviluppo che voglio

trovare.

Anche loro partivano da questo presupposto: fanno uno screen unbiased, l’unica cosa è che probabilmente

dato l’alto livello di ridondanza genica, è ovvio che probabilmente questo avrebbe impedito di trovare e

identificare determinati geni ridondanti, perché mutati singolarmente probabilmente non avrebbero dato

un fenotipo.

Quindi hanno deciso di fare mutagenesi con agenti alchilanti e alla generazione giusta di cercare fenotipi a

carico di tutte le strutture che potevano osservare. Quindi cercare geni coinvolti nello sviluppo precoce

oppure a carico dei vari organi e apparati che, essendo un vertebrato, hanno immediata corrispondenza

con gli organi e apparati dei mammiferi. Quindi la notocorda (struttura scheletrica assile), i somiti

(strutture mesodermiche metameriche che danno origine a: derma, muscoli scheletrici, scheletro), il cuore,

la circolazione, il sangue, la pelle, le pinne, l’occhio, le mascelle e gli archi branchiali, l’intestino, il fegato

ecc.

Hanno usato come agente mutageno l’etil-nitrosurea (ENU): si è rivelata più efficace (anche nel topo)

dell’EMS. Quindi mutagenesi alchilante.

Non c’è alcun marcatore quindi è stato un vero e proprio lavoro di forza bruta: esposizione di massa di

maschi a ENU incrociati in massa con femmine selvatiche (generazione parentale).

In F1 sappiamo che è la generazione dei potenziali eterozigoti. Hanno dovuto fare degli incroci singoli per

capirci qualcosa, cioè creare delle famiglie, e ne hanno create 6000, partendo da 6000 maschi di F1

singolarmente incrociati per femmine selvatiche.

A quel punto endofamiglia hanno lasciato inincrociare la progenie di F1. Non avendo alcun marcatore

ovviamente in F2 segregano individui selvatici maschi e femmine o individui eterozigoti maschi e femmine.

Posso discriminare maschi da femmine, ma non posso discriminare i potenziali eterozigoti dai selvatici.

Quindi hanno lasciato inincrociare maschi e femmine di F2 senza sapere quali fossero i selvatici e quali gli

eterozigoti teoricamente per un’unica mutazione.

Se il dosaggio del mutageno è stato fatto bene posso teoricamente aspettarmi che sia una la mutazione che

segrega all’interno di una singola famiglia (nella maggior parte dei casi non è così). Hanno quindi analizzato

entro famiglia gli eventuali fenotipi nella progenie di F3.

Sono quattro i possibili incroci tra individui di F2:

1. Maschi selvatici x femmine selvatici che non danno alcun fenotipo

2. Maschi selvatici x femmine eterozigoti che ancora non danno alcun fenotipo

3. Machi eterozigoti x femmine selvatiche che non danno alcun fenotipo

4. Maschi eterozigoti x femmine eterozigoti: solo 1 incrocio su 4 di F2 può dare luogo a un 25% di

individui omozigoti, questo per 6000 famiglie.

Perciò guardando una progenie F3, 1/4 di 1/4 della progenie poteva avere un fenotipo, perciò 1/16 della

progenie. Perciò al secondo, al terzo, al sesto giorno dalla fecondazione hanno guardato la progenie per

cercare dei fenotipi: se ci aspettiamo che 1/16 della progenie di F3 può essere mutante, ci aspettiamo che il

fenotipo si ripeta magari non in un sedicesimo della progenie, ma comunque in un numero diverso da 1.

Questo perché c’è sempre il discorso della penetranza o dell’espressività del fenotipo. Quindi sono state

scartate una serie di linee che davano o un fenotipo troppo debole o al contrario un fenotipo troppo forte.

Sono state trovate circa 4200 mutazioni, di cui circa i 2/3 sono state scartate perché davano fenotipo

troppo forte o perché erano a carico di geni fondamentali per la biologia cellulare cioè geni housekeeping o

geni che compromettevano globalmente la sopravvivenza delle cellule, o perché davano fenotipi di

sviluppo ma troppo forti cioè poco caratterizzabili e studiabili per capire cosa fa il gene.

Hanno continuato il lavoro su circa 1200 mutanti e quelli che avevano un fenotipo simile li hanno incrociati

x fare una analisi di complementazione, cercare quindi di scremare e identificare mutazioni degli stessi geni

oppure no. Sono arrivati ad attribuire circa 900 mutazioni hanno a poco più di 350 gruppi di

complementazione. Quindi tutto sommato, anche se sono partiti da 6000 famiglie e hanno trovato circa

370 gruppi di complementazione, è andata bene.

Anche la efficienza di recupero di molteplici alleli dello stesso gene è stata buona: il range di numerosità

degli alleli dello stesso gene era variabile tra 1 e 34 alleli, con una media di circa 2,5 alleli per gene.

Due classi particolari di mutanti sono proprio a carico dello sviluppo del cuore e della circolazione del

sangue.

In particolare hanno trovato una classe di mutanti in cui si mostravano difetti a livello della formazione del

cuore: una classe di mutanti con una sorta di dilatazione cardiaca:

Questo gene è stato chiamato jek : l’analisi fenotipica ha mostrato che c’è un blocco nello sviluppo della

valvola atrioventricolare dopo aver introdotto attraverso incrocio un transgene in cui la GFP marca le

cellule endocardiali. Perciò vediamo il cuore, vediamo la valvola e vediamo che c’è una alterazione dello

sviluppo che porta alla dilatazione ma sostanzialmente non si differenzia completamente la valvola.

La cosa che è risultata più interessante una volta mappato e identificato il gene è che jek codifica un enzima

noto che è UDP-glucosio deidrogenasi che è coinvolto nella sintesi dei glicosaminoglicani di cui fanno parte

l’acido ialuronico, condroitinsolfato, epransolfato, che sono tutte molecole presenti nella matrice

extracellulare, che media il contatto tra le cellule ma anche le segnalazioni tra esse. Di fatto l’ ipotesi degli

autori è che x il differenziamento della valvola atrioventricolare è necessario un meccanismo di cell-cell

communication tra le cellule del miocardio del cuore e le cellule dell’endocardio che rivestono

internamente le camere cardiache ventricolo perché si possa differenziare la valvola al confine tra l’atrio e il

ventricolo. Quindi un enzima che controlla la sintesi di queste molecole porta al mancato sviluppo della

valvola atrio-ventricolare e a problemi di dilatazione cardiaca.

Un’altra classe di mutanti è quella dei mutanti anemici. Uno dei vantaggi di Zebrafish è appunto che si può

vedere il sangue mentre circola. Animale selvatico: si vede la colorazione rossastra (emoglobina) e il fluido

rossastro dentro alla circolazione sanguigna. Sostanzialmente hanno visto una riduzione forte della

colorazione rossastra dovuta alla emoglobina. Hanno trovato varie mutazioni di fatto. Hanno trovato in

questi mutanti anemici in gran parte mutate proteine legate alla sintesi del gruppo prostetico che lega il

ferro. !

weissherbst (weh) codifica per una ferroportina 1 cioè un trasportatore del ferro

• !

dracula (drc) codifica per la Ferrocheletasi che sostanzialmente è un’altra molecola necessaria

• per l’importo del ferro e la produzione del gruppo EME. Tra la’ltro c’è una malattia umana, la

protoporfiria eritropoietica, che è legata a mutazioni simili e infatti dà fenotipo simile

!codifica

yquem (yqe) per uroporfirinogeno decarbossilasi che porta alla produzione del gruppo

• prostetico dell’emoglobina

Analisi fenotipica fatta sul mutante dracula in particolare. Di fatto la mutazione della ferrochelatasi porta

alla produzione di un intermedio tossico e fotolabile e che emette anche fluorescenza. Quindi per esempio

nel primo pannello per mostrare che c’è una fotolisi delle cellule che provoca il fenotipo anemico, hanno

bloccato la circolazione sanguigna e hanno guardato nel tempo (a 0, 30, 120 secondi) quello che succede

agli animali: le tracce fluorescenti calano nel tempo. L’accumularsi di intermedi tossici e fotosensibili porta

alla lisi dei globuli rossi.

Con un approccio del genere è difficile studiare in grande numero mutazioni in particolare a carico

dell’embriogenesi precoce.

Bisogna scovare da alcune caratteristiche biologiche dell’animale ciò che può essere utile. Qualcosa del

genere sono riusciti a identificarlo. Hanno scoperto che individui aploidi sono in grado di sopravvivere per

un numero limitato di giorni, circa due giorni, in condizioni aploidi. Dopo qualche giorno muoiono, non

arrivano a accoppiarsi, però apparte qualche difetto a carico dell’occhio e dell’orecchio e a parte le

dimensioni, sono uguali al diploide.

Questo può essere utile perché ovviamente una mutazione di un aploide dà immediatamente un fenotipo.

Se identifichiamo una mutazione che dà un fenotipo che ci interessa, non possiamo recuperare l’animale

mutante: l’aploide muore e non si riproduce. L’unico modo di mantenere la mutazione e creare una linea è

recuperare la madre eterozigote.

Il modo in cui è stato possibile realizzare uno screening su individui aploidi è stato quello di mutagenizzare i

maschi, incrociare le femmine selvatiche, dopodiché singole femmine di F1 potenzialmente eterozigote

sono state fecondate con sperma trattato agli UV.

Gli spermatozoi esposti agli UV non perdono motilità e capacità di penetrare la cellula uovo, ma il loro

genoma è talmente frammentato che il loro pronucleo sostanzialmente viene inattivato quindi di fatto la

penetrazione avviene, è necessario affinché si inneschi lo sviluppo. Però se gli spermatozoi sono stati

esposti a dosi alte di UV il loro genoma è frammentato e quindi il patrimonio genetico derivante dal

pronucleo maschile non contribuisce al genoma dello zigote.

In questo modo hanno ottenuto una progenie F2 che segregando soltanto i cromosomi materni doveva

essere x metà selvatica e per metà mutante: io devo fare uno screening in pochissimi giorni in modo che se

identifico una famiglia cioè le covate aploidi F2 di singole madri F1, devo essere in grado di identificare

quello che mi interessa per avere ancora in vita la madre eterozigote e quindi poter incrociarla con un

individuo selvatico e quindi produrre maschi e femmine eterozigoti. A questo punto posso vedere se il 25%

degli individui omozigoti mi mostra lo stesso fenotipo mostrato dagli individui aploidi. È un sistema efficace

se posso velocizzare la osservazione del fenotipo.

Va bene se l’analisi fenotipica è fatta usando marcatori molecolari che non sono marcatori genetici, ma è

l’espressione di geni vista o tramite ibridazione in situ (attraverso un trascritto) o usando Ab attraverso la

immunoistochimica oppure mutagenizzando su una linea transgenica che esprima la GFP nella struttura che

siamo interessati a studiare. SCREEN APLOIDI

Approccio che si basa sulla biologia specifica di Zebrafish: possibilità di sopravvivere per pochi giorni come

organismo aploide. La osservazione della progenie aploide ha suggerito la possibilità di fare screening per

cercare funzioni di geni che avessero un ruolo nello sviluppo precoce. La progenie aploide sopravvive alcuni

giorni e quindi si può farlo velocemente, cioè riconoscere i fenotipi velocemente. Soprattutto se vogliamo

fare screening su struttura specifiche. L’individuo aploide riesce a uscire dal periodo embrionale, arriva al

periodo larvale perciò riesce a sviluppare tutte le strutture e gli organi. La superficie del corpo è abbastanza

trasparente però se siamo interessati a fare screening per strutture specifiche soprattutto se queste sono

interne dobbiamo trovare un sistema. Questo tipo di screen è stato accoppiato alla possibilità di marcare le

strutture usando quelli che sono chiamati marcatori molecolare non riferendosi a marcatori genetici (come

microsatelliti) ma riferendosi all’espressione di geni attivi specificamente in determinate strutture.

Si espongono al mutageno i maschi: con Zebrafish risulta più attivo l’ENU (etilnitrosurea) come agente

alchilante. Sono incrociati in massa con femmine selvatiche e viene prodotta una F1 e considerate solo le

femmine. Andiamo a guardare la progenie di singole femmine F1 potenzialmente eterozigoti, e le loro uova

sono fecondate con spermatozoi trattati con elevate dosi di UV (se il trattamento è ben dosato, viene

preservata la motilità degli spermatozoi ma il DNA è danneggiato). Lo spermatozoo è in grado di fecondare

la cellula uovo ma il pronucleo maschile non contribuisce al genoma dei nuovi individui. Si arresta lo

sviluppo del gamete femminile in meiosi prima, e la penetrazione dello spermatozoo innesca il

completamento della meiosi oltre che contribuire al genoma.

Quindi produciamo una progenie F2 derivata dalla madre. Se questa è eterozigote abbiamo il 50% della

progenie sarà selvatica, il 50% della progenie recherà l’allele mutante. Essendo individui aploidi anche se la

mutazione è recessiva siamo in grado di vedere eventuali difetti. Perché analizziamo la progenie di singole

femmine? La progenie muore, quindi se anche noi osserviamo che circa il 50% della covata mostra fenotipo

ricorrente non possiamo recuperare l’allele mutante da questi individui che sono destinati a morire. Quindi

dobbiamo essere in grado di recuperare la madre.

Recuperiamo la madre, femmina eterozigote per una mutazione. La esincrociamo cioè la incrociamo x

maschi selvatici, producendo una progenie che sarà al 50% eterozigote e al 50% no, però avremo entrambi i

sessi. A quel punto inincrociando fratelli e sorelle della generazione successiva, anche se non siamo in

grado di riconoscere gli eterozigoti, una parte degli incroci saranno tra maschi e femmine eterozigoti per cui

potranno dare luogo a circa un 25% della loro progenie omozigoti. Questo è anche il modo di verificare che

il fenotipo osservato nella progenie aploide sia effettivamente un fenotipo correlato a un genotipo.

Aspetto fondamentale è quindi la possibilità di riconoscere i fenotipi velocemente. Soprattutto se vogliamo

cercare mutazioni che alterino una strutture interne, che facciamo fatica a vedere guardando l’animale. Le

dobbiamo marcare.

Esempio

La marcatura può essere la ibridazione in situ. Questa non è la FISH perché non è fluorescente, è una

marcatura con rilevazione colorimetrica: si usa una sonda di RNA quindi si fa una trascrizione in vitro su un

plasmide che ha alle due estremità sui lati del sito di clonaggio due promotori fagici. Questo plasmide è

opportunamente linearizzato ed è usato come substrato x reazione di trascrizione in vitro in cui mettiamo i

precursori (ribonucleotidi-trifosfato), l’enzima, un protettore dalle RNasi. Tra i precursori l’uridintrifosfato

porta un tag cioè un segnale, un epitopo che sia riconoscibile: in genere si usa come epitopo la

digoxigenina. Oppure si usa anche uridintrifosfato con come epitopo l’FIDC che è un fluorocromo. Quindi

l’uridintrifosfato è marcato ha un braccio distanziatore e al termine di questo distanziatore c’è l’epitopo.

Sono ibridazioni RNA-RNA più stabili che ci consentono di lavorare a temperatura un po’ più alta

aumentando la stringenza e quindi facilitando l’ottenimento di un segnale. Evitare il più possibile

contaminazioni da RNasi per non fare degradare i trascritti endogeni. Lavata via la sonda in eccesso dopo la

ibridazione possiamo fare la normale immunoistochimica: incubazione con Ab primario che riconosce

l’epitopo. Questo più essere coniugato chimicamente a un enzima che è la fosfatasi alcalina che reagisce

con substrati specifici e produce un precipitato di Sali che hanno una colorazione violacea che si deposita

nelle strutture rivelando la regione in cui è accumulata.

Interesse nello sviluppo del sistema nervoso centrale. Usano la espressione di un gene che si chiama

Krox20: è un fattore di trascrizione già noto del quale si conosceva il pattern di espressione. Quello che non

è evidenziato è il tuorlo e vediamo l’embrione che lo circonda. In A vediamo l’individuo selvatico: le

macchie nere sono i domini di espressione di Krox20 in vari punti del sistema nervoso in particolare nel

romboencefalo che è la struttura embrionale da cui deriva la parte posteriore del SNC, da cui derivano

cervelletto e alcuni importanti nuclei.

Hanno ibridato la progenie aploide facendo ibridazione in situ con una sonda che rivelasse la espressione di

Krox20, cercano progenie aploide che in circa metà degli individui avesse difetti in questo pattern di

espressione.

Tra questi hanno isolato un mutante che si chiama valentino (val): la sua caratteristica di questi individui

aploidi per questa mutazione è l’assenza di uno dei domini di espressione di Krox20. Questo è il dominio di

espressione nella regione dei rombomeri r5 e r6. Si vede un embrione non marcato: si regionalizza durante

lo sviluppo dando luogo ai rombomeri, cioè i metameri del romboencefalo. C’è una vera e propria

segmentazione, sono separati da piccole invaginazioni che mostrano la regionalizzazione del

romboencefalo. Andando a osservare i mutanti val con la stessa modalità han trovato che mancava la

regionalizzazione della parte più posteriore quindi soprattutto a carico dei rombomeri 5 e 6 del

romboencefalo che quindi risulta liscio e non regionalizza, non completa il proprio sviluppo.

In questo modo è possibile riconoscere velocemente se c’è progenie mutante e recuperare la femmina,

incrociarla e creare una linea di individui che segregano l’allele mutante.

Grazie al primo studio su Zebrafish del pattern di espressione, Krox20 era appunto noto per avere questo

pattern di espressione in queste particolari strutture. Siccome gli autori erano interessati anche allo

sviluppo del sistema nervoso hanno usato Krox20 come marcatore per evidenziare i rombomeri. Loro

caratterizzano val e vedono che non influisce sulla espressione di Krox20 ma sostanzialmente impedisce lo

sviluppo delle strutture in cui Krox20 deve essere espresso. Perciò arrivando al giusto livello di sviluppo e

maturazione, in particolare i rombomeri 5 e 6 non arrivano ad esprimere Krox20. Usano Krox20 come

marcatore.

Ovviamente ha vari vantaggi questo approccio, ma anche dei limiti per esempio non consente di

identificare mutazioni che alterano processi che avvengono dopo i 3 giorni in cui l’aploide sopravvive.

