Analisi di biomolecole

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ANALISI DI BIOMOLECOLE

Le principali metodiche usate per l’identificazione di molecole organiche e la caratterizzazione di

biomolecole sono:

• Spettroscopia infrarossa (IR)

• Spettrometria di Massa

• Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR e MRI (Magnetic Resonance

Imaging)) →

SPETTROSCOPIA studio dell’interazione fra la radiazione elettromagnetica (luce) e la materia,

con assorbimento della radiazione da parte di quest’ultima; si realizza attraverso l’osservazione di

uno spettro (spettro-scopia)

→

SPETTROMETRIA misura di uno spettro (spettro-metria), anche dal punto di vista quantitativo

Oggi la risonanza viene fatta sia sull’uomo che su che animali: meno si bombarda l’organismo con

le radiazioni e meglio è, è importante lavorare con basse energie anche con sistemi biologici. IR e

NMR non sono distruttive ma altre lo possono essere (→se distruttive non posso afre più niente

col campione). I raggi X rappresentano una tecnica strutturale importante: accoppiati con la

cristallografia erano l’unica tecnica fino a 30 anni fa a poter fornire informazioni sulla struttura

delle macromolecole biologiche. Oggi il numero di strutture prodotte con NMR aumenta sempre

di più (non arriva al numero di quelle prodotte con i raggi X ma quasi).

Anche IR può essere sfruttato per ottenere informazioni sul folding delle proteine, come aria la

struttura secondaria ecc… con una tecnica meno costosa e meno sofisticata di NRM: ottengo

meno informazioni ma ho comunque una descrizione abbastanza esaustiva del fenomeno.

SPETTROSCOPIA INFRAROSSA (IR)

La radiazione infrarossa si trova nella parte dello spettro elettromagnetico tra le regioni del visibile

e delle microonde. La porzione di maggiore interesse per la spettroscopia IR è quella compresa tra

-1

4000 e 400 cm . 2

Siamo al di sotto, in termini di lunghezza d’onda e di energia, del visibile e dell’ultravioletto

(energia a cui siamo sottoposti tutto il giorno).

Quando faccio uno spettro UV visibile di un composto, si usa più energia di uno spettro IR e molta

più energia dello spettro NMR. -1

La regione che ci interessa è quella compresa tra 4000 e 400cm : modo di espressione delle

lunghezze d’onda, dove per le lunghezze IR si esprimono in cm.

La radiazione compresa tra 400 e 4000cmsi suddivide a sua volta in diverse regioni:

• Vicino IR (14000-4000 cm1)

• Medio IR (4000-500 cm-1)

• Lontano IR (500-20 cm-1)

Quello che dobbiamo capire è come la radiazione elettromagnetica in queste regioni spettrali sia

→

in grado di interagire con la materia (molecole) e che effetti è in grado di produrre osservare

diversi modi vibrazionali.

La radiazione IR con frequenza inferiore a 100 cm-1

viene assorbita da una molecola organica (glucosio,

→

acido ascorbico ecc… piccole molecole ma anche

macromolecole) e convertita in energia rotazionale.

Questo assorbimento è quantizzato e perciò uno

spettro rotazionale è costituito da linee separate.

La radiazione IR, nell’intervallo da circa 10000 a 100

-1

cm , viene assorbita da una molecola e convertita in

energia vibrazionale. Anche qui l’assorbimento è

quantizzato, ma lo spettro vibrazionale presenta delle bande perché ad una singola variazione

dell’energia vibrazionale sono associati un certo numero di livelli di energia rotazionale.

NB: È PROPRIO SULLO STUDIO DI QUESTE BANDE CHE SI BASA LA SPETTROSCOPIA IR, IN

PARTICOLARE DI QUELLE COMPRESE TRA 4000 E 400 cm-1.

Il problema è associare queste bande di assorbimento con le proprietà strutturali del composto

→

che ho in esame come tradurre la presenza di una specifica banda nello spettro IR in

informazione strutturale.

Per questo motivo dobbiamo interrogarci sulle proprietà strutturali da cui dipendono le frequenze

di assorbimento di ciascun composto.

Le frequenze di assorbimento dipendono:

o Dalle masse relative degli atomi

o Dalle costanti di forza dei legami

o Dalla geometria degli atomi

→legami chimici (singolo, doppio ecc…), atomi uniti tra questi legami (C-O, C-H…) e angoli di

legame.

Se derivo i legami chimici nella molecola posso capire i gruppi funzionali presenti nella molecola.

