anatomia dei genomi eucariotici

ANATOMIA DEI GENOMI EUCARIOTICI

Il sequenziamento ha fornito una visione più o meno definita dell’organizzazione dei

genomi, procarioti ed eucarioti. In generale, l’ordine di grandezza dei genomi eucarioti

×

7 11 9

va da circa 10 a 10 : il genoma umano è costituito da 3,2 10 paia di basi e

contiene circa 35000 geni; si colloca al centro della distribuzione dei genomi

eucariotici. Ovviamente, di dimensioni notevolmente inferiori sono i genomi di batteri,

virus e plasmidi.

È noto, tuttavia, che esiste una grande variabilità, per cui non vi è una corrispondenza

esatta tra la complessità di un dato organismo e la dimensione del suo genoma,

fenomeno che prende il nome di “paradosso del valore C”.

complessità del genoma

La è definita come la lunghezza totale di tutte le differenti

sequenze presenti. In generale, il contenuto totale di DNA negli eucarioti e quindi la

dimensione del genoma è correlata alla complessità dell’organismo: ad es., il genoma

umano è più grande di quello degli insetti che è più grande di quello funghi.

In genere, per un dato raggruppamento tassonomico, la dimensione minima del

genoma è approssimativamente proporzionale alla complessità dell’organismo.

Xenopus laevis

Esistono, però, delle eccezioni: lo (rospo) ha un genoma molto più

grande di quello dei mammiferi. La dimensione del genoma degli anfibi è al di sotto di

Xenopus laevis

9

10 bp, ma lo fa eccezione perché ha un genoma più grande di quello

umano. Allo stesso modo, il mais ha un genoma di circa 5000 Mb, superiore di molto al

genoma umano, che si aggira intorno alle 3200 Mb.

La complessità biologica può essere “misurata” in diversi modi, ad esempio sulla base

della diversità di tipi cellulari, della complessità dei circuiti del cervello, o del “n

teorico” di stati dell’espressione genica.

Ipotizzando N geni umani e supponendo che ciascuno possa essere presente in due

N

soli stati, ON o OFF, il numero di possibili stati sarebbe pari a 2 . In questo modo si

potrebbe anche calcolare quanto un organismo è più complesso di un altro. 35.000

I circa 35.000 geni del genoma umano corrispondono ad una complessità di 2 .

Se si calcola la complessità solo sul numero di geni, non vi sono differenze

macroscopiche nella complessità negli eucarioti.

paradosso del valore C

Da ciò deriva il cosiddetto , definito come la mancanza di

correlazione tra le dimensioni del genoma e la sua complessità. Difatti,

un’osservazione che ha fatto molto discutere nell’era pre-genomica è la mancanza di

correlazione esistente tra dimensione del genoma e complessità biologica.

La complessità del genoma può essere misurata in termini di:

Contenuto di DNA.

1. Il contenuto totale di DNA del genoma aploide è chiamato valore C ed è specifico

C-value (valore Costante)

per ogni organismo. Il termine si riferisce alla quantità di

DNA espressa in picogrammi contenuta nel nucleo di una cellula apolide: un

gamete contiene la metà del materiale genetico contenuto in una cellula somatica

diploide di un organismo eucariote.

-12

1 pg (picogrammo) è uguale a 10 g (grammi) che sono uguali a 978 Mb del

genoma umano.

Ponendo i diversi valori C in correlazione tra loro è possibile osservare l’enorme

variabilità esistente tra i diversi genomi.

Numero di geni.

2. Utilizzando il numero di geni come misura della complessità del genoma, ci si

accorge che l’uomo non è molto diverso da altri eucarioti più semplici, come per es

Drosophila melanogaster: l’Homo sapiens

la è circa 2,5 volte più complesso del

C. elegans

moscerino della frutta e solo 2 volte più complesso del .

Le annotazioni più dettagliate delle sequenze ultimate dei cromosomi umani

suggeriscono che tale genoma contiene circa 35.000 geni. Il numero è molto più

basso degli 80.000-100.000 stimati originariamente sulla base del numero di

proteine presenti nelle cellule umane. Queste stime così alte erano, difatti, basate

sull’ipotesi che, in molti casi, un singolo gene specifica per un mRNA e quindi

un’unica proteina. La scoperta che il numero di geni è di molto inferiore indica che

lo splicing alternativo, il processo mediante il quale gli esoni di un pre-mRNA

vengono assemblati in diverse combinazioni in modo da generare più di una

proteina a partire da un singolo gene, è più frequente di quanto si ritenesse

inizialmente. Confrontando il numero di geni dei

diversi eucarioti è ipotizzabile

l’esistenza di un trend, per cui il

numero di geni in un eucariote varia

tra 5000 e 40000, ma non correla con

le dimensioni del genoma o la

complessità dell’organismo: il riso ha

un genoma quasi vicino a quello

dell’uomo.