SCREEN PER DIPLOIDI GINOGENICI

Un altro approccio messo a punto è l’approccio per diploidi ginogenici: è una progenie diploide in cui tutto

il patrimonio genetico deriva dalla madre. Come anticipato precedentemente, le uova della femmina si

bloccano prima della fecondazione alla fine della meiosi I, dove non si duplicano le regioni dei centromeri

che quindi non si separano, e ciò che si separa sono i cromatidi omologhi non fratelli: perciò nella meiosi I

avviene la riduzione della ploidia, nel senso che si separano i due componenti della coppia di omologhi ma

senza separazione dei centromeri. Si separano i cromatidi omologhi non fratelli. In meiosi I avviene anche il

crossing-over. Durante meiosi I si può vedere ricombinazione genetica tra i cromatidi omologhi non fratelli

(quella tra i cromatidi fratelli geneticamente non è interessante) che si separano , ma i due cromatidi legati

allo stesso centromero possono non essere del tutto equivalenti. Se in meiosi I è avvenuto uno scambio i

due cromatidi che in origine sono identici (uno la copia dell’altro) possono portare distalmente all’evento di

ricombinazione cioè dal punto di ricombinazione verso il telomero alleli differenti. Puo avvenire in

qualunque punto del cromatidio e alla fine della meiosi I possiamo avere alleli differenti nei geni situati

distalmente rispetto al punto in cui è avvenuto il crossing-over (da qui verso il telomero).

Sono state messe a punto due tecniche differenti per poter produrre questa progenie diploide ginogenica.

!

1. Approccio meccanico di pressione sulle uova (oociti) sono uova abbastanza grandi da poter

applicare una pressione sugli oociti prodotti da meiosi I. Questi sono fecondati con spermatozoi

trattati agli UV, quindi si innesca il completamento della meiosi, ma lo si blocca attraverso la

pressione meccanica, che prima del completamento della meiosi blocca la divisione cellulare cioè

disassembla il fuso mitotico. Per questo sostanzialmente si ottengono al completamento della

meiosi II degli oociti diploidi: questi portano due cromosomi per ciascuna copia in quanto

nonostante fisiologicamente si siano duplicati i centromeri, se noi blocchiamo la segregazione dei

cromosomi otteniamo invece di due cellule ne otteniamo una sola che ha ancora i due cromatidi

fratelli, quindi sostanzialmente una cellule diploide. Se non applichiamo la pressione il

completamento della meiosi I porterebbe alla produzione di due oociti, ciascuno con uno dei due

elementi della coppia. Invece bloccando la meiosi II realtà otteniamo cellule che sono diploidi:

nonostante la duplicazione dei centromeri non è avvenuta segregazione in due cellule differenti,

ma rimane un’unica cellule con entrambi i cromatidi fratelli.

Con questa strategia produciamo cellule che non sono completamente omozigoti: se noi

produciamo cellule diploidi fecondate, quindi in grado di proseguire nello sviluppo, in realtà non

produciamo cellule completamente omozigoti perché recano ancora i due cromatidi fratelli che

però possono aver subito nella meiosi I un evento ricombinativo: per cui sostanzialmente sono in

gran parte omozigoti x tutti gli alleli tranne per eventuali alleli differenti che possono essere

presenti sui bracci cromosomici che sono uno di duplicato dell’altro, ma se sono avvenuti eventi

ricombinativi distalmente a questi eventi possono essere presenti alleli differenti. Però da questi

possono derivare degli alleli diploidi in grado di svilupparsi che saranno omozigoti per gran parte

degli alleli tranne per regioni distali rispetto al punto di ricombnazione che recano alleli differenti.

!

2. Trattamento heat-shock non bloccare la meiosi. Si fecondano gli oociti con spermatozoi trattati

con UV, si lascia completare la meiosi e quindi teoricamente si producono 4 cellule aploidi, a questo

punto ogni cellula reca x ogni cromosoma un cromatidio, e ciò che si blocca sono le prime mitosi

attraverso disassemblamento del fuso mitotico con un trattamento al calore che non uccide le

cellule ma depolimerizza la actina ecc. Quindi si ha una indomitosi: durante la fase S ho replicazione

dei singoli cromatidi ma la segregazione dei cromatidi fratelli viene bloccata e quindi dentro le

cellule sono presenti due cromatidi identici che sono i prodotti di una fase S in cui ciascun

cromatidio uscito dalla meiosi II viene duplicato. Con questa tecnica non ho più il problema della

eventuale presenza di alleli differenti in regione distale che renderebbe la progenie eterozigote.

Perciò la efficienza è maggiore.

Questa è la situazione se faccio avvenire normalmente non solo la meiosi ma anche la mitosi per ottenere

cellule aploidi. Se invece blocchiamo la mitosi ho cellule diploidi. Queste daranno embrioni aploidi ma le

altre danno embrioni diploidi. Questi sono in grado di svilupparsi: la loro caratteristica è quella però di

portare un corredo genetico unicamente derivato dalla madre.

Si parte da singole femmine di F1potenziali eterozigoti fondatrici di famiglie indipendenti la cui progenie è

ginogenica diploide dopo essere state fecondate con spermatozoi inattivati agli UV.

In questo modo la F2, che è la progenie ginogenica, sostanzialmente segrega o individui omozigoti selvatici

o individui omozigoti mutanti. Questo è completamente vero usando la tecnica dell’heat-shock, quando

blocchiamo la prima divisione mitotica. Può non essere del tutto vero se blocchiamo meccanicamente la

meiosi II.

Questo tipo di approccio ha consentito non solo di fare screening su progenie diploide in grado di

svilupparsi e quindi per esempio è stato possibile isolare mutazioni letali recessive; ha consentito anche la

realizzazione di screen x fenotipi ad effetto materno.

Ancora una volta la progenie mutante la vediamo in F2 e non in F3. Ovviamente se le mutazioni danno

letalità l’unico modo di recuperare mutazioni è quello di avere la madre diploide ancora in vita; se invece le

mutazioni danno un fenotipo ma non ledono la mortalità o la fertilità possiamo recuperare la mutazione

dagli individui mutanti, se sono in grado di accoppiarsi e se sono fertili. Altrimenti al solito andiamo a

recuperare la femmina fondatrice della famiglia in cui segrega il fenotipo di interesse.

Uno degli esempi di mutazioni che non alterano la vitalità dell’individuo omozigote, ma che rendono in

particolare le femmine omozigoti sterili, sono appunto mutazioni di geni che hanno una funzione materna:

tra le classi di geni che abbiamo già descritto parlando di Drosophila, e cioè i geni che codificano x funzioni

che sono trasmesse dalla madre alla progenie attraverso il citoplasma della cellula uovo, sia che si tratti di

RNA si a che si tratti di proteine. Di fatto questo è il primo esempio di screen per mutazioni letali ad effetto

materno realizzato su vertebrati. Era stato realizzato sugli invertebrati (Drospophila) ma ovviamente visto lo

sviluppo di un insetto e quello di un vertebrato è ovvio che ci sono enormi differenze.

Nel caso specifico di Zebrafish il genoma zigotico è silente fino al IX ciclo di divisione mitotica dopo la

fecondazione. Più o meno questo è il numero di cicli di divisione nucleare che avvengono in Drosophila ma

ovviamente lo schema di sviluppo è completamente diverso: inizialmente Drosophila fa un sincizio e dopo

circa 10 divisioni nucleari si ha la migrazione dei nuclei in superficie, la cellularizzazione ecc. In Zebrafish si

hanno le divisioni mitotiche da subito, anche se qua la particolarità è la segmentazione neoplastica, cioè

solo il polo animale nell’uovo dove si sviluppa veramente l’embrione si divide e si segmenta.

Però fino alla decima divisione mitotica il genoma zigotico è silente, quindi fino a quel momento lo sviluppo

si realizza sulla base di proteine derivare da trascritti prodotti dalla madre e trasmessi alla cella uovo. Per di

più le prime divisioni cellulari sono mitosi particolari: in una mitosi normale normalmente le cellule

crescono dopo la divisione cellulare, prima che avvenga la divisione successiva. Queste sono divisioni

anomale perché una divisione cellulare qui è seguita dall’altra senza avere crescita cellulare: si ha in realtà

una riduzione delle dimensioni delle cellule perciò. La cellula uovo iniziale è enorme rispetto alle dimensioni

delle cellule che formeranno l’individuo.

Quindi Christiane Nusslein-Volhard ha realizzato il primo screen per funzioni materne in vertebrati. Ha

trovato vari geni.

Esempio: il gene identificato ha l’acronimo fue che sta per futil cycle.

Prime divisioni di un individuo selvatico in A, C, E: la cellula uovo si divide al polo animale in 2 cellule, 4, 8

ecc. Quello che è marcato (puntini scuri) è il DNA, attraverso una tecnica di incorporazione della

Bromodeossiuridina (BrdU), analogo della uridina. Questa viene incorporata al posto della timina durante la

sintesi del DNA; ha un epitopo che possiamo rilevare attraverso un Ab primario coniugato con la fosfatasi

alcalina e il DNA viene rilevato con la reazione cromogena, oppure si usa un Ab primario normale e un Ab

secondario coniugato alla fosfatasi alcalina, e questo ci produce amplificazione del segnale, oppure lo si

rivela con un Ab secondari fluorescente. In B, D, F vediamo invece il mutante: vediamo che non c’è fusione

dei due pronuclei. Dopodiché nel corso delle mitosi si ha a carico dei pronuclei una fase S. Rimangono

sempre due i segnali che sono i due nuclei iniziali che diventano sempre più evidenti e abbondanti come

segnale, quindi c’è fase S, ma non si ha cariocinesi (completamento del ciclo nucleare) cioè non c’è

segregazione del DNA. È una replicazione che non è accompagnata da segregazione dei cromosomi. In più

c’è endocitodieresi: non c’è divisione dei nuclei però le cellule si dividono. La curiosità di questo mutante è

che per la prima volta ha fatto vedere che il ciclo nucleare e il ciclo cellulare sono geneticamente separati.

Sono ovviamente funzioni coordinate ma di fatto non dipendono l’una dall’altra: se ne blocco una l’altra

continua. Quindi questo gene è necessario perché il ciclo nucleare sia completo e regolare ma di fatto non

influenza la citodieresi. Questi embrioni sono ovviamente destinati a morire dopo poche divisioni cellulari.

Immagini ottimizzate: c’è una marcatura di membrana e in più in DNA è mostrato usando un intercalante

del DNA. In fluorescenza la immagine al microscopio consente attraverso la presenza di un po’ di fondo di

vedere la intera struttura. La cosa importante è che il segnale specifico si stacchi dal fondo.

MUTAGENESI INSERZIONALE

In Zebrafish è stata messa a punto la tecnica di mutagenesi inserzionale. Confronto tra utilizzo di un agente

alchilante e l’utilizzo di un agente inserzionale. L’agente alchilante ha il pregio di dare una maggiore

frequenza di mutazioni (maggiore efficienza), consente una mutagenesi fine perché se ben dosata consente

di produrre mutazioni puntiformi perciò sono possibili studi struttura-funzione, isolare più facilmente alleli

quindi avere alleli ipomorfi di varia intensità e alleli nulli. Quindi consente uno studio più fine della funzione

genica. Lo svantaggio è che dobbiamo identificare i geni attraverso una laboriosa tecnica di mappatura per

ricombinazione e attraverso l’approccio di un gene candidato una volta che abbiamo ristretto l’intervallo

cromosomico in cui probabilmente è la mutazione fino ad arrivare a identificarla per sequenziamento.

La mutagenesi inserzionale ha lo svantaggio di dare minore frequenza di mutazioni, non fa mutazioni

puntiformi ma inserzioni di un numero variabile di kilobasi dentro un gene, quindi non consente di fare

mutazioni fini perciò lo studio struttura-funzione. Ha però il vantaggio di introdurre nel genoma dei target

molecolari cioè sequenze uniche non endogene che consentono di identificare più facilmente il gene

mutato.

In Zebrafish sono state utilizzate due tecniche differenti:

1. mutagenesi inserzionale mediata da retrovirus

2. mutagenesi inserzionale mediata da trasposoni

Mutagenesi inserzionale mediata da retrovirus

Inizialmente sono stati usati dei retrovirus quindi dei vettori retrovirali x infettare le cellule embrionali

durante le prime fasi dello sviluppo. È stato un lavoro molto fecondo di informazioni ma piuttosto laborioso

realizzato dal laboratorio di Boston. Hanno infettato embrioni nelle primissime fasi dello sviluppo, quindi

iniettando in mezzo alle cellule questi virus che infettano le cellule e il genoma virale si integra casualmente

nel genoma delle cellule, comprese le cellule precursori della linea germinale. Quindi i vettori retrovirali

sono il grado di dare trasmissione germinale dell’allele mutante.

Ovviamente la progenie derivata dagli embrioni mutati è progenie chimerica e qui indicata come

generazione P. È una mutagenesi guidata dalla ricerca del fenotipo, ancora una volta senza possibilità di

riconoscere i cromosomi, e quindi si è cercato di lavorare con dei pool di cromosomi potenzialmente

mutati: la mutagenesi è stata messa a punto in modo tale da produrre multiple inserzioni nelle stesse

cellule in modo da massimizzare la efficienza. Operativamente hanno infettato le cellule embrionali ai

primi stadi di sviluppo: vediamo la cellula con polo animale cellularizzato e diviso e il polo vegetale diviso.

Da questi embrioni infettati sono stati ottenuti gli adulti che sono stati accoppiati fra loro creando varie

famiglie. Quindi individui P infettati entrambi sono stati accoppiati tra loro creando varie famiglie.

È stato possibile caratterizzare gli individui F1 quindi eterozigoti x nuove inserzioni. La tecnica è stata messa

a punto per ottenere eterozigoti per multiple inserzioni in modo tale da massimizzare la efficienza. Gli F1

sono stati caratterizzati dal punto di vista del numero delle inserzioni e dal punto di vista della qualità,

quindi sia qualitativo sia quantitativo, cercando individui F1 con il maggior numero di inserzioni differenti.

Come hanno fatto?

La tecnica quantitativa è la real-time PCR usando coppie di primer che amplificano efficacemente il vettore

retrovirale.

Schema: vettore retrovirale (LTR terminale). Si riporta come gene reporter LacZ per poter fare

eventualmente un approccio di tipo enhancer trapping. Alcuni esempi: per esempio la coppia 5-6 e 1-4

potrebbero essere delle coppie di primer utili per la quantificazione del numero di copie del vettore.

Dal punto di vista qualitativo invece hanno usato il Southern-Blot senza sacrificare gli individui F1 perché di

fatto è possibile effettuare biopsie in modo tale da estrarre il DNA.

Per la caratterizzazione qualitativa hanno usato il Southern usando il DNA genomico derivato dalle biopsie

di singoli individui F1, digerito con opportune endonucleasi di restrizione, trasferito su filtro e ibridato con

sonde opportune. Cosa vuol dire endonucleasi opportune? Ovviamente endonucleasi che possibilmente

taglino una volta dentro al vettore (ad esempio BglI o PstI) e possibilmente usando come sonda sonde

interne al vettore che possibilmente non ibridino in una regione in cui è presente un dei siti di restrizione

utilizzati. Per esempio se noi usiamo la sonda 1 è bene non tagliare con PstI: se per esempio taglio con BglI

allora la sonda mi riconosce una parte del vettore che non viene suddivisa in due porzioni e quindi a una

banda corrisponde un inserto. Ovviamente BglI taglierà all’interno del vettore e poi taglierà il genoma: sono

endonucleasi a sei nucleotidi, quindi tagliano frequentemente ma non tanto da demolire completamente il

genoma, e quindi a questo pezzo di vettore rimarrà attaccata una porzione di genoma. La posizione del

primo sito (in questo caso BglI) a monte nel genoma dipenderà sostanzialmente dal punto in cui si è andato

a inserire il vettore. Quindi se usiamo una sonda che non riconosca una regione del vettore in cui è

presente il sito di restrizione per l’enzima che usiamo, allora possiamo dire con buoan approssimazione che

ad una banda di peso diverso corrisponde a un inserto diverso. Se invece uso la sonda 1 e taglio con PstI

questa sonda mi riconoscerà due frammenti e a quel punto la unicità della inserzione rispetto alla unicità di

banda non c’è più.

Esempio di DNA ibridato da due famiglie, famiglia A e famiglia B, e i vari individui della famiglia.

Vi sono individui, per esempio l’1 e il 2 della famiglia A, che hanno delle bande in comune o comunque

segnali alla stessa altezza, e questo è vero anche per il 4. Oppure per una banda è vero per tutti gli individui

dal 2 al 6.

Ogni individuo porta multiple inserzioni e questo è stato voluto per aumentare la efficienza della

mutagenesi, per ottenere individui con multiple inserzioni. Con questa caratterizzazione hanno potuto

identificare gli individui che ne avessero la maggior parte ma differenti.

Con questi individui hanno creato dei pool di F2. Cosa vuol dire individui con multiple inserzioni differenti

tra loro? Per esempio ad ogni banda diversa diamo una lettera (a, b, c, d ecc.). Hanno caratterizzato gli F1

della famiglia 1 e gli F1 della famiglia 2 scegliendo all’interno dell’F1 individui che avessero più inserzioni

possibili differenti tra loro, così come per la famiglia 1 e per la famiglia 2. Questi individui derivati dalla

famiglia 1 e dalla famiglia 2 sono derivati da mutagenesi indipendente, quindi è molto probabile che

portino eventi differenti. Hanno scelto individui della famiglia 1 e individui della famiglia 2 e hanno

incrociato individui F1 di una famiglia con individui F1 dell’altra. Ma singole coppie: singoli individui di una

famiglia incrociati con singoli individui dell’altra. Le lettere sono le diverse bande: per esempio un individuo

porta bande chiamate ABCDE, l’altro porta bande chiamate FGHIJ. Questi sono individui F1 eterozigoti. Li

hanno incrociati creando da coppie singoli differenti composte da individui di due famiglie dei pool di F2.

Sono individui eterozigoti ognuno x set differenti: incrociandoli tra loro creo un pool di individui F2 che

porteranno varie combinazioni delle inserzioni trasmesse dal padre o dalla madre. Avrò maschie femmine

che recano in maniera combinatoriale inserzioni diverse da padre e dalla madre. Nel pool generato e quindi

derivato da due famiglie diverse, avrò maschi e femmine che recano in maniera combinatoriale assetti

diversi, combinazioni diverse delle inserzioni contribuite o dalla madre o dal padre. I vari pool F2 non li

hanno ulteriormente caratterizzati ma li hanno generati su base statistica.

Da ogni pool hanno prelevato coppie di individui: per ogni pool di F2 hanno analizzato la progenie di

almeno sei coppie singole. Non sapevano quali combinazioni degli inserti caratterizzati in F1 erano

provocati dai componenti di ciascuna coppia, però sostanzialmente calcolano che l’analisi della progenie di

almeno sei coppie di individui di F2 dovrebbe portare ad osservare in F3 la omozigosi di tutti gli inserti

caratterizzati nei capostipiti F1 del pool di F2. Per esempio vediamo un elemento della coppia che porta

l’inserto BEG, l’altro elemento porta BCEFIJ: nella progenie di questa coppia vanno in omozigosi gli inserti B

ed E. Sono combinazioni di inserti che sono una miscela degli inserti portati da un genitore o dall’altro di F1.

