anatomia dei genomi eucariotici

Anatomia dei genomi eucariotici

Il sequenziamento ha fornito una visione più o meno definita dell'organizzazione dei genomi, procarioti ed eucarioti. In generale, l'ordine di grandezza dei genomi eucarioti va da circa 10⁷ a 10¹¹: il genoma umano è costituito da 3,2 × 10⁹ paia di basi e contiene circa 35.000 geni; si colloca al centro della distribuzione dei genomi eucariotici. Ovviamente, di dimensioni notevolmente inferiori sono i genomi di batteri, virus e plasmidi.

È noto, tuttavia, che esiste una grande variabilità, per cui non vi è una corrispondenza esatta tra la complessità di un dato organismo e la dimensione del suo genoma, fenomeno che prende il nome di "paradosso del valore C".

Complessità del genoma

La complessità del genoma è definita come la lunghezza totale di tutte le differenti sequenze presenti. In generale, il contenuto totale di DNA negli eucarioti e quindi la dimensione del genoma è correlata alla complessità dell'organismo: ad esempio, il genoma umano è più grande di quello degli insetti che è più grande di quello dei funghi. In genere, per un dato raggruppamento tassonomico, la dimensione minima del genoma è approssimativamente proporzionale alla complessità dell'organismo.

Esistono, però, delle eccezioni: Xenopus laevis (rospo) ha un genoma molto più grande di quello dei mammiferi. La dimensione del genoma degli anfibi è al di sotto di 910 bp, ma Xenopus laevis fa eccezione perché ha un genoma più grande di quello umano. Allo stesso modo, il mais ha un genoma di circa 5000 Mb, superiore di molto al genoma umano, che si aggira intorno alle 3200 Mb.

La complessità biologica può essere "misurata" in diversi modi, ad esempio sulla base della diversità di tipi cellulari, della complessità dei circuiti del cervello, o del "n teorico" di stati dell'espressione genica. Ipotizzando N geni umani e supponendo che ciascuno possa essere presente in due soli stati, ON o OFF, il numero di possibili stati sarebbe pari a 2^N. In questo modo si potrebbe anche calcolare quanto un organismo è più complesso di un altro. I circa 35.000 geni del genoma umano corrispondono ad una complessità di 2^35,000.

Paradosso del valore C

Se si calcola la complessità solo sul numero di geni, non vi sono differenze macroscopiche nella complessità negli eucarioti. Da ciò deriva il cosiddetto paradosso del valore C, definito come la mancanza di correlazione tra le dimensioni del genoma e la sua complessità. Difatti, un'osservazione che ha fatto molto discutere nell'era pre-genomica è la mancanza di correlazione esistente tra dimensione del genoma e complessità biologica.

La complessità del genoma può essere misurata in termini di:

• Contenuto di DNA. Il contenuto totale di DNA del genoma aploide è chiamato valore C ed è specifico per ogni organismo. Il termine C-value (valore Costante) si riferisce alla quantità di DNA espressa in picogrammi contenuta nel nucleo di una cellula apolide: un gamete contiene la metà del materiale genetico contenuto in una cellula somatica diploide di un organismo eucariote. 1 pg (picogrammo) è uguale a 10⁻¹² g (grammi) che sono uguali a 978 Mb del genoma umano. Ponendo i diversi valori C in correlazione tra loro è possibile osservare l'enorme variabilità esistente tra i diversi genomi.
• Numero di geni. Utilizzando il numero di geni come misura della complessità del genoma, ci si accorge che l'uomo non è molto diverso da altri eucarioti più semplici, come per esempio Drosophila melanogaster: l'Homo sapiens è circa 2,5 volte più complesso del C. elegans e solo 2 volte più complesso del moscerino della frutta. Le annotazioni più dettagliate delle sequenze ultimate dei cromosomi umani suggeriscono che tale genoma contiene circa 35.000 geni. Il numero è molto più basso degli 80.000-100.000 stimati originariamente sulla base del numero di proteine presenti nelle cellule umane. Queste stime così alte erano, difatti, basate sull'ipotesi che, in molti casi, un singolo gene specifica per un mRNA e quindi un'unica proteina. La scoperta che il numero di geni è di molto inferiore indica che lo splicing alternativo, il processo mediante il quale gli esoni di un pre-mRNA vengono assemblati in diverse combinazioni in modo da generare più di una proteina a partire da un singolo gene, è più frequente di quanto si ritenesse inizialmente. Confrontando il numero di geni dei diversi eucarioti è ipotizzabile l'esistenza di un trend, per cui il numero di geni in un eucariote varia tra 5000 e 40000, ma non correla con le dimensioni del genoma o la complessità dell'organismo: il riso ha un genoma quasi vicino a quello dell'uomo. La correlazione tende a diminuire man mano che vi è una maggiore presenza di sequenze non codificanti. Si può, inoltre, osservare come i genomi degli eucarioti unicellulari ricadono nello stesso range di dimensioni dei batteri superiori; tuttavia, man mano che si sale lungo la scala evolutiva questa correlazione si perde.
• Numero di cromosomi. Non si osserva alcuna correlazione tra dimensioni del genoma e numero di cromosomi. Per esempio, tra gli invertebrati il Saccharomices cerevisiae ha un genoma di 13 Mb organizzato in 16 cromosomi. Allo stesso modo, la Drosophila ha un genoma di 180 Mb condensato in 4 cromosomi.

