Analisi di biomolecole

Analisi di biomolecole

Possibili domande raccolte fino a marzo 2016:

- Descrizione delle info strutturali ricavabili spettro IR

- Modi vibrazionali

- Maldi ed i suoi utilizzi

- Analizzatori Ms e Risoluzione

- Differenze tra ESI e MALDI 13

- Principali caratteristiche della spettroscopia C NMR

- Chemical shift

- Accoppiamento di spin 13

- Disaccoppiamento di spin C

- Risoluzione spettrometria di Massa

- BioNMR

Argomenti principali :

A. Spettroscopia infrarossa (IR)

B. Spettrometria di massa

C. Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR, MRI)

Spettroscopia = studia l’interazione fra la radiazione elettromagnetica (luce) e la materia, con assorbimento

della radiazione da parte di quest’ultima, si realizza attraverso l’osservazione di uno spettro.

Spettrometria = misura di uno spettro anche dal punto di vista quantitativo.

Esisteranno tre tipi di spettro:

1) Emissione continua -> la radiazione ottenuta sottoponendo ad essa un corpo che produce uno

spettro continuo che conterrà tutte le lunghezze d’onda elettromagnetiche, poiché in esso non

vivono interruzioni tra una radiazione e l’altra.

2) Emissione a righe o bande -> questo spettro viene ottenuto quando come sorgente ho un gas

rarefatto, a bassa densità e ad alta temperatura. Si tratta di uno spettro DISCONTINUO appunto a

righe o a bande.

3) Ad assorbimento -> mostra la frazione di inradiazione elettromagnetica che viene assorbita dalla

materia in un certo intervallo di frequenza. È il caso della spettroscopia IR .

Spettroscopia infrarossa

 Spettrofotometro IR è costituito da tre elementi:

1) La sorgente della radiazione

2) Comparto celle

3) Il monocromatore

4) Il rilevatore

5) Sistema di elaborazione dati

È la più semplice ma anche quella meno informativa. Possiamo identificare attraverso questa tecnica:

- Gruppi funzionali di un composto

- Unicità del composto (uno spettro è specifico per una determinata molecola).

Studia l’interazione quindi tra reazione elettromagnetica e la materia. La radiazione elettromagnetica è in

grado di indurre rotazione e vibrazione dei legami (che sono transizioni energetiche); questo ci permetterà

di dedurre che tipo di legami ci sono in una molecola.

La radiazione infrarossa cade tra il visibile e le microonde, e la regione che desta maggiore interesse per

-1

questa tecnica è quella compresa tra 4000 e 400 cm .

Si può suddividere infatti in: -1

- Vicino IR (1400/4000 cm )

-1

- Medio IR (4000/500 cm )

-1

- Lontano IR (500-20 cm )

Lo studio si basa su due differenti tipologie di energia: -1

a) Energia rotazionale = ha radiazione con frequenze minore al 100 cm e assorbita dalle molecole

organiche e convertita in energia rotazionale. L’ASSORBIMENTO è quantizzato quindi costituito da

linee separate. -1

b) Energia vibrazionale= invece ha radiazione con frequenze tra 1000/100 cm viene assorbita da una

molecola organica e convertita in energia vibrazionale. Assorbimento quantizzato ma lo spettro

vibrazionale presenta delle bande perché da una singola vibrazione dell’energia sono associati un

certo numero di livelli di energia rotazionale.

NB

Nella vibrazione molecolare dobbiamo andare a considerare i gradi di libertà. Supponiamo che una

molecola lineare privata di N atomi, in base all’orientamento lungo i tre assi cartesiani x,y e z sono

possibili 3n-5 diversi modi vibrazionali, mentre nel caso di una molecola non lineare 3n-6. Ciò

equivale a dire che ogni atomo ha 3 gradi di libertà di conseguenza il numero di gradi di livertà

posseduto dall’intera molecola è uguale a 3n e all’interno di questi valori ci saramnno tutti i

possibili movimenti compiuti dalla molecola ovvero: TRANSLAZIONI, ROTAZIONI E VIBRAZIONI.

I primi riguardano la molecola nel suo complesso, intesa come un corpo rigido che si muove lungo

le 3 traiettorie (quindi saranno 3 i gradi di libertà translazionale). I secondi sono sempre 3 ma nel

caso di molecole lineari sono 2 (perché abbiamo bidimensionalità). Gli ultimi li ricaviamo

SOTTRAENDO i gradi di libertà totali 3n alla somma tra rotazionali e traslazionali quindi :

 Gradi di libertà Vibrazionali (molecole non lineari) = 3n – (3+3) (ad esempio H O)

2

 Gradi di libertà vibrazionali (molecole lineari )= 3n – (3+2) (ad esempio CO )

2

I modi vibrazionali molecolari sono, se irradio il mio campione con lo spettro possono passare 2 tipi

di vibrazione:

- Streching (stiramento) -> movimento ritmico lungo l’asse di legame con conseguente aumento e

diminuzione della distanza atomica

- Bending (piegamento)-> è dovuta a variazione dell’angolo di legame con un atomo di comune o ad

un movimento di un gruppo di atomi.