Ad esempio un individuo della coppia ha BCEHI, l’altro ha AFGHI, abbiamo la probabilità di avere omoziogsi

di H e I. loro in realtà però a priori non sanno quali inserti hanno questi elementi della coppia. Prendono 6

coppie, le fanno accoppiare, producono la progenie F3 e poi sostanzialmente si fanno guidare dal fenotipo:

cercano nella progenie di almeno sei coppie di individui F2 se trovano dei fenotipi. Se li trovano in che

proporzione? Sono a carico di circa il 25% della progenie.

Questo lo fanno per almeno sei coppie di ciascun pool di F2 che deriva dalla caratterizzazione di individui di

due famiglie diverse.

Ricapitolazione:

produco famiglie indipendenti e caratterizzo la F1 di ciascuna delle famiglie: caratterizzazione quantitativa

per numero delle inserzioni attraverso Real-time PCR e caratterizzazione qualitativa attraverso Southern

blot e ibridazione con una sonda che riconosce il vettore. Attraverso il Southern scelgono per ogni famiglia

gli individui di F1 recanti il maggior numero possibili di inserzioni differenti. Dopodiché per massimizzare il

numero di inserzioni che porteranno in F3 eventuale omozigosi di inserzioni che provocano fenotipo, fanno

pool di F2 incrociando individui F1 caratterizzati di una famiglia e individui F1 caratterizzati di una seconda

famiglia. A questo punto si creano pool di F2 derivati da due famiglie in cui segregano ancora in eterozigosi

le varie inserzioni presenti nei due parentali di F1 che hanno generato il pool di F2. Qui avremo

segregazione indipendente dei vari cromosomi e quindi individui F2 recheranno varie combinazioni

statisticamente determinate, quindi casuali che dipendono dalla loro associazione con un particolare

cromosoma. Senza caratterizzare molecolarmente gli F2, considerano che statisticamente, analizzando un

certo numero di incroci tra individui F2 eterozigoti per le varie combinazioni, dovrebbero segregare in F3 la

omozigosi della maggior parte delle inserzioni caratterizzate.

È qui che devono identificare la inserzione di interesse, legata alla osservazione di un fenotipo. Come nello

screen con mutageni alchilanti, vanno a seguire la progenie F3 data dagli incroci F2 per cercare fenotipi.

In realtà hanno cercato sia fenotipi di tipo morfologico (un esempio è legato a condizioni di aumento delle

dimensioni di Zebrafish), ma anche altri fenotipi, addirittura fenotipi comportamentali, cioè la reazione dei

pesci a vibrazioni nell’acqua. Producevano nelle vasche vibrazioni con un oggetto: la linea laterale è

l’organo che percorre antero-posteriormente i fianchi dell’adulto e gli consente di percepire corrente di

acqua. Cercavano perciò mutanti capaci di reagire alle correnti dell’acqua in modo tale da poter studiare

questo organo sensoriale.

Identificati eventuali fenotipi, ovviamente il problema è riuscire a discriminare quale delle inserzioni può

essere associata al fenotipo. A questo punto è necessario caratterizzare molecolarmente sia gli individui F3

col fenotipo, individui F3 che non presentano fenotipo e poi ovviamente i due genitori. Questo non richiede

in Zebrafish il sacrificio dell’animale, perché è possibile fare delle piccole biopsie delle pinne che sono in

grado di rigenerare e non sono invasive.

Quali fenotipi vanno a cercare? Se immaginiamo che sia la inserzione D a dare fenotipo nell’incrocio tra

individui F2 in che proporzioni ci aspettiamo la comparsa del fenotipo? Nel 25%: il fenotipo deve essere

ripetuto, stando attenti ala possibilità che esistano a penetranza incompleta o ad espressività variabile.

Vista la ripetizione del fenotipo, a quel punto la caratterizzazione degli individui col fenotipo, dei fratelli

senza fenotipo: se per l’inserzione ci aspettiamo una omozigosi del 25%, ci aspettiamo anche una

eterozigosi o la assenza del fenotipo nel 25% della progenie.

In più la caratterizzazione eventuale di altre famiglie che non hanno questo impatto da fenotipo. Viene

fatto come controllo.

Questi sono i criteri con cui almeno a prima istanza è possibile associare il fenotipo a una particolare

inserzione. Ovviamente la inserzione deve essere presente in entrambi i genitori degli incroci nella cui

progenie compare il fenotipo. Se eventualmente il fenotipo comparisse in più di una progenie, cioè in più di

un incrocio tra F2, derivanti questi F2 tutti dal medesimo pool di F2 che deriva da due genitori.

Quindi la inserzione deve essere condivisa da entrambi i genitori dell’incrocio F2 nella cui progenie

• F3 compare il fenotipo.

Deve essere al massimo presente in uno solo dei due genitori (o in nessuno) in una famiglia in cui il

• fenotipo non compare

Ovviamente la stessa banda deve essere presente in tutti gli individui che hanno fenotipo

• Le bande non correlate al fenotipo potranno essere presenti al massimo in ¾ degli individui F3 non

• presentanti il fenotipo

Identificata una potenziale banda la caratterizzazione va ripetuta e, se possibile, si incrociano individui con

fenotipo altrimenti se questo non è possibile (hanno per esempio fenotipo troppo pesante e non sono in

grado di accoppiarsi) si può risale ai genitori di F2. Questi sono eterozigoti e possono essere esincrociati,

cioè incrociati per individui selvatici; sappiamo che entrambi i genitori hanno la banda che determina il

fenotipo. Eterozigoti incrociati per un individuo selvatico mi dà un F1 di eterozigoti maschi e femmine, che

inincrociati tra loro mi devono segregare di nuovo il fenotipo nel 25%. Questo è ciò che si indica come

breeding true, cioè una reale segregazione del fenotipo. Andiamo di nuovo a caratterizzare molecolarmente

mediante Southern. Questo ha un altro vantaggio: gli individui di F2 che recano la inserzione recheranno

anche altre inserzioni. Per esempio proprio nel caso di questo incrocio sono almeno due le inserzioni

presenti in entrambi i genitori che quindi potenzialmente vanno in omozigosi nell’F3. Se noi esisncrociamo

a quel punto si ha una segregazione indipendente. Quindi è molto probabile che nella progenie di F2 i due

esincroci, tra loro indipendenti perché i due genitori segregheranno in maniera differente, è possibile che

nella F2 degli incroci di controllo in realtà solo una delle due inserzioni (la B o la E) segrighino in maniera

coerente al fenotipo.

Quindi sostanzialmente la analisi secondaria oltre che confermativa consente anche di ripulire il genoma

della progenie arrivando nella condizione ideale di avere solo una mutazione. Se ne abbiamo due associate

le cose si complicano. Però non usiamo bilanciatori quindi a meno che non siano strettamente associate

(statisticamente poco probabile) è ovvio che potranno separarsi x ricombinazione e comunque segregare e

allontanarsi e non essere associate più al medesimo cromosoma.

Il discorso è riuscire a lavorare nonostante la assenza di marcatori e quindi massimizzando la identificazione

di inserzioni interessanti.

In genere si procede considerando più di una inserzione tra le candidate che alla prima verifica incontrano i

criteri che l’inserzione “buona” deve soddisfare. Mediante inverse-PCR (simile a quanto visto per il

clonaggio di sequenza fiancheggianti di trasposoni in Drosophila) sul DNA genomico dei genitori o degli

stessi individui mutanti sarà possibile amplificare e isolare DNA fiancheggiante l’inserzione del vettore

retrovirale e risalire alla regione genomica e al gene mutato per inserzione.

Uno dei fenotipi identificati è una classe di animali con “epatomegalia”, cioè ingrossamento del fegato. È

possibile confermare la osservazione morfologica in campo chiaro usando una sonda molecolare. Siccome il

fegato ma anche il tratto gastro-intestinale sono ricchi di biotina è possibile marcare gli animali con

streptavidina che ha forte affinità per la biotina. Si può marcare specificamente il fegato e confermare

l’osservazione morfologica. Hanno trovato vari mutanti:

in particolare il mutante di un gene che han chiamato vps-18 di interesse perché è una molecola

• necessaria al traffico delle vescicole endosomali degli epatociti, in particolare molecole dirette agli

organelli acidi degli epatociti. L’interesse è legato al fatto che questo si è dimostrato un buon

modello per una malattia umana che è la sindrome di ARC (arthrogryposis-renal dysfunction-

cholestasis syndrome) associata alla mutazione di un gene umano vps33B che non è omologo di

vps-18 ma che funziona nel medesimo complesso proteico

!da

foie gras (fgr) una sindrome simile alla sindrome da fegato grasso che è un accumulo anomalo

• di grasso nel fegato !

nf2 (neurofibromatosis 2) omologo a nf2 dell’uomo che è un tumor soppressor la cui mutazione

• è associata nell’uomo a problemi di secrezione della bile legati alla formazione di cisti all’interno del

coledoco posteriore (dotto di secrezione della bile)

In questo genere di screening si cercano prevalentemente fenotipi che possano in qualche modo essere

correlati a malattie umane x trovare dei modelli adeguati da usare per lo studio del meccanismo molecolare

che provoca la malattia, e quindi potenzialmente la identificazione di nuovi target farmacologici, o

eventualmente se esistessero già farmaci per queste malattie umane, è possibile effettuare test degli stessi

farmaci e dei nuovi farmaci su questi modelli.

Mutagenesi inserzionale mediata da trasposoni

In Zebrafish negli ultimi anni è stata sviluppata anche un’altra tecnica di mutagenesi inserzionale mediata

da trasposoni. Memori dell’esperienza fatta in Drosophila e in C. elegans si è cercato di adattare un

trasposone non residente. Il trasposone, che è stato usato nel lavoro pilota del 2006, può essere vettore di

mutagenesi e anche vettore di transgenesi, ed è l’elemento che si chiama Tol2. È stato identificato in un

pesce che è la specie giapponese “medaka”. Tol veniva dal fatto che è stata identificata una linea di pesci

“medaka” che avevano una mutazione in un gene che codifica x la tirosinasi.

Questo elemento è stato clonato e sequenziato e è stata osservata la potenziale presenza di una ORF

dentro al trasposone. È un trasposone a DNA ed è stato ingegnerizzato, cioè è stato creato un vettore

sintetico privo di tutte le sequenze del trasposone originale tranne le inverted repeat originali in modo tale

da creare un trasposone non autonomo.

Il primo vettore creato è un vettore per il gene trapping. Nel caso dell’enhancer trapping abbiamo un gene

reporter (LacZ, GFP) che è sotto controllo di un promotore basale e il gene reporter si esprime solo quando

il vettore si va a integrare in una regione ad attiva trascrizione, quindi è trascritto sotto il controllo di

enhancer o regioni promotrici o regolatrici della espressione genica che siano nelle vicinanze. Nel caso del

gene trapping invece la espressione del gene reporter è legata al fatto che si sia integrato all’interno di un

gene nel senso di unità trascrizionale. Di fatto non ha promotore basale ma il gene reporter che in questo

caso è la GFT ha un sito accettore di splicing.

A .Le parti terminali sono rosse e sono le IR o comunque le sequenze del trasposone necessarie in cis per la

sua mobilizzazione, cioè necessarie per il riconoscimento da parte dell’enzima che ne media la integrazione

o la mobilizzazione.

Per essere sicuri di non avere attivazione trascrizionale spuria del recettore da parte delle sequenze del

!

vettore hanno clonato il reporter con un orientamento invertito 5’ 3’ rispetto alle sequenze del vettore

(normalmente mettiamo il 5’ a sinistra e il 3’ a destra). Questo perché se le IR sono in grado di mediare in

qualche modo la attivazione trascrizionale, noi vogliamo ridurre il più possibile la attivazione trascrizionale

del reporter dovuta alle regioni terminali del trasposone piuttosto che per il fatto che il trasposone si è

integrato effettivamente dentro un gene.

!

B. Box azzurre indicano gli esoni.

Se immaginiamo che il vettore si inserisca all’interno della regione trascritta, questo può avvenire a monte

o a valle dell’ATG del gene endogeno. In entrambi i casi se la integrazione avviene a monte dell’esone in cui

è presente l’ATG endogeno comunque questa è una regione trascritta. Quindi avverrà possibile splicing tra

esone 1 e il sito accettore di splicing posto a monte dell’ATG dell’ATG della GFP. Viene prodotto un

trascritto che codifica per la GFP e poi ci sarà un trascritto maturo che codifica per la proteina endogena.

Viceversa se la integrazione del trasposone avviene a valle dell’ATG endogeno il codice della GFP (il

trascritto) viene inserito all’interno del trascritto maturo creando una proteina chimerica che contiene

anche la GFP.

In questo studio pilota ciò che gli autori hanno cercato non sono fenotipi ma sono pathway di espressione

della GFP che potessero essere di loro interesse. Pensando che ovviamente un gene espresso in una

determinata struttura probabilmente è necessario al qualche processo biologico legato a quella struttura.

Perché un trascritto abbia una stabilità è necessario che sia poliadenilato per cui quello che si fa i tutti i

vettori di espressione è che o si è sicuri di conoscere il dito di poliadenilazione del gene, allora lo si clona

dentro al vettore, oppure si può fare che il sito di clonaggio è situato a monte di un segnale di

poliadenilazione e il più usato è quello che deriva dal virus SV40.

Come hanno dimostrato che c’è escissione del trasposone dal vettore che loro iniettano all’interno della

cellula uovo fecondata? Non è più un virus capace di infettare le cellule, dobbiamo iniettarlo all’interno

della cellula e quello che si fa è di iniettare la cellula uovo fecondata o i primi blastomeri perché sono

grandi.

La prima cosa che hanno fatto è stato creare un vettore che mantenesse solo le sequenze necessarie in cis

ma non avesse più quelle necessarie in trans codificanti la trasposasi. Quelle rosse sono le sequenze

terminali del trasposone. Hanno coiniettato un plasmide in cui c’era il vettore con il trascritto ottenuto in

vitro partendo dal trasposone naturale. Se la sequenza trascritta dal trasposone codifica x la trasposasi, la

coiniezione del vettore (che è privo di trasposasi) con il trascritto per la trasposasi dovrebbe generare la

mobilizzazione del trasposone.

Loro guardano questo con un test abbastanza semplice, e cioè utilizzando una analisi per PCR con due

coppie di primer che riconoscono le sequenze del plasmide ai lati del vettore. Di conseguenza se facciamo

la PCR in condizioni tali da amplificare solo frammenti molto piccoli, la amplificazione funziona solo se non

c’è più il vettore tra i due primer. Quindi fanno coiniezione in un certo numero di uova e in un certo

numero di uova invece iniettano solo il vettore senza il trascritto. La PCR derivata dagli individui coiniettati:

abbiamo un segnale perchè di fatto la reazione di escissione porta la richiusura del plasmide e quindi i due

primer nelle condizioni di PCR sono in grado di amplificare poche centinaia di basi. Viceversa negli individui

in cui è stato iniettato solo il vettore, siccome questo reca ancora il trasposone, in condizioni di PCR non

riusciamo ad amplificare nulla perché i due primer sono distanti.

Quindi avviene iniezione del vettore più il trascritto della trasposasi, ottenimento di individui fondatori di

famiglie chimerici esicrociati per individui selvatici: generano una F1 di cui dovrebbero far parte se la

inserzione è avvenuta e se è avvenuta all’interno di una regione trascritta dovrebbe creare individui F1

alcuni dei quali presentano la espressione della GFP.

Sono fotografati al microscopio a fluorescenza degli individui durante lo sviluppo presi lateralmente in cui la

GFP marca il SNC. Da una parte dell’ectoderma che prende il nome di neuroectoderma si sollevano due

cercini neurali cioè due creste di cellule che si chiudono (fondono) dorsalmente creando un canale. È il

primordio del canale del midollo spinale e dei ventricoli cerebrali all’interno della parte cranica. È il tubo

neurale che è il primordio del sistema nervoso centrale si differenzierà.

Come identificare il gene interrotto dal trasposone? Sarebbe possibile fare una PCR ma qui la maggiore

conferma che il gene che andiamo a identificare è proprio quello che trascrive la GFP si ha con un

esperimento di 5’RACE. Amplificazione rapida dell’estremità 5’ di un cDNA.

Questo approccio è più sicuro con questo tipo di vettore perché infatti io parto dai cDNA, o comunque dai

trascritti degli animali che dovrebbero avere integrazione, non dal DNA genomico. Si estraggono dagli

animali che dovrebbero recare la inserzione i messaggeri poliadenilati e si fa il primo filamento di cDNA

usando un random primer (in questa slide), nel nostro caso possiamo usare un primer gene-specifico cioè

un primer x la GFP. Il trascritto che si produce se il codice della GFP è inserito dentro un gene endogeno,

dentro al trascritto ci dovrà essere il codice della GFP che noi conosciamo. Possiamo quindi disegnare un

primer specifico per la GFP come primer reverse. A questo punto con una reazione di retrotrascrizione

amplifichiamo la estremità 5’ del trascritto in cui il codice della GFP. A quel punto dobbiamo produrre il

secondo filamento di DNA: un modo è quello di portare al 5’ del primo filamento di cDNA una coda

polinucleotidica (es. poliC) con l’enzima terminal transferasi che in determinate condizioni crea una coda di

policitosina al 5’ del primo filamento di cDNA. Questo può appaiare con primer foreward che abbia una

coda al suo 3’ di poliG più altre sequenze che noi conosciamo per avere appaiamento specifico. Possiamo

quindi creare il secondo filamento di DNA, fare PCR usando questo primer e lo stesso primer che abbiamo

usato x la creazione del primo filamento.

A questo punto abbiamo amplificato la porzione 5’ del trascritto endogeno. Se il trasposone si è integrato a

monte dell’ATG del gene endogeno troviamo le sequenze di un esone. Se invece il trasposone si è integrato

in un esone a valle dell’ATG del gene endogeno troviamo il trascritto codificante la proteina del gene

endogeno.

Analisi semiquantitativa di RT-PCR per cercare di capire se la presenza del trasposone è in grado di produrre

mutanti.

Analisi di espressione per RT-PCR condotta su RNA totale da embrioni WT, eterozigoti ed omozigoti per

l’inserzione evidenzia un progressivo calo del trascritto che è praticamente assente negli embrioni

omozigoti. Questo indica che potenzialmente le inserzioni del vettore T2KSAG possono interferire con

l’espressione del trascritto “intrappolato” producendo mutanti per inserzione.