Dal sequenziamento del genoma umano e degli altri genomi si è osservato:

• Una grande variabilità nei valori di C tra specie le cui complessità apparenti non differiscono in modo sostanziale;
• La presenza di un eccesso di DNA rispetto alla quantità necessaria per codificare proteine.

Ad oggi, la spiegazione del paradosso è fornita da due elementi:

• La presenza di geni discontinui nei genomi degli organismi meno complessi si risparmia spazio in quanto i geni sono più vicini tra di loro; mentre si ha la presenza di introni geni eucariotici.
• La presenza di DNA ripetitivo nei genomi degli organismi complessi.

Sebbene la complessità del genoma venga definita come la "lunghezza totale di tutte le differenti sequenze presenti", il paradosso è che sembra esistere un rapporto tra la quantità di sequenze di DNA non codificanti e la complessità di un organismo. È, dunque, lecito ritenere che la vera complessità stia nei complessi meccanismi di regolazione dell'espressione genica. Il paradosso del valore C consiste non nel progressivo aumento delle dimensioni del genoma all'aumentare della complessità degli organismi, ma nel fatto che organismi simili possano differire enormemente nelle dimensioni dei loro genomi.

Nel paradosso è, difatti, intrinseca, la presenza di una grande diversità all'interno dello stesso phylum, per cui individui appartenenti alla stessa specie differiscono nelle dimensioni dei genomi, e tale differenza deriva dall'espansione delle famiglie di DNA ripetuto.

Organizzazione genica negli eucarioti

Nel trattare l'organizzazione genica negli eucarioti, occorre tenere in considerazione due dogmi:

1. I geni eucariotici sono monocistronici rispetto ai geni policistronici degli organismi più in basso lungo la scala evolutiva. Ci sono però delle eccezioni che possono essere rappresentate, per esempio, dalle "unità di trascrizione policistroniche", ossia geni che formano complessi molto vicini tra loro, controllati da un'unica regione di controllo del genoma e che vengono risolti in mRNA maturi monocistronici per trans-splicing (il trans-splicing è un fenomeno comune in Drosophila ma presente anche in tripanosomi, nematodi, platelminti). Una seconda eccezione è rappresentata dalle "IRES (siti interni di ingresso del ribosoma)", ossia unità riconosciute dal complesso ribosomale e localizzate a valle rispetto al 5'UTR; consentono un re-inizio della traduzione o frameshift tradizionale. Le IRES sono, inoltre, frequentemente localizzate all'interno di introni.
2. I geni eucariotici non mostrano nessuna evidente relazione tra localizzazione e attività funzionale (functional clustering) o con espressione spazio-temporale. L'eccezione a questa regola è, però, rappresentata dalla presenza di raggruppamenti di geni con funzione correlata (cluster genici), quali geni Hox, geni per emoglobine e geni per immunoglobuline.

I geni non sono distribuiti uniformemente lungo tutto il cromosoma. Consideriamo una mappa di densità di un cromosoma qualunque: questo risulterebbe eterocromatico nelle regioni centrali e funzionale per la gran parte del cromosoma. Vi è, dunque, una bassa densità alle estremità telomeriche e nella regione centromerica, dove si trovano sequenze ripetute che mantengono l'integrità del cromosoma; per il resto vi sono sequenze codificanti.