La correlazione tende a diminuire

man mano che vi è una maggiore

presenza di sequenze non codificanti.

Si può, inoltre, osservare come i genomi degli eucarioti unicellulari ricadono nello

stesso range di dimensioni dei batteri superiori; tuttavia, man mano che si sale

lungo la scala evolutiva questa correlazione si perde.

Numero di cromosomi.

3. Non si osserva alcuna una correlazione tra dimensioni del genoma e numero di

Saccharomices cerevisiae

cromosomi. Per esempio, tra gli invertebrati il ha un

Drosophila

genoma di 13 Mb organizzato in 16 cromosomi. Allo stesso modo, la ha

un genoma di 180 Mb condensato in 4 cromosomi.

Dal sequenziamento del genoma umano e degli altri genomi si è osservato:

- Una grande variabilità nei valori di C tra specie le cui complessità apparenti non

differiscono in modo sostanziale;

- La presenza di un eccesso di DNA rispetto alla quantità necessaria per codificare

proteine.

Ad oggi, la spiegazione del paradosso è fornita da due elementi:

geni discontinui:

a. La presenza di nei genomi degli organismi meno complessi si

risparmia spazio in quanto i geni sono più vicini tra di loro; mentre si ha la presenza

di introni geni eucariotici.

DNA ripetitivo

b. La presenza di molto nei genomi degli organismi complessi.

Sebbene la complessità del genoma venga definita come la “lunghezza totale di tutte

le differenti sequenze presenti”, il paradosso è che sembra esistere un rapporto tra la

quantità di sequenze di DNA non codificanti e la complessità di un organismo. È,

dunque, lecito ritenere che la vera complessità stia nei complessi meccanismi di

regolazione dell’espressione genica.

Il paradosso del valore C consiste non nel progressivo aumento delle dimensioni del

genoma all’aumentare della complessità degli organismi, ma il fatto che organismi

simili possano differire enormemente nelle dimensioni dei loro genomi

Nel paradosso è,

difatti, intrinseca, la

presenza di una

grande diversità

all’interno dello stesso

phylum, per cui

individui appartenenti

alla stessa specie

differiscono nelle

dimensioni dei

genomi, e tale

differenza deriva

dall’espansione delle

famiglie di DNA

ripetuto.

Nel trattare l’organizzazione genica negli eucarioti, occorre tenere in considerazione

due dogmi:

1. I geni eucariotici sono monocistronici rispetto ai geni policistronici degli organismi

più in basso lungo la scala evolutiva. Ci sono però delle eccezioni che possono

essere rappesentate, per esempio, dalle “unità di trascrizione policistroniche”,

ossia geni che formano complessi molto vicini tra loro, controllati da un’unica

regione di controllo del genoma e che vengono risolti in mRNA maturi

monocistronici per trans-splicing (il trans-splicing è un fenomeno comune in

Drosophila ma presente anche in tripanosomi, nematodi, platelminti).

Una seconda eccezione è rappresentata dalle “IRES (siti interni di ingresso del

ribosoma)”, ossia unità riconosciute dal complesso ribosomale e localizzate a valle

rispetto al 5’UTR; consentono un re-inizio della traduzione o frameshift tradizionale.

Le IRES sono, inoltre, frequentemente localizzate all’interno di introni.

2. I geni eucariotici non mostrano nessuna evidente relazione tra localizzazione e

attività funzionale (functional clustering) o con espressione spazio-temporale.

L’eccezione a questa regola è, però, rappresentata dalla presenza di

raggruppamenti di geni con funzione correlata (cluster genici), quali geni Hox, geni

per emoglobine e geni per immunoglobuline.

I geni non sono distribuiti uniformemente lungo tutto il cromosoma. Consideriamo una

mappa di densità di un cromosoma qualunque: questo risulterebbe eterocromatico

nelle regioni centrali e funzionale per la gran parte del cromosoma. Vi è, dunque, una

bassa densità alle estremità telomeriche e nella regione centromerica, dove si trovano

sequenze ripetute che mantengono l’integrità del cromosoma; per il resto vi sono

sequenze codificanti.