Conoscono il trascritto del gene in cui il trasposone si è integrato, fanno una analisi RT-PCR sul trascritto di

questo gene che si chiama KAB e vanno a guardare il trascritto in animali selvatici, eterozigoti e omozigoti

per la mutazione, confrontandolo con un gene non mutato (EF1alfa). Osservano che effettivamente c’è un

calo di produzione del trascritto quindi possono concludere che potenzialmente il vettore quando integrato

è in grado di interferire con la produzione del trascritto endogeno quindi può creare perdita di funzione).

Incrocio tra individui eterozigoti ha messo in evidenza che gli omozigoti sono vitali, nascono nella

percentuale attesa e sono fertili, indicazione del fatto che il gene intrappolato non è un gene essenziale ma

potrebbe determinare un fenotipo mutante vitale molto debole che solo un’analisi più dettagliata potrà

chiarire. LIMITAZIONI imposte dagli screen genetici diretti

Ora che conosciamo la sequenza genomica di un certo numero di organismi siamo consapevoli che

• la complessità genetica potrebbe rendere molte mutazioni non rilevabili in un classico screen

basato sul fenotipo.

Le dimensioni limitate di molti geni (es: geni per sintesi di miRNA) li rendono bersagli troppo piccoli

• per i mutageni chimici da rendere infattibile la realizzazione di screen sufficientemente ampi da

permettere l’isolamento di alleli mutanti di geni di dimensioni limitate.

Fenotipi rari o mutazioni rare che producano un determinato fenotipo di interesse possono non

• essere trovati semplicemente a causa del vasto numero di genomi potenzialmente mutanti che è

necessario analizzare nello screen.

Le tecniche di genetica inversa(Gene targeting, RNAi, trattamento con oligo antisenso

• stabilizzati/morfolinooligo…) forniscono un’alternativa in molti sistemi, ma negli ultimissimi anni

una nuova strategia è stata messa a punto in Arabidopsis thaliana e comincia ad essere esportata in

altri organismi modello come zebrafish.

Ci sono una serie di tecniche che ci consentono di produrre fenotipi (RNA

interference, utilizzo di oligonicleotidi antisenso), ma in ogni caso parliamo di

fenocopie e comunque non mutazioni puntiforme. È possibile gene targeting, non

è possibile in tutte le specie per esempio in Zebrafish non si è riusciti ad applicarlo

ancora. Può essere una tecnica utile se conosciamo già il gene. In Drosophila si fa

un gene targeting poco efficiente (si ottengono sostituzioni alleliche con bassa

frequenze). In Zebrafishn non si fa, e x questo x aumentare efficienza di

mutagenesi con agenti alchilanti è stata adattata a Zebrafish una tecnica fatta in

Arabidopsis Thaliana, che è il modello genetico angiosperma.

TILLING

Questa tecnica si chiama TILLING (Targeting Induced local lesion in the genome). Si

basa sulla possibilità di riconoscere molecole in cui sia presenta anche il

misappaiamento di una singola base. Hanno usato questa tecnica basandosi sulla

applicazione delle piattaforme illumina (in un articolo di pochi giorni fa) cioè

piattaforme altamente automatizzate di deep sequencing.

Questa tecnica si basa su una mutagenesi alchilante generale, però accoppiata ad

una tecnica che consente di screenare a priori gli animali con mutazioni nel gene di

interesse. È quindi anche questa una tecnica di tipo post-genomico o quantomeno

una tecnica che si può applicare su larga scala, anche su un numero piuttosto

elevato di individui, per poter trovare però mutazioni del gene che vogliamo.

Quindi dobbiamo già conoscere il gene bersaglio che vogliamo mutare. Può essere

quello che codifica x un miRNA. Si basa sulla possibilità di riconoscere molecole ibride, una selvatica e una

mutata, che abbiamo anche un solo nucleotide di differenza.

Quindi mutagenesi alchilante per esempio dei maschi incrociati per femmine selvatiche: generiamo un pool

di individui F1 potenzialmente recanti mutazioni in eterozigosi. A quel punto si estrae il DNA da singoli

individui di F1; era già pensata per una automazione ed essere applicata su larga scala. Si estrae il DNA da

singoli individui di F1 e lo si amplifica con coppie di primer marcate differenzialmente con fluorocromi

diversi al loro 5’. Per più geni bersaglio del nostro esperimento è possibile negli individui eterozigoti ci sia

un allele selvatico e un allele mutato. Usiamo coppie di primer (un foreward e un reverse x ogni esone)

marcati con colori diversi (verde e rosso) mediante fluorescenza. A quel punto nella PCR generiamo

l’amplificato dell’allele selvatico e dell’allele mutato. Li denaturiamo e facciamo riannealare.

Noi partiamo dall’amplificato del gene selvatico e dall’amplificato del gene mutante potenzialmente

mutato per una sostituzione nucleotidica. Quando li facciamo riannealare a temperatura ambiente: la

temperatura si abbassa abbastanza lentamente da generare più possibili doppi filamenti che le molecole

che abbiamo amplificato possono dare, cioè doppi filamenti selvatici, doppi filamenti mutanti e un

eteroduplex. Il misappaiamento può essere riconosciuto da un enzima che si chiama CEL-I. E’ una

endonucleasi trovata nel sedano che è capace di tagliare le molecole di DNA duplex a livello del

misappaiamento. Alcune molecole tagliate su un filamento e alcune verranno tagliate sull’altro. Se

denaturiamo di nuovo a questo punto nella miscela di reazione avremo molecole marcate di dimensioni più

corte dell’amplificato di partenza e se queste si generano sono dovute al taglio della endonucleasi, cioè

derivano da un eteroduplex tra sequenza selvatica e sequenza mutata dove è presente un misappaiamento.

Se facciamo correre su un gel denaturante di acrilammide verticale e sottile possiamo con questi separare

molecole con la differenza di un nt anche (in condizioni denaturanti). Si separano x dimensione. Ogni lane è

un individuo diverso/amplificato diverso. Se in un pool di individui ce n’è almeno uno con mutazione, il

prodotto che corriamo sarà arricchito di questo molecole e quindi nel gel abbiamo delle zone (ingrandite)

dove c’è accumulo in eccesso di prodotto che è il singolo filamento di dimensioni più corte dell’amplificato

iniziale. I segnali veri devono rispettare una condizione: ci aspettiamo che in un canale ci siano due

accumuli, uno marcato da un fluorocromo e uno marcato dall’altro. La somma della dimensione di un

frammento e dell’altro deve fare la dimensione del prodotto che abbiamo amplificato in PCR. Se abbiamo

varie mutazioni dentro lo stesso gene in punti differenti, il prodotto amplificato è lo stesso, la somma dei

vari frammenti deve essere sempre costante.

È stato già pensato come approccio appunto da applicare su larga scala. In effetti lo schema

dell’esperimento si è basato sulla creazione di una enorme libreria di animali F1 derivati dall’incrocio tra

individui mutagenizzati x individui selvatici e la creazione di 384 pool di DNA derivato da 12 individui

ciascuno. DNA estratto, finclips = biopsia. 384 perché i sistemi di automazione si basano su piastre da 384

pozzetti. Questo screen perciò ha analizzato questi 384 pool facendo addirittura una PCR nested (annidata).

Il problema di questa tecnica è che gestendo grandi numeri dobbiamo mantenere oppure congelare

qualcosa di quegli animali: nel caso di Zebrafish si possono congelare gli spermatozoi. Bisogna recuperare il

genitore F1 che reca la mutazione.

Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster è un dittero. È un insetto e quindi ha un corpo diviso in testa, torace e addome.

Ogni metamero porta organi sensoriali che sono i peli. Si nutre di frutta (moscerini della frutta).

I metameri toracici sviluppano appendici dorsali e appendici ventrali. In realtà il primo metamero toracico

(T1) ha solo le appendici ventrali, cioè il primo paio di zampe, che sono presenti anche negli altri due

metameri, e il T2 e T3 sviluppano appendici dorsali, che sono le ali e i bilanceri.

La testa contiene occhio, palpi mascellari, antenne: sono tutte caratteristiche morfologiche che funzionano

attraverso uno strettissimo controllo di percezione sensoriale e di trasmissione neuromuscolare.

La potenza di Drosophila è stata generata un po’ dal caso. Il primo mutante isolato x caso è white (occhio

bianco). Da lì è partito il successo di Drosophila che va dall’inizio del secolo scorso. Il suo ciclo vitale è

abbastanza breve (10 giorni a 25 gradi), è molto più di C. elegans, però un insetto è molto più complesso

dal pdv morfologico e comportamentale di un Nematode. Unisce una serie di caratteristiche che lo rendono

un modello eccellente. Inizialmente si sono fatti screen alla ricerca di geni che hanno un ruolo morfologico

(geni che regolano lo sviluppo), tra cui ci sono una quantità spaventosa di geni la cui funzione è conservata.

È un animale segmentato come il mammifero: per sviluppare questo corpo è necessario codificare

molecolarmente il quadro di espressione genica di ciascun metamero, che è quello che succede in un

mammifero. Tantissimi geni che regolano lo sviluppo di Drosophila regolano anche lo sviluppo dei

mammiferi per cui diventa veramente un sistema modello ortologo dell’uomo. Possiamo studiare infatti

funzioni che sono conservate, benché la conservazione a livello aminoacidico della proteina magari non va

oltre il 50%, ma questo 50% di similitudine si trova sui domini funzionalmente importanti. È ovvio che poi

l’uomo è molto più complesso di un insetto, ma questo non va sottovalutato. Gli insetti hanno per esempio

un loro comportamento stereotipato: questo animale infatti è stato usato x screen genetici alla ricerca di

funzioni complesse (apprendimento, memoria a breve termine, memoria a lungo termine), screen volti alla

ricerca per esempio dei geni che hanno a che fare con la drug addiction (assuefazione alle sostanze da

tossicodipendenza) e sono state trovate tra quelle isolate in Drosophila funzioni che hanno un ruolo

significativo anche nell’uomo.

I sistemi modello sono filtri propedeutici a una ricerca più vicina all’uomo. Drosophila e C. elegans sono gli

organismi su cui testare il maggior numero di eventi possibili. Il modello più vicino all’uomo è il topo, ma

non è possibile sempre fare screen sul topo: il livello di complessità è tale per cui andiamo a fare degli

screen mirati, con questo sistema invece possiamo fare uno screen unbias, possiamo non sapere tante cose

e quindi siamo costretti a guardare un grande numero di eventi.

Primo sistema modello genetico eucariotico soprattutto perché hanno isolato una serie di mutazioni che

davano fenotipi osservabili. Il fatto di avere cominciato a selezionare dei marcatori morfologici ha fatto di

Drosophila il sistema più utilizzato proprio nel momento in cui nel secolo scorso si cercavano di

comprendere i meccanismi dell’ereditarietà, ben prima di scoprire che la base molecolare dell’ereditarietà

è il DNA. L’avere scoperto dei marcatori morfologici consentiva ai ricercatori di correlare le modalità

dell’ereditarietà di questi marcatori con il comportamento dei cromosomi e quindi dei meccanismi meiotici

ecc.

Drosophila è stata ad esempio anche uno dei sistemi usato da Benzer per dimostrare che la unità di

ricombinazione è il nucleotide, cioè che esiste la ricombinazione intragenica (l’altro sistema che lo dimostra

è il fago lambda). Fu usata Drosophila sfruttando la possibilità di fare avvenire ricombinazione tra due

cromosomi, uno dei quali recante una mutazione differente nello stesso locus, e ottenere come prodotto

un cromosoma doppio mutante e un cromosoma selvatico. La possibilità di evidenziare una ricombinazione

all’interno del medesimo locus dipende dal gioco di marcatori che possiamo usare. Questo locus usato da

Benzer codifica per la xantindeidrogenasi, uno degli enzimi necessari perché si formi il pigmento oculare;

questo locus di Drosophila si chiama rosy, perché i mutanti hanno colore dell’occhio particolare. Benzer

sfruttò il fatto che mutanti o selvatici per questo locus sono diversamente sensibili ad agente tossico che è

la genticina (antibiotico eucariotico), che viene degradata dalla xantindeidrogenasi: i mutanti sono sensibili,

i selvatici no.

Drosophila è stata usata anche x i geni heat-shock, che sono in gran parte chaperonine cioè proteine

necessarie x assistere il folding di altre proteine. Sono dei geni che vengono attivati dallo shock termico: fu

un ricercatore italiano che scoprì che esistevano dei geni inducibili al calore. Scoprirlo fu possibile per una

caratteristica di Drosophila che vedremo.

Drosophila ha 4 cromosomi, due cromosomi sessuali e tre autosomi. La determinazione del sesso: il sesso

omogametico è il sesso femminile (XX) , il sesso eterogametico è quello maschile (XY).

È stato l’organismo pilota per la messa a punto delle tecniche di sequeziamento genomico. Nella seconda

metà degli anni ’90 lavoravano due grandi consorzi, uno pubblico e uno privato. Quello privato ha usato il

sequenziamento del genoma di Drosophila come sistema pilota x la messa a punto della tecnica di

sequenziamento. C’era anche un consorzio pubblico che invece stava da molti anni sequenziando il genoma

usando delle collezioni di cloni overlappanti, e sequenziando clone per clone stava procedendo verso il

sequenziamento dell’intero genoma.

Drosophila ha un genoma abbastanza piccolo di 180 megabasi, molto compatto, ci sono poche sequenze

intergeniche, c’è poca ridondanza genica. Questo è un vantaggio perché la mutazione in un gene

immediatamente mi dà un fenotipo: c’è la minima probabilità che un altro gene sia ridondante e mi cali la

funzione del gene.

È un sistema relativamente facile da manipolare geneticamente, ma in realtà tutta la quantità di

informazioni di genetica formale di marcatori ma anche di genetica molecolare l’hanno reso un sistema

estremamente versatile. Sono possibili una grande quantità di approcci e quindi è diventato uno dei sistemi

per studiare geni che nell’uomo sono coinvolti in malattie e tumori: primo perché moltissimi geni umani

coinvolti in malattie hanno un ortologo in Drosophila (ortologo quando hanno la stessa funzione) oppure

hanno omologhi in Drosophila (ha la stessa sequenza ma ha un’altra funzione). Significa comunque poter

studiare e dissezionare la funzione molecolare del gene di Drosophila nel contesto della funzione che

questo gene svolge in Drosophila, per inferire delle informazioni che potremmo ricavare con maggiore

difficoltà in un sistema di mammifero. La situazione più estrema è l’uso di Drosophila come una sorta di

provetta in vivo: si lavora con un organismo intero in cui si realizzano tutti i meccanismi che consentono

l’omeostasi/sopravvivenza. Si arriva alla situazione estrema quindi in cui possiamo usare Drosophila come

una sorta di provetta in vivo: si è dimostrata un ottimo sistema di screening molecolare/genetico anche per

studiare malattie alla cui base stanno geni che in Drosophila non esistono. Ad esempio Drosophila è stata

usata per fare screen genetici per cercare geni correlati con malattie come l’Huntinghton o la Atassia

Spinocerebellare. La base molecolare di queste malattie è l’espansione di triplette. In Drosophila non

esistono proteine ortologhe e omologhe però è stato possibile indurre neurodegenerazione esprimendo le

proteine patogene umane, quindi mimando quello che succede nell’uomo ed effettuando su questi animali

screen genetici alla ricerca di intensificatori/soppressori fenotipici, e tra questi si sono trovate una serie di

mutazioni che si sono dimostrate correlate all’evoluzione della malattia. È quindi un sistema estremamente

versatile.

La femmina è leggermente più grande e ha un addome riconoscibile perché ha bande marroncine e nere.

Nel maschio invece la parte terminale dell’addome è completamente nera.

!

Schema del ciclo vitale adulto depone un uovo, si hanno 3 stadi larvali. La larva al terzo stadio dopo circa

3 giorni si impupa e si ha la metamorfosi catastrofica: la larva ha un aspetto completamente diverso da

quello dell’adulto. La larva è apoda e dalla pupa avviene la metamorfosi con istolisi della maggior parte dei

tessuti larvali tranne quelli che formeranno l’adulto e che crescono in particolari strutture durante la vita

larvale. Dopo circa 4 giorni dalla pupa arriva l’adulto. La tempistica del ciclo vitale è stata studiata perché

possiamo usare qualunque stadio e qualunque organo di Drosophila come sistema.

La durata del ciclo vitale dipende dalla temperatura: 22 giorni a 22 gradi, 10 giorni a 25 gradi, 7 giorni a 28

gradi. Si allunga abbassando la temperatura.

Nella linea germinale del maschio non avviene ricombinazione perciò anche se non usiamo cromosomi

bilanciatori nel maschio possiamo mantenere rapporti di associazione tra alleli in cis presenti sullo stesso

cromosoma. Questo è importante per pianificare gli incroci: incroci controllati. Sapendo chi sono i genitori il

gioco dei marcatori ci deve permettere di genotipare la progenie osservando semplicemente

ricombinazione.

Molto popolari sono i marcatori che cambiano il colore dell’occhio: white (occhio bianco). Individuo

selvatico (occhio rosso) e due individui che sono omozigoti mutanti per mutazioni ad effetto recessivo, un

gene che da fenotipo e i mutanti sono stati chiamati cinnabar e brown. La curiosità è che il doppio mutante

di questi due marcatori dà un occhio bianco, non perché viene mutato il locus white, ma perché le vie

biosintetiche dei pigmenti sono più di una e ciascuna delle due mutazioni blocca una via biosintetica.

Quindi di fatto se abbiamo un doppio mutante di questi due geni abbiamo la totale assenza.

Nomenclatur: gene indicato con la lettera minuscola vuol dire che sicuramente il primo allele mutante dà

un fenotipo recessivo. Viceversa un gene con una lettera maiuscola vuol dire che almeno il primo allele

mutante di quel gene dà un effetto dominante. Così è per Curly.

!

Curly le ali sono arricciate e non distese. C’è uno squilibrio dello sviluppo dei due foglietti epiteliali che

formano l’ala: non crescono allo stesso ritmo e di fatto si ripiega l’ala. È un marcatore molto usato perché

questo gene sta sul secondo cromosoma e tutti i cromosomi bilanciatori del secondo cromosoma hanno il

Curly come marcatore dominante.

Drosophila ha una serie di tessuti in particolare le ghiandole salivari.n

queste sono un organo ad alta attività metabolica perché producono in

enorme quantità le proteine “della colla” che sostanzialmente

permettono l’adesione al substrato e altre funzioni. Il fatto di essere un

organo ad altissimo metabolismo, perché questo possa realizzarsi

correttamente c’è un elevatissimo livello di espressione genica che si

traduce nella retro-replicazione dei cromatidi. Vale a dire che abbiamo

più cicli di sintesi del DNA senza segregazione dei cromosomi: i

cromosomi sono formati da centinaia di cromatidi in appaiamento sinaptico e questo fa sì che siano visibili.