Le frequenze di stretching sono in generale più alte delle corrispondenti frequenze di bending.

Inoltre la deformazione può essere di varia natura:

- Simmetrica sul piano -> SCISSORING (chiusura e apertura forbice)

- Asimmetrica sul piano -> ROCKING (oscillazione)

- Simmetrica fuori dal piano -> TWISTING (torsione)

- Asimmetrica fuori dal piano -> WAGGING (agitamento)

Legge di Hooke: è la legge dell’oscillazione armonica, che ci permette di prevedere la frequenza alla

quale un certo gruppo funzionale presente nella molecola assorbirà.

Dove:

M x e M y rappresentano la massa della molecola x e y. Se [()*] aumenta all’aumentare della massa dei

due atomi, e in questo caso la v (frequenza di vibrazione) diminuisce. Se invece f (costanza di forza del

legame può essere indicata anche con k) aumenta V aumenta, e aumenta con la differenza di

elettronegatività degli atomi di legame. Quindi maggiore è la massa ridotto minoare è la grequenza di

assorbimento perché minore è la costante di forza che ne risulta. Passando dal legame C-H al legame C-

C la frequenza diminuirà. Il legame ad H da info in più perché altera la costante di forza e gli equilibri ->

perché quando ho questo legame ho 1 H che sarà legato ad un atomo molto più elettronegativo di lui.

Se ad esempio ho: X-H ***O=C

Le bande di assorbimento quindi di X-H e OH schiftano e possiamo dedurre la presenza di questo

legame. Il legame infatti ad un H hanno frequenze maggiori che se legati ad atomi più pesanti. Carboni

con tripli legami hanno frequenze maggiori di quelli con doppi legami, i quali hanno frequenze maggiori

di quelli con legami semplici.

Le frequenze di assorbimento dipendono da:

- Masse relative degli atomi

- K di forza dei legami

- Geometria degli atomi

Dipendono poi legami:

- C-c

- C-H

- O-H

Il grafico che ne viene fuori da questa analisi è un grafico che ha 2 dimensioni:

-1 4

- Ascissa = numero di onda U, di cui l’unità di misura è cm : U= 1x10 su lunghezza d’onda.

- Ordinate= possono esserci 2 grandezze TRASMITTANZA (porzione di luce incidente che utilizzo per

raggiungere il mio campione) T=I /I , ASSORBANZA (luce trattenuta del campione) A=Log (1/T).

0 0

Cosa influenza la frequenza di assorbimento

1) Legame ad H: perché questo modifica la costante di forza di entrambi i gruppi perciò vengono

alterate le frequenze di vibrazione sia dello stretching che del bending più precisamente si osserva

un generale spostamento delle frequenze verso valori più bassi, cosa che porta a bande più intense

e allargate.

2) Effetto induttivo dei gruppi: quelli elettronattrattori spostano gli assorbimenti delle frequenze a

frequenze minori (cosa che si verifica per lo più in sistemi con doppi e tripli legami, questo perché a

causa del depauperamento elettronico il doppio legame perde parte del carattere dell’orbitale pi

greco e acquista caratteristiche del singolo legame. E quelli elettrondonatori spostano gli

assorbimenti a frequenze maggiori

3) Coniugazione: produce una delocalizzazione degli elettroni pi greco riducendo il carattere di doppio

-1

legame e spostando le frequenze a valori più bassi di crica 10-15 cm

4) Effetti sterici e di tensione d’anello: in composti con isomeri ramificati o ciclici la tensione

dell’angolo di legame è variabile e questo si ripercuote sulla forza di legame. Al crescere della

tensione, la frequenza di assorbimento si sposta verso valori maggiori. Quindi l’aumento della

tensione dell’anello è direttamente proporzionale all’aumento della frequenza di assorbimento.