Le posizioni delle bande nello spettro IR sono indicate come numeri d’onda (ū) la cui unità di

-1

misura è il reciproco del centimetro (cm ); questa unità è proporzionale alla frequenza, di

conseguenza inversamente proporzionale alla lunghezza d’onda. È inoltre proporzionale

all’energia vibrazionale. Rappresentata sull’asse X dello spettro IR. -

La lunghezza d’onda (λ) era utilizzata nella letteratura più vecchia in unità di micrometri (mm = 10

6 m, anche chiamati micron). 3

I numeri d’onda non corrispondono esattamente alle frequenze poiché mentre essi corrispondono

a: 4

ū = 1x10 /λ

con λ in unità di µm,

le frequenze (v in Hz) corrispondono a c/λ

con λ in cm e c velocità della luce (3x1010 cm/s)

Lungo l’asse Y è invece rappresentata una misura dell’intensità: le intensità delle bande IR possono

essere espresse in trasmittanza (T) o in assorbanza (A).

• La trasmittanza è la frazione di luce incidente che attraversa un campione ad una data

lunghezza d’onda, cioè il rapporto tra la potenza radiale trasmessa da un campione e quella

di riferimento T=I /I %

0

T=intensità/intensità originale x 100

• L’assorbanza è una misura della quantità di radiazione elettromagnetica assorbita dal

campione: A = log (1/T)

10

Normalmente gli spettri vengono visualizzati in trasmittanza (picchi di assorbimento vibrazionale

rivolti verso il basso).

In ordinata possono esserci l’una o l’altra a seconda della molecola organica che stiamo guardando

spettri IR di piccole molecole o di proteine si vedono spettri in assorbanza o in trasmittanza:

→

- Piccole molecole trasmittanza

→

- Macromolecole assorbanza

Una volta che acquisisco il dato strumentale il dato lo posso rappresentare ina assorbanza o

trasmittanza in modo identico.

Questo è però un modo di approntare gli spettri, completamente diversi, che nel tempo sono tati

conservati per comodità degli operatori.

Esistono due modi di vibrazione molecolare:

• di STRETCHING (o STIRAMENTO)

• di BENDING (o PIEGAMENTO)

stiramento e piegamento dei legami molecolari e degli angoli di legame.

Una vibrazione di stretching è un movimento ritmico lungo l’asse di legame con conseguente

aumento e diminuzione della distanza interatomica.

Pe stretching si può intendere:

o Allungamento del legame

o Accorciamento del legame

Qualsiasi legame chimico ha una lunghezza media ma si può allunare o accorciare e questo effetto

può essere prodotto dall’interazione con le radiazioni IR. 4

Se due legami in cui l’atomo è coinvolto, si allungano

o accorciano in contemporanea allora si parla di

stretching simmetrico, se invece uno si allunga e

uno si accorcia quindi non in contemporanea allora

ho uno stretching asimmetrico. In questi casi avrò

bande diverse e lo stretching dipende dalla natura

degli atomi e dalla natura dei legami che fanno

(→natura dei legami e natura degli atomi).

Una vibrazione di bending può essere dovuta ad una

variazione nell’angolo nei legami con un atomo in

comune oppure ad un movimento di un gruppo di

atomi rispetto al resto della molecola.

La variazione dell’angolo permette una interazione dei legami chimici con la radiazione IR: in

relazione alla posizione degli atomi e die legami serve più o meno energia a indurre queste

alterazioni degli angoli di legame.

La deformazione può pure essere:

▪ Simmetrica nel piano, detta scissoring (apertura e chiusura di una forbice)

▪ Asimmetrica nel piano, chiamata rocking (oscillazione)

▪ Simmetrica fuori dal piano, detta twisting (torsione)

▪ Asimmetrica fuori dal piano, chiamata wagging («agitamento»).

Le frequenze di stretching possono essere calcolate applicando la legge di Hooke di un oscillatore

armonico:

A seconda della natura della molecola cambia denominatore e numeratore, cambia quindi v e

→

cambia il numero d’onda associata alla banda di assorbimento correlo le tipologie di legame

preseti nella mia molecola alla banda.

Ciascuna tipologia di legame è associata ad una regione di assorbimento caratteristica: non è un

numero d’onda ma una regione.

Come vedo in tabella ho una finestra ampia perché ad ES il C può essere legato a sua volta ad altro

(H, O, C o altro). A seconda di quello che è legato a ciascun C la frequenza di assorbimento può

variare. 5

ES: se ho un legame C-C mi aspetto che questo legame sia un legame dove la densità elettronica è

equamente distribuita sui 2 carboni.