Possiamo riconoscere questi cromosomi politenici perché hanno un bandeggio naturale specifico dovuto

alla giustapposizione di regioni omologhe che hanno caratteristiche cromatidiche diverse. Questo

bandeggio però può essere esaltato da coloranti particolari.

L’isolamento di marcatori morfologici ha permesso la messa a punto di tecniche di mappatura genetica

(mappatura per ricombinazione) ma anche la possibilità di osservare facilmente il cromosoma applicando

tecniche di ibridazione in situ DNA-DNA (quella che oggi si chiama FISH) che consentiva di mappare una

determinata sequenza fisicamente, fare una mappa citogenetica. La esistenza di questi cromosomi perciò

ha sostanzialmente permesso di correlare mappatura genetica (posizione genetica dei geni) con la loro

posizione fisica sulla mappa citogenetica. Proprio questi cromosomi hanno permesso a ridosso di scoprire

che esistono geni la cui espressione è indotta dal calore: le zone di intensa trascrizione nei cromosomi

politenici danno luogo a rigonfiamenti della struttura cromosomica. Fondamentalmente sottoponendo a

shock termico (37 gradi) delle larve ed estraendo i cromosomi politenici, era possibile correlare il fatto che

lo shock termico induceva dei path cromosomici in posizioni specifiche. Successivamente si dimostrò che

queste erano zone di intensa trascrizione e più tardi si scoprì che in queste zone c’erano dei geni heat-

shock.

Equivalente di una piastra metafasica: vediamo il cromocentro cioè sostanzialmente un nucleo schiacciato

sul vetrino: si schiaccia sul portaoggetto col coprioggetto e sostanzialmente le cellule si spaccano e dal

nucleo escono questi cromosomi e se siamo abbastanza bravi le braccia cromosomiche si distendono e

allargano quindi riusciamo a riconoscerle in particolare partendo dal telomero: hanno diverse

caratteristiche perciò si riconosce il telomero dopodiché si segue il braccio cromosomico. Si parla di

cromocentro perché siccome in queste cellule non si ha più la segregazione dei cromatidi i centromeri sono

inattivi e associati tra loro: da questo si dipartono 5 braccia cromosomiche (destro e sinistro del secondo

cromosoma, destro e sinistro del terzo cromosoma, e X che è un acrocentrico). Il quarto cromosoma è

puntiforme (non osservabile).

Mappa genetica. Parte telomerica del cromosoma X detto anche primo cromosoma con nomi di geni.

Hanno correlato la posizione genetica alla posizione citologica attraverso ibridazione in situ.

Avere cromosomi cosi grandi consentiva di osservare riarrangiamenti cromosomici: abbiamo una

inversione, l’ordinamento dei geni è invertito per un certo tratto. Se abbiamo una inversione in eterozigosi

nei cromosomi politenici ciò determina la formazione di un’ansa che diventa citologicamente osservabile.

Questo ha consentito di caratterizzare citologicamente una grande quantità di riarrangiamenti cromosomici

(inversioni, duplicazione, delezioni, traslocazioni) e solo dopo il sequenziamento gran parte di queste

delezioni sono state mappate. Linee di animali che recano questi riarrangiamenti sono conservate e

disponibili.

Come appare una delezione. Lo vediamo solo in eterozigosi ovviamente. Se abbiamo un omozigote,

ammesso che sopravviva, l’ansa non si vede.

Come si lavora con Drosophila? Bisogna allevarla in piccole vials di plastica allevate su terreno che è

sostanzialmente una polenta/farina di mais addizionata di zucchero, lievito e agar. Mettiamo gli adulti su

questo terreno e dopo tre giorni si accoppiano, depongono uova, spostiamo gli adulti. Le uova rimangono e

depongono le larve. Sulle pareti del tubo ci sono le larve. Si lavora con microscopi da dissezione.

Ovviamente bisogna addormentare gli animali: una volta si usava l’etere dimetilico, ora si usa la CO2.

Drosophila è il prototipo di un incrocio controllato e

soprattutto dell’utilizzo dei bilanciatori. Sono stati sviluppati

bilanciatori x tutti i cromosomi: sono indicati da una sigla. Tutti

i bilanciatori del primo cromosoma sono chiamati FM +

numero (first multiple a indicare che sono multipli

riarrangiamenti del primo cromosoma), SM (second multiple),

TM (third multiple).

Tutti sono associati ad almeno un marcatore dominante. Per

esempio il marcatore bar che è normalmente associato ai

bilanciatori del primo cromosoma, curly è il bilanciatore il più

frequente del secondo cromosoma e stubble che è il marcatore

più frequente associato al terzo cromosoma. Parte dorsale del

torace dove ci sono delle grandi setole che sono in realtà degli

organi sensoriali, che nel mutante stubble risultano essere piccole e tozze e molto corte.

Tranne per i bilanciatori del primo cromosoma, c’è anche una mutazione letale recessiva perciò gli

omozigoti per il bilanciatore muoiono in genere. Tranne per i bilanciatori del primo cromosoma, se no non

avremmo mai maschi e la cosa non è pratica. Non è pratico non potere fare più incroci in modo tale che il

padre trasmetta il bilanciatore alla progenie. Quindi per il bilanciatore del primo cromosoma si sfrutta la

presenza di mutazioni che determinano sterilità delle femmine per cui di fatto sopravvivono maschi e gli

zigoti per il bilanciatore che sono fertili, sopravvivono le femmine omozigoti per il bilanciatore ma sono

sterili quindi sostanzialmente non contribuiscono alla progenie.

Sono presenti anche marcatori morfologici recessivi ma sono poco usati. La cosa importante è che spesso

questi cromosomi sono stati ingegnerizzati in modo tale che fossero presenti marcatori che consentissero

di genotipare non solo l’adulto, ma anche la progenie e anche negli altri stadi (a stadio di embrione o a

stadio di larva). Nella maggior parte dei casi sono transgeni inseriti sui cromosomi bilanciatori e quindi

replicati assieme ad essi, che determinano la espressione di un gene reporter (che può essere la beta-

galattosidasi rilevabile con un Ab oppure la GFP) sotto controllo di un promotore specifico che si esprime

nell’embrione o nelle larve in tessuti che consentono la genotipizzazione della progenie guardando gli

animali soprattutto nel caso di transgeni con la GFP come reporter. Esistono microscopi a dissezione in cui

possiamo guardare la progenie viva con una fonte UV e quindi vedere quali animali esprimono la GFP e

quali no. Questo consente di lavorare con tutti gli stadi.

Cosa significa poter contare sul fatto che i rapporti di associazione tra marcatori siano mantenuti. Genotipo

di un individuo omozigote per tre mutazioni recessive: cinnabar, brown (che danno insieme occhio bianco)

e speck (che dà una caratteristica osservabile sul torace).

In un ceppo omozigote se nella femmina avviene ricombinazione (i maschi di Drosophila non ricombinano)

non cambia nulla perché le mutazioni sono presenti su entrambi i cromosomi. Cambia se invece abbiamo

una mutazione che non dà un fenotipo visibile per esempio sul gene vasa. Questo gene è stato isolato in

Drosophila negli anni ’80 e da sterilità femminile. Recentemente si è scoperto che è una proteina che ha a

che fare con il pathway dei piwi RNA, perciò il mutante da sterilità. Il fenotipo è la sterilità perciò non è

visibile. Se noi abbiamo due individui eterozigoti per vasa, quindi fertili, questo è il modo in cui in maniera

quasi corretta va indicato il genotipo. Quasi corretta perché di linee dovrebbero essercene di più.

In un cromosoma vas è associato ai marcatori cn e bw, l’altro cromosoma ha tre alleli selvatici. Siccome il

maschio non ricombina trasmette alla progenie o un cromosoma selvatico o un cromosoma con tre

marcatori. La femmina invece ricombina quindi, siccome vas non da fenotipo visibile, se noi possiamo

mantenere questo allele associato a marcatori che diano fenotipo visibile, possiamo stabilire quali sono gli

individui con mutazione vas e quali no, se si mantiene il rapporto di associazione, cosa che in questo caso

non è.

Per cui la femmina eterozigote ricombinerà e genererà cromosoma con mutazione vas ma senza gli alleli cn

e bw, o cromosoma in cui non c’è più vas ma ci sono cn a bw. Per stabilire se una femmina di F1 è sterile o

no dobbiamo saggiare la sua fertilità. Se invece possiamo mantenere il rapporto di associazione possiamo,

guardando la segregazione dei marcatori laterali (in questo caso cn e bw), stabilire se un determinato

individuo è omozigote vas o no.

Se quindi non partiamo da ceppi eterozigoti che però abbiano un cromosoma selvatico dall’altra parte ma

partiamo da individui che abbiano un cromosoma bilanciatore, sia le femmine sia i maschi, a questo punto

nel maschio l’associazione rimane comunque, ma se viene usato il cromosoma bilanciatore con

l’associazione di vasa coi marcatori laterali sn e bw, rimane anche nella femmina. Incrociando femmine e

maschi fatti in questo modo:

Gli individui curly/curly sono ¼ e muoiono

• Gli individui eterozigoti curly vas cn bw/curly vas cn bw sono il 50% della progenie

• ¼ di individui sono omozigoti vas cn bw/vas cn bw

Come li distinguiamo? Abbiamo almeno due modi:

1. i curly/curly li riconosciamo perché hanno l’ala curva. Hanno l’occhio colorato perchè di fatto va in

omozigosi cn perché il bilanciatore curly ha un allele cn e non ha un allele bw

2. i vas cn bw/vas cn bw li riconosciamo perché non hanno il bilanciatore e perciò hanno l’ala distesa,

per di più hanno l’omozigosi dei due marcatori laterali, cn e bw, perciò il loro occhio sarà white

Perciò se noi manteniamo rapporti di associazione tra la mutazione che non ha fenotipo facile da

riconoscere e i marcatori laterali che altro non sono che mutazioni che conferiscono una caratteristica

osservabile, allora guardando la progenie e vedendo individui con occhio bianco e ala stesa siamo sicuri che

quelli sono omozigoti vas.

Questo semplice incrocio ci fa vedere una serie di cose che riguardano l’uso dei bilanciatori. Da una parte

tiene l’associazione tra i marcatori laterali e una mutazione di cui ho un fenotipo non facilmente

osservabile, dall’altra rende conservabile il ceppo con quella mutazione in modo semplice. Questo significa

che se abbiamo un linea con maschi e femmine eterozigoti bilanciati per una mutazione vasa, dalla

segregazione dei cromosomi vediamo che l’unica progenie vitale fertile sia per i maschi che per le femmine

sono gli eterozigoti bilanciati, e sono vitali le femmine e i maschi omozigoti, le femmine sono sterili, i

maschi sono fertili. Possiamo mantenere la linea trasferendo gli animali di una generazione senza

necessariamente doverli selezionare. Ho i genitori, i figli vitali, gli eterozigoti maschi e femmine sono fertili,

degli omozigoti solo i machi sono fertili, tra l’altro questi non ricombinano quindi sostanzialmente non

vengono alterati rapporti di associazione tra la mutazione base e i marcatori e noi riusciamo ad auto

mantenere il ceppo. Il caso estremo è se avessimo una mutazione non come vasa che dà sterilità ma una

mutazione che dà letalità: se avessimo un letale recessivo, allora gli individui muoiono così come moriranno

gli individui omozigoti del bilanciatore. Dati genitori eterozigoti l’unica progenie vitale fertile sono figli

eterozigoti e riusciamo ad auto mantenere la linea.

Questo perché Drosophila è l’unico sistema che NON è crioconservabile. Perciò tutto ciò con cui lavoriamo

dobbiamo conservarlo in vitro. Questo viene anche detto, soprattutto se c’è un letale recessivo, sistema a

letali bilanciati. Dati genitori eterozigoti l’unica progenie vitale sono gli individui eterozigoti identici ai

genitori. Per di più ci consente, guardando sia marcatori recessivi sia marcatori dominanti (oggigiorno si

usano solo questi), di genotipare la progenie.

Anche su Drosophila è stato molto popolare l’uso di mutageni chimici come gli agenti alchilanti. Vedremo

un esempio di mutagenesi classica ad importanza storica. In Drosohpila è stato sviluppato anche il sistema

di mutagenesi inserzionale sfruttando elementi trasponibili.

In particolare è stata sfruttata una famiglia di elementi trasponibili che prende il nome di elemento

trasponibile P o trasposone P.

Schema di un trasposone selvatico. È un trasposone a DNA. Le caratteristiche strutturali e importanti sono

le due ripetizioni invertite terminali dette anche ali di P o P-wings che costituiscono l’unico vero elemento

in cis col trasposone necessario alla sua mobilizzazione. Ciò che meglio catalizzata la mobilizzazione del

trasposone è la proteina trasposasi che viene codificata dal trasposone stesso. Quindi un elemento P

selvatico è quindi un elemento autonomo perché codifica da solo l’enzima necessario per la sua

mobilizzazione. Sulla base della biologia degli elementi P sono stati costruiti il 70-80% dei vettori di

mutagenesi o di transgenesi (non sono necessariamente la stessa cosa) che vengono usati x mutagenizzare

o x fare individui transgenici.

Tra le due ripetizioni terminali invertite c’è la sequenza codificante della trasposasi.

Inizialmente si mobilizzavano degli elementi naturali o degli elementi P naturalmente tronchi. Fare

mutagenesi con questi era estremamente complesso quindi, capito il meccanismo di mobilizzazione, gli

elementi trasponibili sono diventati la base per creare dei vettori ingegnerizzati.

I vettori basati sull’elemento P dell’elemento P naturale contengono solo gli elementi fondamentali in cis

cioè le P-wings, cioè le ripetizioni terminali tra le quali possiamo inserire e clonare ciò che vogliamo. La cosa

più semplice è metterci un marcatore che ci dica se un determinato animale ha o non ha il trasposone, per

esempio il cDNA selvatico del gene white. Se abbiamo un trasposone così fatto all’interno di un animale

mutante white, che avrebbe di per sé l’occhio bianco, la presenza di una copia del gene selvatico (di usa

cDNA, non proprio la sequenza genomica) è sufficiente a complementare almeno parzialmente la mancanza

genomica della funzione white e quindi dà un occhio non proprio rosso ma colorato. Può essere da

arancione a rosso, dipende molto da dove il trasposone è inserito. Non ha sequenze regolative molto

potenti (ha solo sequenza regolative di base) quindi risente molto dell’effetto posizione: se si inserisce in

una regione eucromatica, aperta, altamente espressa, la quantità di prodotto white transgenico è elevata e

quindi l’occhio sarà più colorato, se invece si inserisce in una regione eterocromatica e quindi poco

accessibile viene prodotta meno proteina white e quindi l’occhio sarà meno colorato.

Viceversa si sono preparati anche trasposoni naturali tronchi ovviamente non autonomi: quindi si è messo a

punto un sistema x fornire in trans la trasposasi. Non è un elemento ingegnerizzato ma è stata isolata una

linea di moscerini che hanno un elemento trasponibile P tronco privo di una delle P-wings, ma intatto nella

porzione codificante la trasposasi. Questo elemento è in grado di codificare la trasposasi ma è un elemento

immobile cioè non può mobilizzarsi perché manca di uno degli elementi necessari in cis cioè una delle

repeats.

Qui abbiamo invece due schemi di due differenti vettori da mutagenesi, basati sulla biologia dell’elemento

P. Di fatto sono elementi noti, non codificano la trasposasi, del trasposone P mantengono le P-wings e

all’interno sono state clonati una serie di elementi genetici utili per usarli come vettori di mutagenesi:

!

un marcatore l’elemento P(LacW) contiene mini-white come marcatore, l’elemento P(PZ)

• contiene il cDNA del gene rosy come marcatore. Il primo lo useremo in un background white-, il

secondo lo useremo in un background rosy- e se è presente l’elemento questo complementa il

fenotipo rosy-

tutti e due questi costrutti sono dei costrutti per enhancer trapping (trappola per gli enhancer). Gli

• enhancer sono regioni regolative che possono essere anche distanti dal gene che regolano, qui lo

consideriamo in senso generale, cioè questi construtti sono in grado di intrappolare regioni

regolative avendo al loro interno un gene reporter. Qui in entrambi è LacZ, che è il gene di Coli che

codifica x la beta-galattosidasi, la cui espressione è rilevabile attraverso reazione cromogenica

usando un substrato cromogeno o attraverso Ab. Quindi non possiamo lavorare con animali vivi

perché dobbiamo fissarli e fare la colorazione o la immunoistochimica. Nei vettori più moderni si ha

al posto di LacZ si usa la GFP, RedFP, cioè proteine che danno fluorescenza spontanea anche

nell’animale in vivo. Perché diventano reporter di eventuali enhancer presenti nelle vicinanze?

Sono clonati all’interno di questi vettori con promotore basale ma che non attiva apprezzabilmente

la trascrizione. La espressione di questi reporter è pilotata da sequenze regolative presenti nelle

vicinanze

negli elementi da mutagenesi è presente un altro elemento che era fondamentale nell’era pre-

• genomica, è utile adesso anche se non fondamentale: ori amp, ori kan. Avere una origine di

replicazione batterica nel vettore consentiva in era pre-genomica di clonare dall’animale che recava

l’inserto in una posizione con una tecnica che si chiama “recupero del plasmide” (plasmid rescue) le

sequenze genomiche fiancheggianti l’inserto.

Questo è un possibile modo per fare screening di nuove inserzioni in prossimità di geni espressi in tessuti di

nostro interesse perché siamo nel processo biologico che vogliamo dissezionare (muscoli, sistema nervoso,

cellule germinali ecc). Sono costrutti di mutagenesi.

La biologia dell’elemento P è stata usata anche per creare costrutti di transgenesi, ma le due cose non sono

identiche. Un costrutto di transgenesi di fatto ha le due ali di P, un marcatore, e in più al loro interno hanno

quello che vogliamo screenare (ad es. cDNA di un gene umano).