Nella maggior parte degli organismi, i geni sembrano distribuiti più o meno casualmente con una variazione della densità genica tra cromosomi così come tra regioni di uno stesso cromosoma. La densità genica media in Arabidopsis è di 25 geni ogni 100 kb, ma anche al di fuori dei centromeri e dei telomeri la densità varia da 1 a 38 geni per 100 kb. Lo stesso è vero per i cromosomi umani, dove la densità varia tra 0 e 64 geni per 100 kb.

Esiste l'evidenza che geni umani sono localizzati principalmente in regioni ricche in CG: il genoma cerca, infatti, di evitare le sequenze CpG e le clasterizza laddove sono presenti i geni. La densità delle "isole CpG" è correlabile alla frequenza genica in uno specifico cromosoma. Per esempio, il cromosoma 19, il più ricco in geni e con la minore densità genica, presenta il maggior numero di isole CpG. Il cromosoma X, secondo in grandezza dopo il cromosoma 1, non è ricco in geni quanto il cromosoma 19: pur avendo una dimensione di circa 250 Mb è particolarmente ricco di sequenze ripetute.

La presenza delle isole CpG nelle regioni 5' dei geni è collegata agli effetti della metilazione sulla trascrivibilità dei geni. I geni sono potenzialmente trascrivibili se ipometilati, mentre l'ipermetilazione dei promotori è solitamente correlata ad una inattivazione degli stessi: le citosine delle CpG sono metilate in 5-metilcitosina e sono, quindi, silenziate nel momento in cui il gene viene spento. Tutti i geni housekeeping sono caratterizzati dalla presenza di isole CpG ipometilate o per nulla metilate, essendo costitutivamente attivi. Le isole CpG sono funzionali in quanto, nel momento in cui il gene deve essere silenziato, la metilcitosina viene riconosciuta dagli istoni: questi si legano alla 5-metilcitosina e condensano ulteriormente il DNA, in modo che diventi eterocromatico impedendo l'attivazione del gene; la metilazione delle isole CpG inibisce, dunque, la trascrizione.

Nella scala evolutiva, osservando il contenuto in C+G si osserva una conservazione funzionale: i Mammalia, ossia H. sapiens e M. musculus, presentano un contenuto G+C intorno al 40%. I genomi eucariotici mostrano una minore variabilità nel contenuto in G+C rispetto ai genomi procariotici, anche se differenze si possono osservare sia all'interno che tra i diversi phyla.

Modello delle isocore

Un'altra evidenza che indica una distribuzione dei geni non omogenea deriva dal modello di organizzazione genomica detto "isocoro". Secondo il modello delle isocore, proposto da Giorgio Bernardi nel 1985, i genomi dei vertebrati e delle piante sono mosaici di segmenti di DNA, chiamati "isocore", ciascuno lungo almeno 300 kb e caratterizzato da una composizione in basi uniforme e differente da quella del segmento adiacente.

Il modello isocoro è confermato da esperimenti in cui il DNA genomico viene frammentato in segmenti di circa 100 kb, trattato con coloranti che legano in modo specifico regioni ricche in A-T e G-C e i frammenti ottenuti vengono separati mediante ultracentrifugazione in gradiente di densità. Quando questo esperimento viene eseguito con DNA umano si evidenziano cinque frammenti, ciascuno rappresentante un tipo di isocoro con la sua caratteristica composizione in basi:

• Due isocori ricchi in A-T, chiamati L1 e L2 (L sta per light); rappresentano oltre il 60% del genoma e sono meno associate ai geni.
• Tre classi ricche in G-C chiamate H1, H2 e H3 (H sta per heavy); sono correlate ai geni. Le isocore hanno un contenuto in GC caratteristico:
  • H3: 54% di G/C
  • H2: 49% di G/C
  • H1: 46% di G/C
  • L2: 42% di G/C
  • L1: 39% di G/C

Sono, inoltre, associate a differenze funzionali: H3 è il meno abbondante, costituendo appena il 3-5% del genoma umano, ma contiene circa l'80% dei geni housekeeping. L1 e L2 costituiscono nel loro insieme il 66% del genoma umano, comprendendo l'85% dei geni specifici dei tessuti. La maggior parte del genoma è costituita da isocore leggere (L1, L2). Al contrario, la maggior parte dei geni è localizzata nelle isocore pesanti (H1, H2 e H3). Nel genome core costituito dalle isocore H2 e H3 (12% del genoma) la densità dei geni è molto alta (un gene per 5-15kb), mentre nel cosiddetto empty space formato dalle isocore di tipo L e H1 (88% del genoma) la densità genica è molto bassa (un gene per 50-150kb).