Quindi la forza di legame e la natura degli atomi fanno variare la frequenza di assorbimento, ma la

frequenza di assorbimento dipende anche da quello che è legato agli atomi.

Ogni legame ha una regione di frequenza.

ES: Un legame C-H avrà una forza diversa da un legame C-C.

Succede quando all’interno del mio analita ho dei legami idrogeno.

Il legame idrogeno modifica la costante di forza f di entrambi i gruppi di atomi. Le bande dello

stretching di X-H e C=O si spostano a frequenze più basse. È come me se le masse oscillanti

aumentassero.

Ho un legame idrogeno quando ho un atomo di H che fa da ponte tra 2 eteroatomi

(elettronegatività elevata). Il principale esempio nelle macromolecole è il legame a idrogeno tra

OH e NH.

Se il legame è intramolecolare non dipende dalla concentrazione delle molecole, se è

intermolecolare scompare con la diluizione.

Le costanti di forza di tutti e due i legami in cui è coinvolto l’H risentono di questo atomo e

→ →

cambiano quindi le frequenze di assorbimento rivelate da IR abile nel rilevare legami H intra

e intermolecolari.

Se il legame idrogeno è intermolecolare per ridurre la probabilità di formazione del legame posso

diluire il mio analita. Se invece il legame è intramolecolare anche diluendo non cambia nulla.

La presenza di legami intra e intermolecolari anche in piccoli composti organici è diagnostica e

informativa sugli elementi funzionali e strutturali del composto stesso.

ES: una classe di composti organici che tipicamente formano legami idrogeno sono ad esempio gli

acidi carbossilici (in condizione di elevata concentrazione di questi devo diluire davvero tanto per

ridurre la probabilità di formazione).

La spettroscopia IR può essere fatta:

o Allo stato gassoso

o Allo stato liquido (maggior parte die casi, con campione sciolto in un solvente)

o Allo stato solido (con una tecnica articolare detta ATR)

Questo rappresenta la versatilità della tecnica, pur essendo debole. Posso infatti lavorare su

campioni che si trovano in stati della materia diversi.

L’IR è una tecnica che nei laboratori di controllo qualità delle aziende ha un’importanza

fondamentale: tante misure di controllo qualità di prodotti vengono fatte con un “semplice”

spettro IR.

LEGGERE UNO SPETTRO IR: 6

Una molecola molto semplice può avere uno

spettro IR molto complesso composto da

molte bande di assorbimento: l’analista

considera lo spettro IR come un "impronta

digitale" di un composto.

È estremamente improbabile che composti

diversi diano spettri uguali.

Tuttavia, ci sono delle bande caratteristiche

che denotano la presenza di un certo gruppo

funzionale. →

Nello spettro IR è possibile distinguere una regione particolare detta finger print proprietà di

rimanere immutata e costante indipendentemente dalle condizioni in cui lo spettro IR è stato

misurato.

Ci sono regioni di assorbimento (ES: OH, C=O…) che variano in funzione della condizione nella

quale il mio campione si trova quando faccio la misura (ES: campione concentrato, si ormano

legami H e cambiano le frequenze di assorbimento).

Quini tutte le bande di assorbimento al di fuori del finger print sono importanti perché sono quelle

a dare informazioni strutturali. Possono variare per:

- Intensità delle bande

- Numero d’onda

In funzione delle condizioni sperimentali alle quali io sto lavorando.

La regione dl finger print è una regione dello spettro IR che non cambia a seconda delle condizioni

sperimentali, non è informativa dal punto di vista strutturale perché ci sono troppi segnali

sovrapposti e quindi non posso distinguere il contributo di ogni legame, ma la combinazione dei

segnali e delle bande in questa regione ha la prerogativa di essere univoca per ogni composto: il

composto che misuro ha uno spettro nel finger print univoco ma da questo non traggo

informazioni.

A cosa serve? Serve a identificare univocamente un composto.

È molto importate nel controllo qualità.

ES: se il composto è un acido carbossilico (legami C=O e OH) ho una banda di assorbimento dove è

giallo e verde (nel grafico sopra).

SPETTRI TIPICI:

➢ Alcoli e fenoli:

Sono accumunati dal fatto di avere un gruppo O-H, questo a sua volta comporta la presenza del

legame C-O (singolo).