Il significato generale di un elemento da mutagenesi inserzionale è una sequenza esogena che dentro al

genoma non è presente altrove se non all’interno di quell’elemento da mutagenesi. In alte parole a

differenza della mutagensi chimica, quella inserzionale non produce mutazioni fini: la mutagenesi per

inserzione si ha per inserzione di 3Kb. Non introduciamo una sostituzione nucleotidica, ma andiamo a

spaccare o ad allontanare gli elementi regolativi dal gene, oppure interrompiamo la sequenza codificante

ecc. Sono di fatto mutazioni spesso drastiche. Si va dal non avere alcun fenotipo ad un fenotipo forte a

seconda della posizione in cui l’elemento trasponibile si è inserito all’interno di un determinato gene. Ha un

grande vantaggio che le mutazioni fini non hanno: queste per mapparle dobbiamo fare una mappatura per

ricombinazione o con marcatori molecolari ma è comunque tanto lavoro, però abbiamo mutazioni fini che

ci consentono studi struttura-funzione, trovare alleli soppressori di specifici alleli ecc. Con una mutazione

per inserzione ciò non funziona, però c’è il vantaggio di poter mappare questi elementi più facilmente. Non

produciamo mutazioni fini però riusciamo a mappare facilmente il gene.

TRASPOSIZIONE DELL’ELEMENTO P

Fare mutagenesi inserzionale vuol dire mobilizzare uno o più trasposoni, che sappiamo dove sono, e

cerchiamo nella progenie individui che abbiamo inserzioni altrove. Dobbiamo avere ovviamente i nostri

criteri di selezione cioè avere un obiettivo, ma al di là dell’obiettivo dobbiamo innanzitutto mappare le

nuove inserzioni.

Questo è un esempio di schema: mobilizziamo un elemento trasponibile P(white+), cioè contenente il mini-

white (cDNA del gene white) come marcatore e questo elemento P(w+) è presente sul cromosoma X.

In genere si indicano i tre cromosomi principali, il I o X, il II e il III separati da un ; viceversa una , separa alleli

differenti che sono in cis, cioè sul medesimo cromosoma.

Sono individui omozigoti in questo caso per cui non mettiamo alcuna linea perché i due omologhi sono

identici. Se il marcatore è white+ avremo bisogno di lavorare in un background white- se no non vediamo

se c’è o no. White è un gene dell’X per cui in questo caso la scrittura w senza un apice indica l’allele mutato.

Se vediamo w+ ad esponente vuol dire che è l’allele selvatico, se vediamo w con numerino/sigla/serie di

lettere indicano i diversi alleli white.

I simboli dei geni si indicano in Drosophila in corsivo. Se lo troviamo con la maiuscola non in corsivo quello è

il prodotto genico.

!

Femmine vergini quando nascono le femmine della linea che ci serve noi vogliamo che si accoppino con

un determinato genotipo, non coi fratelli. Le femmine trattengono gli spermatozoi in un ricettacolo una

volta accoppiate e quindi non servono più (si deve aspettare tempo perché si svuotino ma cmq non va

bene) per cui si separano maschi e femmine a poche ore dalla nascita. Ci sono caratteristiche morfologiche

per distinguerle: colore (individui giovano sono bianchi, la pigmentazione avviene dopo), forma

dell’addome ecc. Anche la tempistica: se separiamo maschi e femmine ogni due ore siamo quasi sicuri che

le femmine siano vergini.

Come mobilizziamo questo trasposone? I vettori da inserzione sono non autonomi quindi dobbiamo creare

un genotipo in cui siano presenti trasposoni e sia presente una fonte di trasposasi. Questa è l’elemento Δ2-

3 cioè il trasposone immobile perché privo di una P-wing ma intatto nella regione che codifica per la

trasposasi. Questo trasposone è stabilmente inserito sul terzo cromosoma e in questo ceppo si usa come

fonte di trasposasi ed è associato a un marcatore dominante che è stubble (setole tosse invece che

allungate visibile al microscopio).

Partiamo quindi da femmine che fenotipicamente hanno un corpo normale, però hanno un occhio che non

è proprio rosso ma è uniformemente arancione: questo ci dice che c’è il trasposone e c’è una fonte di

proteina w+ selvatica che complementa la mancanza di alleli funzionanti nel locus white. Queste femmine

(con il P su X) vengono incrociate per maschi anch’essi white (il cromosoma X ha l’allele white) e sul terzo

cromosoma in eterozigosi c’è l’elemento Δ2-3. Come lo vediamo? Sappiamo hce è associato a stubble, per

cui questi maschi avranno l’occhio bianco e le setole corte.

Facciamo avvenire l’accoppiamento e otteniamo la F1: prendiamo i maschi stubble (hanno ereditato dal

padre il cromosoma con la fonte di trasposasi) e white (hanno ereditato dalla madre l’X) con in cis il P(w+).

Nelle cellule di questi individui avviene mobilizzazione (sia nelle cellule somatiche sia in quelle germinali).

Nella femmina e nella generazione parentale il colore dell’occhio è uniforme. Un possibile segno di

mobilizzazione dell’elemento trasponibile è il fatto che negli individui di F1 il colore dell’occhio può non

essere più uniforme, cioè essere a chiazze più o meno intense. È un segno di mobilizzazione a livello di

cellule somatiche dell’occhio dell’elemento trasponibile, che non è più nella stessa posizione ma si è mosso

o sull’X o su altri cromosomi e quindi il livello di trascrizione del cDNa del gene w+ risente di diversi contesti

genomici.

Noi siamo interessati a trasposizione nella linea germinale x isolare nuovi insetti cioè animali nelle cui

cellule abbiamo la stessa cosa. In questo schema prendiamo i maschi di F1 stubble e li incrociamo per

femmine white. Vogliamo avere la trasposasi ma, una volta avvenuta trasposizione, non vogliamo che i

trasposoni continuino a muoversi e quindi dobbiamo controsegregare i trasposoni dalla fonte di trasposasi:

per questo motivo i maschi in cui avviene sia somaticamente sia germinalmente la trasposizione su altri

cromosomi li incrociamo per femmine white, quindi manteniamo sempre il BG white-, e nella generazione

successiva F2 selezioniamo i maschi non stubble che quindi non hanno più la fonte di trasposasi. In questi

maschi i trasposoni sono andati in un’altra posizione e lì rimangono. Siamo sicuri che nella popolazione di

maschi F2 che non hanno più il marcatore stubble l’elemento P è sicuramente finito su un autosoma.

Questo perché i maschi ereditano per forza il white dalla femmina e non hanno più il cromosoma e questo

garantisce che stiamo isolando nuove inserzioni che saranno o sul secondo, o sul terzo, o sul quarto

cromosoma, ma non sappiamo dove.

Come stabilisco se le nuove inserzioni sugli autosomi sono sul secondo o il terzo cromosoma? Incrocio

questi maschi con dei ceppi che abbiamo dei marcatori dominanti del secondo o del terzo cromosoma per

vedere come il fenotipo conferito da questi elementi trasponibili (occhio colorato) segrega rispetto a questi

marcatori.

Individui maschi che hanno nuova inserzione eterozigote o sul secondo o sul terzo cromosoma. Questi

individui hanno come unico fenotipo il fatto che hanno l’occhio colorato. Devo analizzare la linea germinale

dei singoli individui, non posso lavorare a livello di popolazione. Farò incroci tra singoli maschi e le

femmine. In ogni incrocio singolo c’è in giro possibilmente una inserzione o sul secondo o sul terzo

cromosoma. Come diagnostico?

Prendo singoli maschi dell F2 che non sono più stubble e li incrocio prima con un tipo di femmine e dopo

qualche giorno con un altro tipo. Faccio due incroci successivi degli stessi maschi prima con un tipo poi con

un altro di femmine. Le femmine che uso portano in un caso un bilanciatore del secondo cromosoma con il

marcatore curly, nell’altro caso portano un bilanciatore del terzo cromosoma con il marcatore. TM3 (third

multiple three) è un bilanciatore del terzo cromosoma che ha come marcatore dominante dell’adulto il

fenotipo setole corte cioè stubble. Tutte queste femmine sono ovviamente white. I maschi sono

singolarmente incrociati con le femmine.

!

Risultato della progenie F1’ abbiamo due possibilità:

1. i maschi hanno l’inserzione sul secondo cromosoma: se in F1 del primo incrocio selezioniamo

individui che hanno il bilanciatore ereditato dalla madre e l’occhio è colorato quindi hanno preso il

cromosoma con l’inserto dal padre, se l’inserzione è in eterozigosi sul secondo cromosoma:

in F1’ io prendo i maschi e la femmine vergini con l’ala arricciata e l’occhio colorato e li incrocio tra

di loro. Lascio sviluppare la progenie e vado a guardare qual è l’F2’. Se il maschio fondatore ha la

inserzione sul secondo cromosoma, incrociando maschi e femmine di F1’ fatti in quel modo,

avremo che tutta la progenie, sia quella che eredita il cromosoma che quella che non lo eredita, è

P(w+), quindi tutta la progenie ala riccia/ala dritta ha l’occhio colorato. Questo perché incrociamo

maschi e femmine curly/P(w+) quindi curly/curly muore mentre restano curly P(w+)/curly P(w+) e

!

P(w+)/P(w+) tutti con l’occhio colorato.

2. i maschi hanno l’inserzione sul terzo cromosoma: gli individui maschi e femmine curly con l’occhio

colorato se li incrocio e seguo la segregazione del secondo cromosoma avremo degli individui in F2’

curly/culrly che muoiono, curly+/curly+ +/+ saranno eterozigoti per il bilanciatore (ala riccia) e

omozigoti per questo cromosoma, ma in realtà l’inserto essendo sull’altro autosoma segrega

indipendentemente dal bilanciatore curly del secondo cromosoma. Quindi se l’inserto è sul terzo

dall’incrocio F1’ avremo una F2’ in cui sia gli individui curly che gli individui curly+ (ala dritta)

possono essere o w+ o w-. Basta che io veda progenie con occhio bianco allora vuol dire che il

maschio che ha fondato quella linea ha l’inserto sul terzo cromosoma.

A conferma di questo prendo il maschio fondatore dopo tre giorni e lo metto assieme a un altro tipo di

femmine. Il discorso è lo stesso solo che in questo femmine il marcatore dominante è del terzo cromosoma:

se l’individuo fondatore ha un inserto sul secondo, i maschi e le femmine di F1’’ che vado a incrociare tra

loro selezionandoli x le setole corte (stubble) e per l’occhio colorato saranno fatti in un certo modo.

Andando a fare tutte le possibili segregazioni stiamo seguendo il marcatore del terzo, avremo che se

l’inserto è sul secondo in F2’’ sia gli individui stubble che hanno il bilanciatore sia gli individui che non

l’hanno possono essere w+ o w- (perché è su un altro autosoma e quindi segrega in maniera indipendente

dal marcatore del terzo). Viceversa se l’inserto è sul terzo allora gli individui di F1’’ sono fatti in un altro

modo e il marcatore del terzo e il trasposone che vediamo come occhio colorato segregano in maniera

dipendente perciò tutta la progenie stubble o stubble+ avrà occhio colorato.

Stiamo usando l’assortimento indipendente dei caratteri cioè segregazione indipendente dei caratteri

quando sono su cromosomi diversi o viceversa l’assortimento dipendente quando due caratteri sono sullo

stesso cromosoma. La stessa tecnica la usiamo anche x mappare un nuovo transgene.

Da 1 a 14 sono stadi successive delle primissime fasi dello sviluppo dell’embrione: abbiamo lo zigote con il

primo nucleo dato dall’unione del pronucleo maschile e del pronucleo femminile. La parte anteriore è verso

l’alto e quella posteriore è verso il basso e dove vediamo la parte più lineare e quella più convessa,

ques’ultima è quella ventrale mentre la parte lineare è la parte dorsale. La particolarità di Drosophila è che

tutta la fase iniziale dello sviluppo vede l’animale svilupparsi come sincizio polinucleare. Sostanzialmente

vediamo la prima, seconda, terza, quarta ecc. divisione: tutti quelli che vediamo sono nuclei, non cellule.

Fino ad un certo numero di divisioni i nuclei sono nella parte centrale sostanzialmente, esclusi dalla

porzione periferica. Solo successivamente la maggior parte dei nuclei ma non tutti migrano in superficie e

solo dopo si ha la cellularizzazione. Perciò inizialmente l’embrione è un’unica cellula chiusa dalla membrana

plasmatica. Solo quando i nuclei migrano alla superficie, fino allo stadio prima della cellularizzazione vera e

propria, si parla di blastoderma sinciziale, dopodiché si ha la cellularizzazione. Da qui in poi parliamo di

blastoderma cellulare.

I nuclei che rimangono al centro sono dei nuclei che sostengono la espressione genica per il metabolismo

delle sostanze nutritive che sono presenti nel grande citoplasma che forma l’embrione.

Nella parte posteriore dell’embrione si formano una serie di piccole cellule che sono le cellule fondatrici

della linea germinale o cellule polari. I nuclei delle cellule polari che sono presenti nella parte posteriore

dell’embrione sono i primi a essere cellularizzati. È questa la caratteristica che si sfrutta x poter fare

transgenesi. .

L’embrione quando viene deposto è avvolto da due membrane (per lo sviluppo esterno l’embrione deve

essere protetto), una esterna che si chiama membrana corionica che porta le appendici che consentono gli

scambi gassosi, e una membrana più interna (esterna rispetto alla membrana citoplasmatica) che è la

membrana vitellina, che è assolutamente impermeabile se non ai grassi. Questa differenzia una piccola

struttura che è il micropilo, cioè il punto di ingresso dello spermatozoo che serve per orientare l’embrione.

Nelle immagini precedenti non si osservava perché di fatto quando facciamo una preparazione per

immunoistochimica, immunofluorescenza ecc c’è una procedura che ne prevede la rimozione.

La strategia che si usa x realizzare transgenesi è quella di effettuare le microiniezioni: si raccolgono gli

embrioni a stadi precocissimi perché si parte da una grande quantità di adulti, si fanno deporre le femmine

per un tempo molto breve e poi immediatamente si rimuove la membrana più esterna che è quella

corionica che è solubile in ipoclorito di sodio. Di fatto si immergono gli embrioni in una soluzione di

ipoclorito di sodio: si dissolve la membrana corionica ma non quella vitellina quindi l’embrione è ancora

protetto. Gli embrioni a questo punto sono raccolti e ordinati su un vetrino: si usa un vetrino coprioggetto,

su un bordo del vetrino si sparge una piccola quantità di una colla che non attacca fortemente l’embrione

ma consente con aghi speciali di raccogliere gli embrioni e posizionarli in fila uno dietro l’altro sul vetrino,

tutto questo al microscopio. Dobbiamo posizionare gli embrioni in fila con la parte posteriore verso

l’esterno del vetrino. Il vetrino a questo punto si può bloccare sul portaoggetto e si va a un microscopio ad

alto ingrandimento: è uno strumento di precisione con una serie di leve che consentono di spostare

l’oggetto che vogliamo manipolare, in questo caso è l’ago, e muoverlo nelle direzioni. A questo punto che

siamo al microscopio almeno a 40 ingrandimenti, vediamo sostanzialmente l’embrione intero: dobbiamo

posizionare l’ago in modo tale da vederlo all’interno del campo e facciamo microiniezioni inserendo l’ago

nella parte posteriore e all’interno dell’ago è presente la soluzione trasformante. Questa è un tampone

fosfato dove sono disciolti due plasmidi:

1. Vettore di transgenesi cioè un plasmide contenente il costrutto di transgenesi che ha le ali di P e

all’interno quello che vogliamo sia presente

2. Plasmide helper che contiene la regione codificante la trasposasi

Coiniettiamo quindi il plasmide e il costrutto di transgenesi che consente di vedere la tracrizione e

l’espressione della trasposasi.

Lo facciamo a stadi precocissimi cioè a stadi in cui ancora l’embrione non è cellularizzato neppure le cellula

polari, per cui parliamo ancora di nuclei polari. Di fatto iniettare i due plasmidi nella porzione posteriore

dell’embrione significa esporre i nuclei polari, che sono i precursori della linea germinale cioè sono i nuclei

che entreranno nelle cellula polari che fondono la linea germinale, a una grande quantità di plasmide.

L’apparato trascrizionale dell’embrione che è una cellula avrà trascrizione e traduzione e produce la

trasposasi e a quel punto abbiamo un vettore con il costrutto che ha le ali di P e il trasposone si mobilizza

dal plasmide e va ad integrarsi nel genoma. Fatte le iniezioni il vetrino viene preso e si fanno crescere gli

embrioni che diventeranno larve e a quel punto si avranno se siamo stati bravi (se non uccidiamo questi

embrioni durante la procedura: la frequenza con cui si riescono a far sopravvivere è intorno al 40% perciò

ogni 100 embrioni iniettati 40 diventano larve) gli embrioni iniettati diventati adulti e otteniamo la G0.

Nel caso in cui il vettore abbia come marcatore è il mini-white: gli embrioni che iniettiamo sono embrioni

deposti da femmine white omozigoti fecondate da maschi omozigoti, cioè siamo in un BG white (white-

/white-). Gli adulti di G0 hanno l’occhio bianco perché questi animali sono l’equivalente degli individui

esposti a mutageno, non sono essi stessi portatori in tutte le cellule, come gli animali esposti a mutageno

non sono eterozigoti per la mutazioni. Di fatto gli individui di G0 sono chimere; possono avere qualche

omatidio colorato ma è più una casualità che altro. Di fatto la G0 è formato da chimere che hanno gli occhi

bianchi.

Si prendono femmine vergini o maschi e questi si esincrociano (non si incrociano tra di loro) con individui

dell’altro sesso del ceppo white possibilmente singolarmente: singoli maschi con femmine white, femmine

vergini singole con maschi white.

La scritta white-/white+ non vuole significare che gli animali G0 sono eterozigoti per la integrazione white+,

semplicemente vuole dire che nel contesto di un animale white si spera ci siano alcune cellule germinali che

portano la integrazione e quindi white+. Se questo è vero nella generazione successiva G1 vedremo nascere

individui con gli occhi colorati (white+). Non è detto che siano rossi ma possono essere di varie sfumature.

Altra rappresentazione: vettore helper che è il vettore di trasposasi. Questi sono plasmidi di solito piuttosto

grandi e di vario tipo. Poi abbiamo il vettore con il marcatore.

white = allele mutato; white+ = allele selvatico

P: incrociati individui white- i cui embrioni vengono iniettati

G0: singoli individui vengono esincrociati per il ceppo white

G1: non possiamo controllare quante integrazioni ci sono quindi, su quanti cromosomi ecc. per cui in G1 gli

eventuali individui con l’occhio colorato non segregano mendelianamente, nel senso che non abbiamo

metà degli individui trasformanti e metà no. Dipende da quanti nuclei polari sono stati trasformati e quindi

da qual è la frequenza di gameti che portano il transgene. Questi individui di G1 se hanno gli occhi rossi

sono trasformati e teoricamente ogni inserzione che si portano è in eterozigosi. Questo dipende dalla

concentrazione del plasmide che reca il vettore di trasformazione all’interno della soluzione che iniettiamo.

