Analisi di biomolecole

-CO-NH

Appena si rompono questi legami si otterranno due frammenti il primo neutro mentre l’altro

(l’unico da considerare perché rilevabile allo spettrometro) è carico. La carica può trovarsi in

uno qualsiasi dei due frammenti; quale dei due dipende dalla loro affinità relativa per il

protone.

I frammenti vengono convenzionalmente indicati con le lettere a,b o c se la carica è trattenuta

nel frammento N-Terminale e con le lettere x,y o z se la carica è mantenuta nel frammento C-

terminale. Il pedice indica il numero di residui amminoacidici contenuti nel frammento mentre

l’apice è talora utilizzato per indicare perdite neutre. Il sito di frammentazione più probabile è il

legame peptidico, cioè legame CO-NH, e quindi i frammenti carichi più probabili sono b e/o y.

La differenza di massa fra due ioni b o y adiacenti, dà la misura della massa di quel particolare

residuo amminoacidico.

Il secondo quadrupolo dello spettrometro di massa tandem usando la stessa logica rileva i

valori m/z di tutti i frammenti figlio, così fornendo del peptide analizzato un’impronta digitale

molto più affidabile di quella ottenibile con un spettrometro di massa ad un solo quadrupolo.

3)NMR ( SPETTROSCOPIA DI RISONANZA MAGNETICA NUCLEARE)

Dal nome possiamo dedurre che si vanno a valutare transizioni energetiche che riguardano i nuclei atomici.

L’NMR misura quindi l’assorbimento di radiazioni elettromagnetiche di frequenza raggio in molecole

immerse in un forte campo magnetico. Queste radiazioni provocano transizioni di spin nucleare in

particolari atomi (tipicamente isotopo 1H e 13C). Questa è una tecnica analitica strumentale che permette

di ottenere dettagliate informazioni sulla struttura molecolare di composti in esame, che viene dedotta

osservando il comportamento dei nuclei atomici. Essa infatti sfrutterà la differenza di energia che i vari

stadi di spin nucleare possono assumere in presenza di un campo magnetico.

Se volessimo analizzare questa tecnica partendo dalla natura degli spettri, possiamo valutare che qui ho

segnali più stretti (quindi ho delle righe non più delle bande). Facendo un confronto con la spettometria di

massa ad esempio ad ogni segnale corrisponde una molecola, qui invece ho tanti segnali quanti sono i

nuclei non equivalenti. Avremo quindi sull’asse y l’intensità e sull’asse x il chemical schift (che è uno dei

parametri caratterizzanti del segnale NMR.

Sono ben 3 parametri i parametri che caratterizzano il segnale:

1) Chemical shift -> frequenze di risonanza degli atomi presenti

2) Intensità e forma

3) L’integrale, ciascun segnale ha segnale specifico che è equivalente al numero di protoni.

Supponiamo di avere due protoni: un singoletto e un tripletto -> l’intensità viaria a seconda del numero di

intensità. Esempio di segnale di una molecola piccola e semplice :

INTRODUZIONE:

SPIN NUCLEARE

Partiamo dal nucleo: protoni e neutroni che possono essere associati a specie caricate che hanno

orientamenti diversi -> ruotano. In virtù proprio del fatto che ruotano si dice che hanno uno spin associato

a questo movimento. Il vettore momento angolare P è orientato lungo l’asse della rotazione; poiché

l’energia è quantizzata sarà caratterizzato da un modulo P e dipenderà dal numero quantico di spin I.

SCHEMATIZZANDO:

[ SPIN (nuclei ruotano; deriva dalla combinazione di protoni e neutroni) Momento Angolare orientato

lungo asse di rot è caratterizzato da MODULO P ed è dipendente dal NUMERO QUANTICO DI SPIN I (che

assume valori da 0 a ½ , 1 fino a 6)].

NB: - Se ho numero di protoni e neutroni è SPAIATO ho uno spin pari a 1/2 , quando non sono spaiati n

NUCLEO

interi. Inoltre se protoni e neutroni sono: ENTRAMBI PARI con SPIN=0 (ad esempio C e

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NUCLEO

0 non osservabili con NMR); gli uni PARI e gli altri DISPARI con SPIN=SEMI INTERO ( H

16 1

e C prediletti con NMR) ; ENTRAMBI DISPARI NUCLEO con SPIN INTERO (2H e 14N osservabili

13

con NMR).

- P ed I sono FISSI PER OGNI NUCLEO e non variano mai. Costituiscono infatti una proprietà

fondamentale della materia, come la carica elettrica o la massa -> grandezze fisiche k.

- Per l’analisi interessa spin a ½ perché e più facile fare la risonanza magnetica nucleare.

- Il momento angolare è proprio l’orientazione del nucleo in un vettore P rispetto ad una direzione

esterna z (sistema di riferimento). Anche la direzione è quantizzata ed il vettore P può assumere

solo : 2 + 1 orientazioni definite dal numero quantico di spin m. Il numero quantico m può

I

assumere i valori – I , - I+1,…., +I-1, +I.

- Per i nuclei con I=1/2 ci sono solo 2 possibili orientazioni e m vale- ½ o + ½ , quindi visibilmente si

può immaginare che il numero quantico di spin indichi il senso di rotazione del nucleo intorno al

proprio asse, specificando se questo gira in senso orario (-) oppure antiorario (+).