Stretching di O-H e C-O:

• -1

O-H: 3650-3580 cm banda larga possibilità di spostamento a frequenze più basse per

-1

formazione di legame ad idrogeno in soluzioni concentrate (fino a 3200 cm )

• -1

C-O: 1260-1000 cm m si può confondere con quello di altri gruppi funzionali

Il legame CO non dà sicurezza di avere alcol o fenoli, ma la sicurezza viene data dall’OH. 7

La profondità delle bande può variare anche in funzione del fattore di diluizione (composto puro o

composto sciolto in soluzione), mi poso aspettare shift della frequenza a seconda se ci siano

legami idrogeno o meno.

I legami C-H vibrano a frequenze più basse rispetto NH che hanno a loro volta frequenze inferiori a

OH (il range di assorbimento potrebbe anche parzialmente sovrapporsi) quello che cambia è

l’atomo a cui H è legato, variando la massa dell’atomo varia l’assorbimento.

In generale CH danno bande piuttosto strette e gli OH danno bande un po’ più ampie (panciute),

gli NH sono una situazione intermedia.

-1

Bending O-H: 1300-1200 cm

ES: ciclobutanolo

ES: cicloesanolo

➢ Aldeidi e chetoni:

Il gruppo funzionale caratteristico è C=O

• -1

Aldeidi: stretching di C=O a 1740-1720 cm -1

Stretching del C-H aldeidico: due bandine a 2850-2750 cm a destra della regione dei C-H alifatici

• -1

Chetoni: stretching di C=O a 1725-1705 cm

Assenza bandine C-H aldeidico.

È presente una parziale sovrapposizione, quindi la distinzione non è immediata.

La differenza fondamentale è che per le aldeidi abbiamo un legame caratteristico CH→CH

particolare, dove il C ha un doppio legame con O; infatti ha frequenze alte.

→

Si distingue abbastanza bene dai CH alifatici CH aleidico ha proprietà diverse.

ES: 2-butanone 8

Il butanone è un chetone, quindi mi aspetto di vedere lo stretching del C=O

ES: 2-metilpropanale

È un’aldeide, si vede il CH dell’aldeide

➢ Ammine:

I legami caratteristici sono i/il legami NH (1 o 2 a seconda che siano ammine primarie o

secondarie) e legami CN. Per le ammine terziarie l’NH non c’è.

Stretching di NH e CN:

• -1 -1

N-H: 3400-3500 cm : 2 bande per le primarie, 1 banda a 3420 cm per le secondarie,

nessuna per le terziarie. Parzialmente sovrapposta a quella dell’OH

• -1

C-N: 1200-1350 cm -1

Primarie: forte bending a 1550-1650 cm-1 e wagging 650-900 cm

Nelle ammine primarie mi aspetto 2 piccole bande (ho 2 NH), mentre nelle secondarie me ne

aspetto una sola.

ES: fenilammina

Questa è l’assorbimento caratteristico negli NH amminici. Le bande di assorbimento hanno

somiglianze ma anche differenze con gli OH. Innanzitutto, è diversa la frequenza (NH ha frequenza

più bassa) mentre il segnale è completamente diverso: per OH la banda è profonda e panciuta, per

→

NH è più stretta elemento che consente di distinguere banda di stretching di NH da quella di

OH. 9

Ci sono anche altre bande caratteristiche ma interessano relativamente perché possono essere in

sovrapposizione con altre bande.

Tutto ciò per fare un’analisi degli spettri IR qualitativi.

Uno spettroscopista tira fuori molte più informazioni ma non è il caso del nostro corso.

Nel caso di un’ammina terziaria NH non è presente e l’unica banda che permette di definire

l’ammina è il CN.

ES: dietilammina

È presente solo 1 banda di assorbimento nella regione di stretching NH perché è presente solo un

NH.

ES: N,N-dimetilanilina 10

➢ Acidi carbossilici e derivati:

I legami caratteristici sono C=O e O-H.

Stretching O-H e C=O:

• O-H: 2500-3300 cm-1 (range ampio rispetto ad alcoli e fenoli)

• C=O: 1710 cm-1 (nel caso di aldeidi e chetoni c’erano altri valori, rispetto a questi per acidi

→

carbossilici il range è molto più ristretto non è 1710 spaccato, se è 1715 va bene lo

stesso)

Gli acidi carbossilici sono tra i composti che maggiormente risentono agli IR della formazione dei

legami idrogeno.

Effetto del legame ad idrogeno su O-H e C=O, shift a frequenze minori passando dalla soluzione

alla fase gassosa (niente legami H).

ES: acido propionico dimero, in soluzione di CCl 4

ES: acido propionico dimero, in liquid film

Osservo sempre per l’acido propionico 2 spettri diversi:

• Banda OH pi&