La condizione ideale è non superare una certa concentrazione per creare delle linee separate in modo tale

di cercare di isolare eventi indipendenti il più possibile e la situazione ideale è avere delle linee in cui

segrega un unico inserto.

Solo successivamente, cioè prendendo individui G1 con gli occhi colorati e ancora una volta incrociandoli

singolarmente, che potremo vedere se questi individui recano più inserzioni in cromosomi diversi. Come ce

ne accorgiamo? Nel caso di un individuo in cui white è il marcatore nell’adulto, è proprio il livello di

complementazione della funziona white all’interno del genoma, che risente dell’effetto dell’inserzione che

porta a una maggiore espressione del mini-white, che può fornirci l’informazione attraverso il colore

dell’occhio: se dall’incrocio di un G1 con gli occhi rossi esincrociando di nuovo per il ceppo white (individui

che non portano alcuna inserzione) vediamo segregare individui con gli occhi gialli, con gli occhi arancioni,

con gli occhi rossi, la cosa più probabile è che in realtà abbiamo visto segregare indipendentemente

inserzioni su cromosomi diversi. A questo punto prendiamo individui delle varie classi di colori degli occhi e

li esincrociamo di nuovo in modo tale da vedere di singolarizzare il più possibile la inserzione. Questa è la

situazione più complessa. Nella situazione più semplice l’individuo porta una inserzione. Questo individuo

sarà eterozigote per la inserzione.

Quindi questo può essere sottoposto allo schema di incrocio che permette di diagnosticare a quale

cromosoma è associato. Con questi schemi di incrocio capiamo se è associato a autosomi.

Possiamo capire se un inserto è sull’X vedendo se segrega con il sesso: se l’individuo di G1 è un maschio e

solo le femmine della generazione successiva hanno gli occhi colorati allora è sull’X. Se invece l’individuo in

G1 è una femmina è più complicato: sia i maschi che le femmine ereditano l’X dalla femmina quindi a quel

punto andiamo per esclusione. In questa situazione siamo portati a mapparlo sugli autosomi, se non

segrega in maniera dipendente da nessuno dei marcatore del secondo e del terzo cromosoma che

mettiamo in gioco con gli incroci, allora per esclusione sarà sull’X.

VETTORI DA MUTAGENESI

Cosa un vettore come quello per l’enhancer trapping ci consente di fare?

Questi vettori si basano su una strategia che ci consente di evidenziare se il vettore di mutagenesi si è

integrato in prossimità di una regione regolativa che si esprime in un territorio con una fase di sviluppo di

nostro interesse. Questo è dovuto al fatto che all’interno del vettore di mutagenesi (delimitato dalle ali di P

cioè i triangolini) il reporter che in questo caso è il gene che codifica per la beta-galattosidasi (lacZ) ha un

promotore basale ma non si esprime se il vettore non è in prossimità di una regione regolativa. Si parla di

enhancer ma in questo caso non è considerato in senso stretto: intendiamo regioni che attivano la

trascrizione (promotore prossimale di un gene, regione regolativa intronica, qualunque tipo di regione che

attiva la trascrizione). Se questo accade allora il reporter si esprime e possiamo osservare guardando la

fase di sviluppo di interesse se nella collezione di nuove inserzioni che abbiamo creato ce ne sono alcune di

nostro interesse.

Dopo centinaia di mutagenesi fatte si è arrivati alla conclusione che l’elemento P non si inserisce in

sequenze bersaglio però ha una decisa preferenza per le regioni regolative. Difficilmente si integra

all’interno degli esoni. In genere si integrano negli introni, nelle regioni regolative a monte e talvolta a valle.

In genere si integrano nelle regioni regolative in particolare quelle ricche in AT.

Sono state fatte un centinaio di mutagenesi nel mondo e quindi sono state create delle collezioni di linee

che portano singole integrazioni di questi elementi e in realtà di varie tipologie di elementi P: sia vettori per

enhancer trapping già descritti, ma anche vettori per gene trapping. È simile al primo, ma il gene reporter

non si esprime se siamo in prossimità di una regione regolativa ma solo se la integrazione è avvenuta

dentro una regione codificante (o un esone o un introne): il gene reporter porta una serie di elementi in cis

che permettono la integrazione della regione codificante del reporter all’interno di un messaggero del gene

endogeno in cui si è integrato. Quindi deve essere fondamentalmente integrato all’interno di un trascritto,

se no non si esprime.

In ogni caso con varie strategie sono state create parecchie collezioni di nuove inserzioni, ognuna delle

quali formata da svariate centinaia di linee indipendenti. Sostanzialmente qualunque sia l’organo a cui

siamo interessati, la fase si sviluppo o qualunque processo biologico vogliamo studiare in Drosophila, è

possibile, andando a guardare che tipo di inserzioni sono state ottenute in queste varie collezioni, riuscire a

trovare una serie di inserzioni di nostro interesse. Cosa significa trovare una inserzione di nostro interesse?

Lavoro non più recente dove gli autori hanno mobilizzato l’elemento P per enhancer trapping ed erano

interessati a isolare regioni regolative che regolassero geni espressi nel sistema nervoso in particolare nel

sistema nervoso centrale.

Visione laterale di un embrione a fine embriogenesi quindi è sostanzialmente già una larva di primo stadio

chiusa ancora all’interno della membrana vitellina perciò all’interno del midollo dell’uovo. Il sistema

nervoso è colorato. Parte inferiore e parte posteriore + parte dorsale e parte ventrale.

Sistema nervoso centrale: parte presente nella testa che è il central brain e una parte assile che però negli

invertebrati non è dorsale ma è ventrale e prende il nome di corda ventrale. Da qui partono tutti i nervi e le

efferenze motorie e arriveranno tutte le afferenze sensoriali dai vari distretti del corpo.

Tutte queste strutture sono embrioni più o meno dello stesso stadio. Sono colorazioni LacZ perciò visioni al

microscopio a contrasto di fase: le zone colorate sono cellule che esprimono la beta-galattosidasi. Le cellule

in cui si esprime la beta-galattosidasi sono le cellule in cui nelle varie linee si esprime la beta-gal cioè nelle

varie linee sono presenti inserti in punti diversi del genoma che evidenziano la presenza nelle regioni

circostanti di geni espressi in quelle particolari cellule. In a in tutta la corda ventrale, in b solo in alcune

cellule presenti nella parte mediale, in c solo nella parte centrale ecc. Questo è possibile farlo non solo nel

sistema nervoso ma anche nel mesoderma, nell’intestino e in qualche altro organo di interesse.

Trovate delle inserzioni interessanti a questo punto l’interesse principale è capire quali sono i geni presenti

in prossimità dell’inserto. Per farlo sfruttiamo gli elementi presenti all’interno del trasposone.

TECNICA DEL PLASMID RESCUE O RECUPERO DEL PLASMIDE

IR = inverted repeat quindi le ali di P che sono l’unico elemento derivato tal quale dagli elementi trasponibili

P selvatici

mini-white + Gene reporter = LacZ

origine di replicazione che funziona in E. coli =Ori + un marcatore selezionante i batteri =AmpR

La sequenza del costrutto è nota: sappiamo che all’interno del costrutto ci sono dei siti di restrizione

possibilmente unici all’interno del costrutto. In questo schema abbiamo un sito EcoRI. Quello che si faceva

era estrarre il DNA genomico dalla linea con l’inserto di interesse, lo si digeriva con un enzima (in questo

caso EcoRI) che tagliasse possibilmente una sola volta all’interno del costrutto e anche nelle regioni

genomiche fiancheggianti (parti azzurre).

In basso si ripete lo schema in alto dove la parte tra le due inverted repeat è in verde: elemento P col sito

EcoRI e l’origine di replicazione. Inoltre ci sono vari siti EcoRI nelle regioni fiancheggianti.

Estraiamo il DNA genomico, lo digeriamo con l’enzima, dopodiché il DNA digerito viene diluito attorno ai 2-

5 ng/microlitro) e si effettua una reazione di ligazione. A questo punto ogni frammento del genoma avrà dei

siti compatibili, e il DNA digerito nei vari frammenti viene tutto ligato e probabilmente ogni frammento

darà origine a una molecola circolare. Probabilmente perché ho diluito il DNA: si allestisce una reazione di

ligazione in cui il DNA da ligare è diluito ma non più di 5ng/µl. Questo fa sì che le reazioni di ligazione

intramolecolare siano più probabili delle reazioni di ligazione intermolecolari. Quindi sostanzialmente

dobbiamo immaginare che i frammenti si circolarizzino.

Questo DNA ligato viene usato x trasformare E. coli, quindi cellule competenti alla trasformazione. Miscela

di molecole circolari la usiamo per trasformare E. coli, dopodiché le piastriamo aggiungendo ampicillina (il

circolo verde dell’immagine è sbagliato perché si genera solo se abbiamo un altro sito EcoRI).

Nessuna di queste molecole circolari è capace di rendere i batteri resistenti all’ampicillina tranne quello con

la cassetta di resistenza. Quindi di fatto facciamo delle trasformazioni con una grande quantità di DNA e

otteniamo se siamo fortunati 1-2 colonie. È una soluzione molto stringente, però se troviamo una o due

colonie, queste recano un plasmide con la sequenza di ori, la IR e il pezzo di regione genomica

fiancheggiante, in questo caso a monte. Perciò ho già clonato un pezzo della regione, posso perciò

sequenziarla e a quel punto blastando contro le banche dati posso vedere in che regione siamo e se questa

è una regione attribuita ad un gene oppure no.

Con questa tecnica isoliamo almeno un frammento di regioni fiancheggianti l’inserto. Se non abbiamo a

disposizione la sequenza del genoma come facciamo partendo da questo solo frammento ad isolare il resto

del gene? Usiamo il chromosome wlaking: bisogna avere a disposizione una collezione di cloni cioè una

libreria genomica. A seconda delle dimensioni dei cloni che sono costruiti in modo da essere overlappanti,

poteva essere una libreria plasmidica, fagica, fino ad arrivare al lievito. Il principio era quello di avere una

libreria genomica quindi una collezione il più possibile rappresentativa di tutto il genoma dell’organismo su

cui si lavora, costruita in modo da avere cloni overlappanti. A quel punto avendo a disposizione il nostro

pezzettino di sequenza che poteva essere anche solo 300 bp. Come facciamo a trovare il resto dei cloni se

abbiamo a disposizione una libreria genomica di cloni overlappanti? Si usa la tecnica si ibridazione DNA-

DNA: il frammento clonato veniva marcato in genere radioattivamente, si piastrava la libreria genomica. Ad

esempio abbiamo una libreria plasmidica in cui abbiamo una collezione di plasmidi, ognuno dei qualu

contenente un inserto, e tutti i plasmidi coprono qualunque sequenza del genoma dell’organismo. Si

prendono i plasmidi, si trasforma E. coli, si piastra su tante piastre, ogni plasmide che trasforma dà colonie

che sono cloni dei quali contiene un solo plasmide e possiamo esserne sicuri per il fenomeno di

incompatibilità plasmidica. Si basa su un meccanismo di replicazione del plasmide per cui di fatto in un

batterio non può essere contenuto se non un plasmide con una determinata ori. Poi all’interno di un

batterio possiamo avere anche più plasmidi diversi se questi hanno una ori differente.

Quindi sostanzialmente abbiamo 50 piastre con tutte le colonie e si fa il colony blotting e con dei dischi di

nitrocellulosa o di nylon si trasferiscono le colonie così come sono disposte sulla piastra sul filtro, questo

viene sottoposto a una serie di trattamenti, e si fa la ibridazione. Se la sonda è radioattiva il filtro è esposto

al autoradiogramma e se ordiniamo il filtro rispetto alla piastra da cui deriva allora dal segnale

dell’ibridazione possiamo risalire alle colonie che contengono quel frammento, ma nella libreria quel

frammento non è detto che sia presente come tale, magari è presente come parte di un clone più grande. A

quel punto isoliamo un clone più grande che contiene il pezzetto a fianco (a monte o a valle). E così si

procede in modo tale che sia isolato molecolarmente l’intero gene. Poi ovviamente lo si sequenziava e

avevamo la intera sequenza.

Se abbiamo la sequenza del genoma e vogliamo applicare questa tecnica possiamo ovviamente sequenziare

e blastare, oppure possiamo non usare questa tecnica e sfruttare la PCR, per cui il principio è esattamente

lo stesso. L’approccio si basa sul fatto che non sappiamo quali sono le sequenze genomiche ma conosciamo

esattamente le sequenze a livello del vettore P. sono sequenze uniche all’interno del genoma di quella linea

di individui. Posso quindi disegnare delle coppie di oligonculeotidi per poter realizzare una inverse PCR.

Creo all’interno della regione a sinistra o/e della regione a destra delle coppie di oligonucleotidi divergenti.

A quel punto digerisco il DNA genomico, lo ligo nello stesso modo di prima. La miscela di DNA circolarizzato

è usata in una reazione di PCR dove metto una delle due coppie di oligonucleotidi e a quel punto questa

coppia funzionerà su un DNA circolare andando ad amplificare la parte del DNA circolare che altro non è

che la regione fiancheggiante a monte/a valle.

A questo punto posso sequenziare i prodotti di amplificazione. Anche sequenziando 300 bp se ho la

seqeunza del genoma blasto e trovo la intera regione.

L’esperienza fatta in Drosophila ha convinto i ricercatori che usano altri sistemi a sfruttare gli elementi

trasponibili residenti della specie di loro interesse a cercare di realizzare nel proprio sistema dei sistemi di

mutagenesi inserzionale. Questo proprio perché se da una parte inducono mutazioni con minor frequenza

rispetto agli agenti mutageni alchilanti, consentono la mappatura dell’inserzione molto più facilmente. Se

non si riesce a trovare un elemento trasponibile sufficientemente raro all’interno della specie, si stanno

usando gli elementi trasponibili di Drosophila per cercare di vedere se sono in grado di mobilizzare in

maniera controllata all’interno per esempio di C. elegans.

Nonostante tutte le mutagenesi inserzionali fatte in Drosophila, ci sono dei geni in cui non si sono mai

isolate inserzioni. Questo è il motivo per cui in Drosophila stessa si sono sviluppati altri sistemi di trasposoni

ingegnerizzati di tipo diverso per vedere se è possibile isolare mutazioni al limite di tutti i geni. C’è un

progetto che va avanti da una decina di anni e l’obiettivo è di isolare in qualche modo un qualche tipo di

trasposone inserzioni in tutti i geni di Drosophila.

Data la preferenzialità dell’elemento P per le regioni regolative, spesso le inserzioni, che sono una

mutazione per definizione, non producono alcun fenotipo. Questo genere di inserzione non le isoliamo

andando a cercare un fenotipo ma per esempio con una strategia diversa. L’inserzione c’è e può essere mio

interesse ottenere una mutazione. So che quella mutazione è in un gene che magari ho identificato, però

l’inserto non determina un fenotipo e quindi non mi aiuta a studiare dal pdv funzionale a studiare il ruolo di

quel gene. L’inserto mi aiuta, attraverso la espressione di un gene reporter, a studiare un pattern di

espressione, ma questo non significa conoscere il ruolo del gene. Se so che un gene è espresso nei muscoli

questo non mi dice che ha un ruolo importante nel muscolo; mi dice che è probabile che abbia un ruolo nel

muscolo essendo espresso lì. L’unico modo per dimostrare che un gene ha un ruolo nel muscolo o nel

sistema nervoso è creare una mutazione che mi dia un fenotipo a carico di quel tessuto.

ESCISSIONE DELL’ELEMENTO P

Il fatto di avere una inserzione è un punto di ingresso x realizzare un'altra strategia che è sostanzialmente

quella contraria a quella vista ieri: isolare delle linee che perdono il trasposone di origine. Se un trasposone

non ha provocato il fenotipo una volta integrato, con una frequenza che non è altissima (<1%) è possibile

che se isolo linee che perdono quella particolare inserzione questo mi provochi una alterazione del gene

che quindi mi porterà un fenotipo. Dal punto di vista genetico quello che faccio è il jump out del trasposone

(l’ingresso è il jump in): vado a isolare linee che abbiamo l’escissione dell’elemento P. Dal punto di vista

genetico la situazione è molto simile allo schema di incrocio già affrontato.

Si parte da individui femmine che hanno la inserzione di interesse. Si tratta di una inserzione che è in

omozigosi, quindi che non provoca alcun fenotipo particolarmente grave ed è sul terzo cromosoma. Questi

animali sempre in BG white hanno l’occhio colorato perché portano almeno due dosi del trasposone.

Incrocio questi individui x la solita linea di maschi che porta Δ2-3 cioè trasposasi.

Nella F1 isolo gli individui che siano stubble (marcatore setole toraciche corte associato alla fonte di

trasposasi). In questi individui (nello schema specifico sono maschi ma potrebbero essere anche femmine)

avviene di nuovo trasposizione, segnalata dal fatto che il dell’occhio non è più uniforme, ma i vari omatidi

possono portare inserzioni differenti o perdite delle inserzioni. Incrocio questi individui (che hanno il

cromosoma con l’inserto e il cromosoma con la fonte di trasposasi) x individui della linea white.

La vera selezione che facciamo nella generazione successiva F2 è cercare individui che abbiano perso il

trasposone, vale a dire individui che hanno di nuovo l’occhio bianco. Cerco individui che non hanno più il

marcatore associato alla fonte di trasposasi e che hanno l’occhio bianco.

A questo punto posso creare delle linee più facilmente se parto da maschi. Comunque singoli maschi o

singole femmine sono esincrociati di nuovo x white per creare linee in cui io non ho più il trasposone e

queste verranno screenate x cercare gli individui in cui la uscita del trasposone può avere provocato

effettivamente una mutazione più grave di quella dovuta all’inserzione del trasposone stesso.

Perché questo può accadere? Seguo il terzo cromosoma perché sono partito da un inserto del terzo

cromosoma. Quindi nell’incrocio che faccio per creare le linee di interesse userò dei bilanciatori del terzo

cromosoma. Perché può essere interessante? Bisogna capire cosa succede quando avviene la inserzione o

l’uscita del trasposone:

Schema che mostra un trasposone inserito in un determinato punto del genoma. Se è presente la

trasposasi il trasposone può essere esciso e integrato in altro punto. Sia nel meccanismo di escisione che

nel meccanismo di integrazione la trasposasi determina dei tagli a singolo filamento sfalsati: determinano la

comparsa di terminali a singolo filamento le cui dimensioni cambiano a seconda del trasposone. Nel caso

dell’elemento P sono 8 nt (non è quello dell’immagine). La sequenza del sito bersaglio non è importante

cioè non è una sequenza consenso ma è particolarmente ricca in AT (però non è una sequenza specifica).