I genomi eucariotici non sono molto compatti a differenza di quelli procariotici. Paragonando i genomi di S. cerevisiae, D. melanogaster e H. sapiens ci si accorge di come la densità vari nel numero di geni. I genomi degli eucarioti hanno una densità genica molto ridotta. In media, i geni codificanti per proteine occupano solo il 2-4% dell'intero genoma. Ciò non è vero per Saccharomices, il quale presenta una densità genica media di 479 per ogni Mb. La Drosophila ha, invece, una densità genica di 79 per ogni Mb; mentre l'uomo presenta solo 11 geni per Mb.

Per quanto riguarda gli introni: l'uomo contiene 9 introni per gene, Drosophila per gene, mentre Saccharomices appena 0,04 (la maggior parte dei geni sono monocistronici senza introni). Nell'H. sapiens aumenta il numero di introni, allo stesso modo della percentuale di genoma occupato da repeat: l'uomo ha il 44% del genoma occupato da ripetizioni intersperse, rispetto al 3% di Saccharomices.

Nei genomi degli organismi meno complessi si risparmia spazio in quanto i geni sono più vicini tra loro. Il genoma di S. cerevisiae illustra questo caso, dove , il segmento di 50 kb del cromosoma 12 umano (A) è paragonato ad un segmento di uguale misura del genoma di lievito.

Nello specifico, il segmento di 50 kb comprende il locus del recettore β delle cellule T, e contiene 4 geni. Il segmento del genoma di lievito deriva dal cromosoma III e ha le seguenti caratteristiche:

• Contiene più geni del segmento umano. Questa regione del cromosoma III contiene 26 geni che si pensa codifichino proteine e 2 che codificano tRNA.
• Relativamente pochi geni di lievito sono discontinui. In questo segmento del cromosoma III nessuno dei geni è discontinuo. Nell'intero genoma del lievito ci sono 230 introni, rispetto agli oltre 30.000 del genoma umano.
• Vi sono meno sequenze ripetute disperse in tutto il genoma. Questa parte del cromosoma III contiene cinque ripetizioni estese a tutto il genoma che occupano il 13,5% del segmento di 50 kb. Se si considerano tutti i 16 cromosomi, l'ammontare totale di sequenza occupato da ripetizioni disperse in tutto il genoma è solo il 3,4% del totale.

Il quadro che emerge è che l'organizzazione del genoma di lievito è molto più economica di quella del genoma umano. I geni stessi sono più compatti, hanno meno introni e lo spazio tra di loro è relativamente piccolo; molto meno spazio è occupato da ripetizioni disperse in tutto il genoma e da altre sequenze non codificanti. L'ipotesi secondo cui gli organismi più complessi hanno genomi meno compatti è valida anche quando si esaminano altre specie. Consideriamo un segmento di 50 kb del genoma del moscerino della frutta. Tale segmento contiene 11 geni, che sono un numero maggiore di quelli presenti nel segmento umano e un numero minore di quelli presenti nella sequenza di lievito. Tutti questi geni sono discontinui, ma sette contengono un solo introne. La densità genica nel genoma del moscerino della frutta è intermedia tra quella di lievito e quella umana.

Le differenze tra i genomi di lievito, del moscerino della frutta e dell'uomo sono confermate dal confronto tra le ripetizioni disperse in tutto il genoma. Queste rendono conto del 3,4% del genoma di lievito, di circa il 12% del genoma di Drosophila e del 44% del genoma umano. Sta diventando sempre più evidente che le ripetizioni disperse in tutto il genoma svolgono un ruolo determinante nell'imporre una maggiore o minore compattezza al genoma. Ne è un esempio lampante il genoma di mais, che con le sue 2500 Mb è relativamente piccolo per una pianta a fiore. Anche in questo caso consideriamo un segmento.