- Se ho ad esempio I = ½ ho due possibili orientazioni come abbiamo detto

- Se ho I > ½ I=1 e ho 3 possibili valori di m: +1, 0, -1

+-

Con NMR prediligiamo sempre I= ½ quali m ½ così da avere due sole orientazioni che coincidono in 2 stati

energetici possibili, se la rotazione è in senso orario (-) se è in senso antiorario. Si può fare NMR con I

diverso da ½ ma è più complesso poiché ciascuna orientazione che il mio nucleo può assumere porta ad

una transizione energetica-> complicando natura degli spettri -> difficoltà nell’interpretazione.

13

Nel caso del carbonio posso usare solo l’isotopo C perché è l’unico che non è radioattivo e anche se non è

molto abbondante è l’unico utilizzabile.

Stato di spin alfa e beta

Il nucleo atomico poiché è carico ed in movimento, genera un campo magnetico. Perciò ogni nucleo dotato

di spin si comporta come un piccolo magnete, è cioè dotato di un momento di dipolo magnetico µ. Quando

un nucleo dotato di spin viene immerso in un campo magnetico, il nucleo, come l’ago di una bussola, è

sottoposto ad una coppia di forze che lo fanno ruotare per allinearlo col campo magnetico esterno B . Le

0

possibili orientazioni che il nucleo può assumere in un campo magnetico sono governate dal numero

quantico m che può assumere valori da – I a + I.

Per ogni orientazione il numero quantico di spin m rappresenta la componente del vettore P lungo z, detta

P . Per i nuclei con spin ½ si ha:

Z. - Lo stato di spin con m = + ½ che è detto PARALLELO o stato α rispetto al piano z

- Lo stato di spin con m= - ½ che è detto ANTIPARALLELO o stato β rispetto al piano z

La relazione che intercorre tra il numero quantico m e Pz è: P= m x ħ (ħ = h/2π)

Momento magnetico di spin

Il nucleo essendo carico ed in movimento, genera un campo magnetico, perciò ogni nucleo si comporta

come un piccolo magnete, è cioè dotato di un momento di dipolo magnetico (o momento magnetico µ).

Questo momento magnetico è PROPORZIONALE al momento di spin P e ne ha la stessa direzione: il suo

modulo non varia, e per un nucleo con I= ½ Può assumere solo due orientazioni.

Nel caso di uno spin ½ come abbiamo detto ci saranno due possibili orientazioni una con m= - ½ e una con

m= + ½. Il momento magnetico nucleare µ non rimare fermo, ma continua ad oscillare attorno alla

direzione del campo magnetico B . I due stati possibili nel nucleo non hanno la stessa energia ma lo stato

0

con m=+ 1/2 indicato con α è ad energia leggermente più bassa rispetto a quello ad m= - ½ indicato con β.

Rapporto giromagnetico ϒ 

Esiste una proporzionalità diretta tra nucleo e P è regolata da questa costante. Costante di

proporzionalità tra il momento magnetico µ ed il momento di spin P è detta rapporto giromagnetico ed è

indicata con il simbolo ϒ . è definita come :

Il rapporto giromagnetico è una caratteristica intrinseca del nucleo, ed è diverso da nucleo a nucleo, e non

può essere previsto teoricamente, ma solo misurato. Per esempio, sarà molto maggiore per 1H rispetto al

13C.

Questo perché H rispetto a C:

- Ho la certezza con l’NMR di misurare l’isotopo 1H del 100 % perché gli altri non sono visti da questa

tecnica (NO spin attivi)

- Perché il C ha una visualizzazione atomica di circa 1%

- Il Protone ha rapporto giromagnetico di quasi 4 volte superiore rispetto al C

Questa proporzionalità è valida anche per le loro componenti lungo l’asse z (rispettivamente µz e Pz)

µ = yP = myħ

z z

È proprio in virtù del momento magnetico che il nucleo stesso può interagire con un campo magnetico

esterno. Anche la componente muz o B che va lungo z è direttamente proporzionale e determina la DE.

0

Risonanza Magnetica Nucleare

Quindi i due stati di spin α e β di un nucleo hanno la stessa energia, a meno che il nucleo non sia in un

campo magnetico.

In questo caso lo stato α possiede un’energia minore dello stato β, e diventa possibile un tipo di

spettroscopia che sfrutta il passaggio tra gli stati α e β del nucleo. Questo tipo di spettroscopia è detta

spettroscopia di risonanza magnetica nucleare. Quindi sfrutto l’NMR per andare a studiare lo stato di spin α

e di spin β del medesimo nucleo in caso di campo magnetico esterno.

Quindi l’equazione fondamentale dell’NMR è: ΔE = y ħ B questa equazione mette in relazione la

0

differenza di energia ΔE tra gli stati di spin α e β con il campo magnetico B ed il rapporto giromagnetico ϒ ,

0

è un equazione fondamentale per l’NMR. La DE è direttamente proporzionale al B perciò mentre nella

0

spettroscopia UV e IR la differenza di energia tra i due stati elettronici o vibrazionali è fissa, e dipende SOLO

dalla STRUTTURA della molecola, nell’NMR la differenza di energia tra gli stati nucleari è provocata dal

campo magnetico esterno, e può quindi essere variata. Infatti la differenza di energia tra gli stati di spin

aumenta all’aumentare di B .

0

A parità di campo magnetico, nuclei con ϒ grande assorbiranno a frequenza maggiore di nuclei con ϒ

piccolo. Qui la differenza di energia è molto piccola rispetto alle altre tecniche, per questo le frequenze

usate sono molto minori (MHz) e quindi nel campo delle radioonde, mentre le lunghezze d’onda sono

dell’ordine