Quello in scuro è la sequenza dell’elemento trasponibile che va a integrarsi nella regione tagliata dalla

trasposasi e i gap che rimangono vengono riparati. Di fatto la nuova inserzione è fiancheggiata da una

ripetizione diretta della sequenza all’interno del quale si è integrato. Questo è un altro segno che

accompagna cioè la duplicazione della regione tagliata.

Cosa molto simile accade quando il trasposone esce. Inserto di partenza con le ali di P. Se noi abbiamo lo

schema di incrocio di prima selezionando individui che hanno di nuovo l’occhio bianco di fatto selezioniamo

individui che derivano da gameti in cui è avvenuto questo tipo di evento. La trasposasi riconosce la

sequenza delle ali di P (riconosce le inverted repeat) e produce un taglio all’interno della IR a singolo

filamento sfalsato che determina la comparsa di una estremità overhang cioè una estremità a single strand

che è di 17 bp nel caso dell’ elemento P. Vediamo anche la duplicazione di 8 bp che si è generata quando

questo elemento si è integrato (target va inteso come bersaglio che la trasposasi ha tagliato). Quindi questo

è il segno della integrazione che ha portato alla comparsa di questo trasposone in quel determinato sito

genomico.

Se andiamo a selezionare gli individui che hanno perso il trasposone, questi derivano da gameti in cui

avremo l’ala P: la trasposasi ha sostanzialmente mobilizzato l’elemento P che non si è integrato altrove,

cioè noi facciamo selezione genetica per perdita del colore dell’occhio. Perciò isoliamo individui che

derivano da gameti in cui è avvenuto questo tipo di evento, cioè la escissione. Sostanzialmente il

meccanismo è simile a quello della integrazione però nel caso della escissione ciò che la trasposasi

riconosce sono le inverted repeat del trasposone. È qui che produce il taglio a singolo filamento. Ancora

una volta crea il gap che deve essere riparato. Noi ovviamente andiamo a selezionare gli eventi che

avvengono nella linea somatica ma in quella germinale.

Come può essere riparato il DNA? Ci sono vari meccanismi di riparazione.

1. Uno si basa su meccanismi di ricombinazione omologa cioè sul fatto di sfruttare regioni omologhe

per riparare il gap (homologous recombination)

2. Meccanismi di emergenza x cui pur di chiudere il gap di DNA le estremità del taglio vengono unite

senza sfruttare la sequenza omologa presente su un filamento stampo (non-homologous end-

joining)

In realtà il double-strand break non viene riparato così com’è: in genere il sistema di riparazione

soprattutto quello basato sull’omologia delle sequenze prevede l’allargamento del gap attraverso un

sistema di esonucleasi che lo allarga, ed è importante quale stampo viene utilizzato x la riparazione:

sostanzialmente il singolo filamento va a invadere un doppio filamento omologo. Se siamo in una

condizione di eterozigosi dell’inserto originale, se siamo allo stadio di quattro cromatidi, abbiamo due

cromatidi che portano l’inserto e due che non lo portano. Se salta uno degli inserti ma non l’altro abbiamo

un gap. Questo gap può essere riparato sul cromatide fratello che porta l’inserto oppure può essere

riparato sfruttando le sequenze dei cromatidi non fratelli cioè del cromosoma omologo che non portava

l’inserto perché siamo in eterozigosi. A seconda che venga usato o l’uno o l’altro, gli eventi che vengono

prodotti sono differenti. Quindi sostanzialmente i prodotti finali dipendono dallo stampo omologo che

viene usato per la riparazione: o il cromatide fratello, sister chromatid, o i cromatidi non fratelli, perciò

sostanzialmente quelli del cromosoma omologo.

L’allargamento del gap da parte delle esonucleasi può essere più o meno grande e il livello di riparazione

vera e propria è un’altra variabile.

Questa serie di variabili porta alla comparsa di una serie di prodotti di questa riparazione:

!

siamo in condizioni di eterozigosi: un cromosoma porta l’inserto e l’altro no allo stadio di 4 cromatidi

può saltare solo un inserto, perciò abbiamo a disposizione lo stampo del cromatide fratello con l’inserto

originale e lo stampo dei cromatidi non fratelli (del cromosoma omologo) che non hanno l’inserto

!

viene usato il cromatide fratello come stampo possono avvenire due tipologie di eventi

• 1. Ripristino della sequenza dell’elemento P: questo evento per la selezione genetica che abbiamo

fatto lo perdiamo perché selezioniamo individui che non hanno più l’occhio colorato. Questi

individui che eventualmente derivano da gameti in cui è avvenuta la riparazione completa con

ripristino dell’inserto originale hanno l’occhio colorato e li scartiamo

2. Delezioni della sequenza del trasposone: se l’evento di riparazione non è completa è possibile

con bassa frequenza isolare delle delezioni del trasposone stesso. Viene usato come stampo di

riparazione il cromatide fratello che porta l’inserto ma la riparazione non è completa. Questo

determinare la perdita di parte della sequenza: questo però è possibile che noi lo selezioniamo

a favore perché se la porzione di trasposone che non viene riparata contiene mini-white gli

individui derivati dal gamete che reca questo prodotto di riparazione noi lo selezioniamo a

favore. In realtà il fatto di avere un trasposone deleto può, rispetto al trasposone intero,

determinare un fenotipo. Magari il trasposone tronco altera per qualche motivo l’espressione

del gene endogeno più di quanto non facesse il trasposone intero. Per cui tra questi eventi che

non sono frequentissimi possiamo isolare un allele del gene.

viene usato uno dei due cromatidi non fratelli come stampo

Porta al ripristino della sequenza originale priva dell’inserzione cioè alla vera escissione precisa del

trasposone. Questo tipo di eventi che troviamo tra individui che perdono il colore dell’occhio è un prodotto

abbastanza frequente ed estremamente importante particolarmente nel caso in cui l’inserto originale da un

fenotipo. Se l’inserto originale da un fenotipo come ad esempio letalità, perciò l’omozigosi dell’inserto

uccide l’individuo, realizzare strategia di jump out e trovare tra le linee selezionate x perdita del traspone

delle linee in cui il cromosoma riparato in omozigosi non da più letalità è una evidenza formale che la

letalità è dovuta al trasposone.

escissione imprecisa

Siccome la riparazione del DNA basata sull’omologia avviene dopo un processo di allargamento del gap,

con bassa frequenza (intorno all’1%) la riparazione che usa i cromatidi omologhi come stampo può

produrre delle escissioni del trasposone ma anche perdita di sequenze fiancheggianti, cioè sostanzialmente

produce delezioni più o meno gravi del locus endogeno.

Perciò sostanzialmente se non riesco a identificare un fenotipo dovuto a inserzione il trasposone che ho

selezionato mi dà una possibilità di realizzare altre strategie come queste x isolare mutazioni anche gravi

del locus. SCREEN GENETICI CLASSICI

Nel 1996 hanno preso il premio Nobel per la medicina perché hanno fondato la genetica dello sviluppo.

Prima non esisteva un approccio genetico x studiare lo sviluppo di organismo pluricellulare, neanche in

Drosphila.

Enorme lavoro svolto prevalentemente da Christiane Nusslein-Volhardt e Eric Wieschaus che hanno fatto

uno screening di mutagenesi con agenti alchilanti isolando su tutti i cromosomi di Drosophila il maggior

numero possibile di mutazioni che bloccassero lo sviluppo embrionale. Scoprirono perciò che è possibile

dissezionare geneticamente lo sviluppo di un organismo semplice ma quello che gli portò il Nobel fu il fatto

che quello che scoprirono di realizza tale e quale nell’uomo (i geni scoperti avevano un ruolo molto simile

anche nei mammiferi).

Ed Lewis prese il Nobel perché ha scoperto i geni omeotici in Drosophila cioè i geni selettori in vivo che

fanno si che un determinato metamero si differenzi nel corretto sviluppo.

Nel 2011 Jules A. Hoffmann ha predo il Nobel perché ha contribuito invece a caratterizzare genetico-

molecolarmente i meccanismi dell’immunità innata.

Quello che hanno ideato parte dall’assunto che geni fondamentali per lo sviluppo dell’embrione

probabilmente avranno un fenotipo generale che è la letalità embrionale. Di fatto hanno effettuato una

mutagenesi alla ricerca di letali precoci, letali zigotici che uccidessero lo zigote durante l’embriogenesi.

Il presupposto per poter mutagenizzare genomi è essere sicuri che negli individui che esponiamo al

mutageno non ci siano già mutazioni precedenti nel loro genoma: quindi cosa fanno? Creazione di linee

isogeniche in generale, più in dettaglio isocromosomiche. Questo schema di incrocio consente di creare

linee isocromosomiche per il secondo cromosoma, quindi useremo bilanciatori con marcatori dominanti

associati al secondo cromosoma. Consente di avere delle linee in cui gli unici cromosomi selvatici cioè che

non portano marcatori dominanti sono cromosomi che non recano mutazioni che diano letalità precoce.

Creo famiglie di individui in cui nella fattispecie il secondo cromosoma è selvatico cioè non marcato da altri

marcatori quindi non porta mutazioni.

Si parte da una popolazione di maschi selvatici (MM vuol dire molti maschi) senza alcun fenotipo. È una

popolazione di individui dove i secondi cromosomi che sono in gioco sono tanti, fare una linea

isocromosomica vuol dire creare linee in cui l’unico secondo cromosoma non marcato da altri marcatori

dominanti è sempre lo stesso all’interno della linea. Questi maschi vengono incrociati x femmine che

portano un bilanciatore del secondo cromosoma che ha la mutazione curly dominante e un altro in trans

con un altro cromosoma che porta due marcatori dominanti, ma a noi interessa soprattutto glazed che è

una mutazione che porta fenotipo nell’occhio. Perciò queste femmine hanno l’ala riccia e l’occhio glazed. I

maschi invece sono completamente selvatici.

Incrocio di massa e creo in F1 una popolazione: tra i segreganti di F1 avrò una classe segregate (circa la

metà) con l’ala riccia e l’occhio selvatico e sono eterozigoti per il bilanciatore. L’altra metà deriva dalla

popolazione di secondi cromosomi selvatici presenti nel ceppo di partenza quindi hanno l’ala stesa e

l’occhio glazed. Questi individui ricevono dalle madri il bilanciatore e dai padri il secondo cromosoma.

Posso distinguere i due segreganti guardando l’occhio o l’ala. Posso quindi selezionare i maschi che hanno

l’ala riccia e l’occhio normale. Posso dire che al limite ognuno di essi ha un secondo cromosoma non

marcato.

A questo punto creiamo delle linee fondate da singoli maschi. Facciamo tanti incroci con singoli maschi di

F1 con l’ala riccia e l’occhio selvatico incrociati con più femmine simili alle madri, cioè con lo stesso

genotipo (bilanciatore curly e altro secondo cromosoma marcato da glazed):

In questo incrocio vediamo solo un secondo cromosoma non marcato, perché parto da singoli maschi e

fondo delle linee all’interno delle quali gira sempre un cromosoma II non marcato. Vado perciò a guardare

la progenie di ogni singolo incrocio: entro ogni singola linea della progenie F2 prendiamo maschi e femmine

vergini che abbiano l’ala riccia e l’occhio selvatico. Questi maschi e femmine che hanno ereditato dalle

madri in F1 il bilanciatore e dal padre fondatore il cromosoma selvatico. Sia i maschi che le femmine hanno

esattamente lo stesso cromosoma II non marcato che deriva dal padre fondatore.

Perciò se un maschio di F1 che ho usato come fondatore ha una mutazione che da letalità in quella specifica

linea posso fare un incrocio di F2 (perché sono eterozigoti) ma nella progenie F3 quali segreganti avremo?

50% eterozigoti fatti come i genitori, 25% curly/curly muoiono, e un altro 25% saranno omozigoti per

cromosoma selvatico e che non saranno marcati dall’ala riccia. Se non trovo questi ultimi individui significa

che in quella linea il cromosoma II marcato derivante dal padre fondatore recava una mutazione che dà

letalità recessiva e scarto la linea. Tengo le linee che in F3 mi danno il 25% di individui omozigoti per lo

stesso II cromosoma del padre fondatore di quella specifica linea e ho a questo punto creato una linea

isocromosomica per un cromosoma II. Se i maschi e le femmine con l’ala dritta sono fertili il cromosoma

non porta nessuna mutazione che altera la fertilità e se per di più non hanno caratteristiche del corpo

visibili alterate non dovrebbero avere neppure mutazioni vitali ma che diano eventualmente fenotipi

osservabili. A questo punto ho una linea isocromosomica che posso mutagenizzare in modo controllato.

Una linea siffatta è utilizzabile per fare una mutagenesi alla ricerca di letali zigotici sul secondo cromosoma.

Hanno usato una serie di strategie per semplificarsi la vita: se con C. elegans abbiamo visto che possiamo

sfruttarla per diagnosticare in massa e velocemente se degli individui segregano una mutazione letale

recessiva, nel caso di Drosophila non possiamo sfruttare questo. Perciò come stabiliamo se una mutazione

provoca letalità recessiva? Uccide l’omozigote perciò se io faccio un incrocio controllato guardando la

progenie dell’incrocio tra eterozigoti posso vedere se mi segregano tutte le classi previste o no. Se mi

sopravvivono individui con l’ala dritta vuol dire che il cromosoma non marcato non dà letalità. Se mi manca

la classe di segregazione degli individui con ala dritta vuol dire che il cromosoma reca una mutazione letale.

Faccio quindi un incrocio controllato per poter stabilire se ho o meno tutte le classi di segregazione. Gli

incroci singoli li hanno fatti su migliaia di maschi fondatori. Fare questo significa un lavoro molto

importante. Loro volevano fare una mutagenesi saturante quindi aumentare il più possibile il numero di

mutazioni perciò hanno usato qualche trucco. Invece di mutagenizzare cromosomi che non portano alcun

marcatore hanno mutagenizzato dei cromosomi che erano selvatici tranne x la presenza di marcatori

recessivi (danno fenotipo solo in omozigosi) che sono i marcatori cinnabar e brown. Sono due geni che

partecipano al pathway di produzione del pigmento dell’occhio. Quando abbiamo un doppio omozigote

abbiamo l’occhio bianco.

Schema di incrocio (su cromosoma II) che hanno usato per effettuare la mutagenesi:

Hanno mutagenizzato una linea isocromosomica omozigote per cn e bw (occhi bianche e ali normali).

Questi maschi esposti al mutageno in massa sono stati incrociati per femmine omozigote quindi con occhi

bianchi: in massa sono stati incrociati x femmine che sul secondo cromosoma recano il bilanciatore con la

mutazione dominante curly, sull’altro secondo cromosoma hanno una mutazione TS in grado di conferire

un fenotipo di letalità dominante ma termosensibile. Perciò gli individui eterozigoti x questa mutazione TS

esposti ad alte T (28-29 gradi) muoiono. Se teniamo le colture a T permissiva anche gli individui eterozigoti

x questa mutazione sopravvivono.

Generazione I

Hanno selezionano gli individui di F1 recanti l’ala dritta e l’occhio rosso, cioè individui che avevano

ereditato il bilanciatore dalla madre e un secondo cromosoma dal padre che era presente nell’individuo

esposto al mutageno quindi. I cromosomi esposti al mutageno sono marcati da X che stanno a indicare la

possibilità che questi cromosomi dopo esposizione al mutageno rechino una mutazione. In F1 abbiamo i

potenziali eterozigoti per nuove mutazioni. I maschi di F1 con ala riccia/occhio rosso portano un secondo

cromosoma potenzialmente mutato. Questi individui sono stati singolarmente incrociati ognuno con più

femmine uguali alle madri parentali cioè curly e TS a T permissiva. Di questi incroci ne hanno fatti centinaia.

Generazione II

La progenie F2 di questi incroci F1 è stata fatta crescere a T restrittiva: anche gli individui eterozigoti x la

mutazione TS fornita dalle madri di F1 provoca letalità. Se questi individui sono fatti crescere a T restrittiva

allora i segreganti TS/curly muoiono , TS/cn bw muoiono, e i curly/culry muoiono. L’unica classe che

sopravvive sono gli individui che ricevono il curly dalle madri e dall’unico padre fondatore il cromosoma che

deriva da uno dei cromosomi esposti al mutageno nella generazione parentale. Siccome questa F2 deriva

da un incrocio singolo all’interno di ogni linea c’è un solo e sempre lo stesso cromosoma II derivato dai

cromosomi II esposti al mutageno nella generazione parentale.

Perché usare la termosensibilità aiuta? Perché noi dobbiamo selezionare maschi e femmine eterozigoti per

vedere di creare gli omozigoti di questo cromosoma e quindi guardare la progenie F2 ogni 2/3 ore per

raccogliere le femmine vergini. Se invece l’unica classe di segreganti che sopravvive è quella che io avrei

selezionato non ho bisogno di fare questo lavoro perché gli unici maschi che sopravvivono sono proprio

quelli con cui voglio che le femmine eterozigoti si incrocino.

Generazione III

A quel punto hanno fatto crescere la progenie F3 di maschi e femmine curly/cn bw di F2 inincrociando tra

loro fratelli e sorelle (ala riccia e occhio rosso). Sono linee isocromosomiche per cui il cromosoma II non

marcato da curly che deriva dal parentale mutagenizzato è sempre lo stesso perciò nella F3 posso vedere se

quel cromosoma mutagenizzato provoca o meno letalità. Quindi dalla F3 ci aspettiamo che gli omozigoti

per il bilanciatore muoiono, il 50% di individui eterozigoti fatti come i genitori, e un 25% di individui ala

dritta e occhio bianco che non recano il bilanciatore ma ereditano sia dal padre che dalla madre il

cromosoma marcato da cn e bw. Questi cromosomi sono esattamente identici perché derivano dall’unico

individuo eterozigote fondatore di quella specifica linea. Se all’interno di ogni linea il cromosoma II derivato

dal maschio fondatore reca una mutazione letale recessiva, il 25% di individui ala dritta/occhio bianco non li

vediamo. Perciò manca la classe degli omozigoti perciò recano una mutazione recessiva letale in omozigosi.

I fratelli e le sorelle con ala dritta e occhio colorato recano invece quel cromosoma in eterozigosi quindi

abbiamo creato una linea in cui segrega una mutazione letale che possiamo propagare nel tempo e che


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in biotecnologie molecolari e industriali (Facoltà di Chimica Industriale e Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali)
SSD:
Università: Bologna - Unibo
A.A.: 2013-2014

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher lauradg90 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Genetica funzionale con laboratorio e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Bologna - Unibo o del prof Bernardoni Roberto.

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