Nella maggior parte degli organismi, i geni sembrano distribuiti più o meno

casualmente con una variazione della densità genica tra cromosomi così come tra

regioni di uno stesso cromosoma. La densità genica media

Arabidopsis

in è di 25

geni ogni 100 kb, ma

anche al di fuori dei

centromeri e dei

telomeri la densità varia

da 1 a 38 geni per 100

kb.

Lo stesso è vero per i cromosomi umani, dove la densità varia tra 0 e 64 geni per 100

kb.

Esiste l’evidenza che geni umani sono localizzati principalmente in regioni ricche in

CG: il genoma cerca, infatti, di evitare le sequenze CpG e le clasterizza laddove sono

presenti i geni. La densità delle “isole CpG” è correlabile alla frequenza genica in uno

specifico cromosoma. Per esempio, il cromosoma 19, il più ricco in geni

e con la minore densità genica, presenta il

maggior numero di isole CpG.

Il cromosoma X, secondo in grandezza dopo il

cromosoma 1, non è ricco in geni quanto il

cromosoma 19: pur avendo una dimensione di

circa 250 Mb è particolarmente ricco di sequenze

ripetute.

La presenza delle isole CpG nelle regioni 5’ dei geni è collegata agli effetti della

metilazione sulla trascrivibilità dei geni. I geni sono potenzialmente trascrivibili se

ipometilati, mentre l’ipermetilazione dei promotori è solitamente correlata ad una

inattivazione degli stessi: le citosine delle CpG sono metilate in 5-metilcitosina e sono,

quindi, silenziate nel momento in cui il gene viene spento.

Tutti i geni housekeeping sono caratterizzati dalla presenza di isole CpG ipometilate o

per nulla metilate, essendo costitutivamente attivi.

Le isole CpG sono funzionali in quanto, nel momento in cui il gene deve essere

silenziato, la metilcitosina viene riconosciuta dagli istoni: questi si legano alla 5-

metilcitosina e condensano ulteriormente il DNA, in modo che diventi eterocromatico

impedendo l’attivazione del gene; la metilazione delle isole CpG inibisce, dunque, la

trascrizione.

Nella scala evolutiva, osservando il contenuto in C+G si osserva una conservazione

H. sapiens M. musculus

funzionale: i Mammalia, ossia e presentano un contenuto G+C

intorno al 40%. I genomi eucariotici mostrano una minore variabilità nel contenuto in

procariotici,

G+C rispetto ai genomi anche se differenze si possono osservare sia

all’interno che tra i diversi phyla.

Higher taxon Species G+C%

H. sapiens

Mammalia 41

M. musculus 42

A. Thaliana

Plants 36

O. Sativa 44

C. elegans

Nematoda 36

S. cerevisae

Fungi 38

S. pombe 36

Un’altra evidenza che indica una distribuzione dei geni non omogenea deriva dal

modello di organizzazione genomica detto “isocoro”.

modello delle isocore

Secondo il , proposto da Giorgio Bernardi nel 1985, i genomi

dei vertebrati e delle piante sono mosaici di segmenti di DNA, chiamati “isocore”,

ciascuno lungo almeno 300 kb e caratterizzato da una composizione in basi uniforme e

differente da quella del segmento adiacente.

Il modello isocoro è confermato da esperimenti in cui il DNA genomico viene

frammentato in segmenti di circa 100 kb, trattato con coloranti che legano in modo

specifico regioni ricche in A-T e G-C e i frammenti ottenuti vengono separati mediante

ultracentrifugazione in gradiente di densità.

Quando questo esperimento viene eseguito con DNA umano si evidenziano cinque

frammenti, ciascuno rappresentante un tipo di isocoro con la sua caratteristica

composizione in basi:

- Due isocori ricchi in A-T, chiamati L1 e L2 (L sta per light); rappresentano oltre il

60% del genoma e sono meno associate ai geni.

- Tre classi ricche in G-C chiamate H1, H2 e H3 (H sta per heavy); sono correlate ai

geni. Le isocore hanno un contenuto in GC

caratteristico:

- H3: 54% di G/C

- H2: 49% di G/C

- H1: 46% di G/C

- L2: 42% di G/C

- L1: 39% di G/C

Sono, inoltre, associate a differenze

funzionali: H3 è il meno abbondante,

costituendo appena il 3-5% del genoma

umano, ma contiene circa l’80% dei geni

housekeeping.

L1 e L2 costituiscono nel loro insieme il

66% del genoma umano, comprendendo

l’85% dei geni specifici dei tessuti.

La maggior parte del genoma è

costituita da isocore leggere (L1, L2). Al contrario la maggior parte dei geni è

localizzata nelle isocore pesanti (H1, H2 e H3).

Nel genome core costituito dalle isocore H2 e H3 (12% del genoma) la densità dei geni

è molto alta (un gene per 5-15kb), mentre nel cosiddetto empty space formato dalle

isocore di tipo L e H1 (88% del genoma) la densità genica è molto bassa (un gene per

50-150kb).

I genomi eucariotici non sono molto compatti a differenza di quelli procariotici.

S. cerevisiae, D. melanogaster H. sapiens

Paragonando i genomi di e ci si accorge di

come la densità vari nel numero di geni.

I genomi degli eucarioti hanno una densità genica molto ridotta. In media, i geni

codificanti per proteine occupano solo il 2-4% dell’intero genoma.

Saccharomices,

Ciò non è vero per il quale presenta una densità genica media di 479

Drosophila

per ogni Mb. La ha, invece, una densità genica di 79 per ogni Mb; mentre

l’uomo presenta solo 11 geni per Mb. Drosophila

Per quanto riguarda gli introni: l’uomo contiene 9 introni per gene, per

Saccharomices

gene, mentre appena 0,04 (la maggior parte dei geni sono

monocistronici senza introni).

Nell’H. sapiens aumenta il numero di introni, allo stesso modo della percentuale di

genoma occupato da repeat: l’uomo ha il 44% del genoma occupato da ripetizioni

Saccharomices.

intersperse, rispetto al 3% di

Nei genomi degli organismi meno complessi si risparmia spazio in quanto i geni sono

S. cerevisiae

più vicini tra loro. Il genoma di illustra questo caso, dove , il segmento di

50 kb del cromosoma 12 umano (A) è paragonato ad un segmento di uguale misura

del genoma di lievito.

Nello specifico, il segmento di 50 kb comprende il locus del recettore β delle cellule T,

e contiene 4 geni. Il segmento del genoma di lievito deriva dal cromosoma III e ha le

seguenti caratteristiche:

- Contiene più geni del

segmento umano.

Questa regione del

cromosoma III contiene

26 geni che si pensa

codifichino proteine e 2

che codificano tRNA

- Relativamente pochi

geni di lievito sono

discontinui. In questo

segmento del cromosoma III nessuno dei geni è discontinuo. Nell’intero genoma del

lievito ci sono 230 introni, rispetto agli oltre 30.000 del genoma umano.

- Vi sono meno sequenze ripetute disperse in tutto il genoma. Questa parte del

cromosoma III contiene cinque ripetizioni estese a tutto il genoma che occupano il

13,5% del segmento di 50 kb. Se si considerano tutti i 16 cromosomi, l’ammontare

totale di sequenza occupato da ripetizioni disperse in tutto il genoma è solo il 3,4%

del totale.

Il quadro che emerge è che l’organizzazione del genoma di lievito è molto più

economica di quella del genoma umano. I geni stessi sono più compatti, hanno meno

introni e lo spazio tra di loro è relativamente piccolo; molto meno spazio è occupato da

ripetizioni disperse in tutto il genoma e da altre sequenze non codificanti.

L’ipotesi secondo cui gli organismi più complessi hanno genomi meno compatti è

valida anche quando si esaminano altre specie. Consideriamo un segmento di 50 kb

del genoma del moscerino della frutta. Tale segmento contiene 11

geni, che sono un numero

maggiore di quelli presenti nel

segmento umano e un numero

minore di quelli presenti nella

sequenza di lievito.

Tutti questi geni sono discontinui, ma sette contengono un solo introne.

La densità genica nel genoma del moscerino della frutta è intermedia tra quella di

lievito e quella umana.

Le differenze tra i genomi di lievito, del moscerino della frutta e dell’uomo sono

confermate dal confronto tra le ripetizioni disperse in tutto il genoma. Queste rendono

conto del 3,4% del genoma di lievito, di circa il 12% del genoma di Drosophila e del

44% del genoma umano.

Sta diventando sempre più evidente che le ripetizioni disperse in tutto il genoma

svolgono un ruolo determinante nell’imporre una maggiore o minore compattezza al

genoma.

Ne è un esempio lampante il genoma di mais, che con le sue 2500 Mb è relativamente

piccolo per una pianta a fiore.

Anche in questo caso consideriamo un segmento