Parametri che caratterizzano uno spettro di assorbimento?

a) Posizione: legata all’energia della vibrazione, la posizione di una banda viene indicata i numero

-1

d’onda v (cm ). La v dipende dalla costante di forza del legame interessato: più rigido è il legame

max

dello stato fondamentale, quanto maggiore è l’energia necessaria per amplificare le vibrazioni.

b) Intensità: è legata all’efficienza nel trasferimento di energia, cioè all’altezza del picco, esprimendo

la probabilità che avvenga la transizione energetica dallo stato fondamentale a quello eccitato (da

parte del gruppo funzionale) che provoca l’assorbimento. Questa dipenderà strettamente dal

momento dipolare (ad esempio il carbonile che ha un forte momento dipolare varia in modo

sensibile, fornisce di solito bande molto intense). Ricordiamo che infatti le bande sono classificate

in forti medie e deboli a seconda dell’intensità.

c) Forma: è legata all’interazione del gruppo funzionale con l’intorno:

- Gruppo funzionale isolato = banda stretta

- Gruppo funzionale con forti interazioni= banda larga

Questa potrà risentire dell’unità scelta per la registrazione: lunghezza d’onda o numero d’onda.

Leggere uno spettro IR: ci sarà una ragione dello spettro dove avvengono transizioni che non possono

essere direttamente correlati ma sono univoche per ogni composto -> dandoci univocità della

molecola. È molto utile per identificare un composto vero e proprio, ma non per identificare 2 gruppi

funzionali. Una molecola molto semplice può avere uno spettro IR molto complesso composto da

bande di assorbimento. L’analista considera lo spettro IR come un impronta digitale di un composto. È

molto improbabile che composti diversi diano spettri uguali. Tuttavia ci sono delle bande caratteristiche

che denotano la presenza di un certo gruppo funzionale. Potrò però fare una prima divisione grossolana

dello spettro IR separando in 2 zone ovvero :

 -1

una zona dei gruppi funzionali compresa tra i 4400-1700 cm

 -1

una zona dell’impronta digitale minore di 1400 cm

Successivamente vado a considerare invece le singole zone nello specifico, analizzandole come descritto

sotto:

a) Zona verde sono solitamente zone di stretching del legame X-H (x atomo generico)

b) Zona celeste frequenze di stretching e tripli legami

c) Zona gialla frequenze di stretching e doppi legami

-1

d) Zona fucsia tra 1300 e 900 cm stretching dei legami singoli X-Y o zona dell’impronta digitale della

molecola, che deriva dal fatto che le varie deformazioni, interagendo tra loro si combinano dando

luogo ad una serie di bande che determinano appunto l’impronta digitale della molecola

-1

e) Zona fucsia < 1000 cm bending fuori dal piano H-X

Cosa non posso analizzare con questa tecnica?

1) Non posso ricavare la struttura del composto che sto analizzando

2) Non mi permette di determinare quali gruppi funzionali si trovano all’interno dell’analita

3) La probabilità che due composti abbiano lo stesso spettro IR è pari a 0.

Cosa posso analizzare con questa tecnica?

Tutte le classe molecolari, ed in particolare studiar le proteine, identifica strumenti di struttura

secondaria e seguire le macromolecole e le Fluttuazioni che possono avvenire per Folding e Unfoldind

Proteico. Riusciamo ad identificare attraverso gli spettri IR (ass/u) delle proteine, e anche i legami di

stretching (CO) e bending (NH) che sono coinvolti nella struttura secondaria e la loro frequenza di

vibrazione dipende dalla struttura secondaria. Facendo poi la derivata seconda, posso avere maggiori

informazioni, nella regione dell’Amide i si distinguono contributi dei diversi tipi di struttura secondaria

(alfa e beta) e degli aggregati (beta molecolari). Inoltre elica e random coil hanno contributi sovrapposti

(per poterli distinguere dovrò utilizzare acqua deuterata. Inoltre posso anche rilevare la denaturazione

termica di una proteina.

Assorbimento e classi molecolari

- Stiramenti dei legami C-H: che avranno sicuramente un valore più alto negli alchini poiché avendo

un triplo legame i 2 C ci sarà ibridazione sp che ha geometria sferica ed è più corto rispetto al p che

è bilobato ed è più forte (ciò darà al legame c-h un valore in termini di numero d’onda più elevato

-1

tra i 3200-3000 cm ). -1

Nelle aldeidi risuona a valori più bassi di circa 2720 cm .

- Nitrili: nel caso di questi hanno bande più elevate rispetto agli alchini per la presenza di azoto.

-1

- Zona dell’aromatico: è una zona sgombra quella in cui ricadono (2000/1800-1650 cm ) e sono

facilmente identificabili le cosi dette DITA DELL’AROMATICO, costituite da 2,3 bande. Ogni sostanza

che ha al suo interno un nucleo benzenico da luogo a tali bande non permesse per simmetria con

DV superiore ad 1 piuttosto intense. Queste sono bande multiple di altre presenti a 1000 o a 500 e

sono relative a vibrazioni di scheletro C-C.

- Banda dei carbonili (1850-1700): è molto evidente poiché questo gruppo finzionale è caratteristico

di molte molecole per determinare l’esatta natura del composto è necessario considerare delle

bande d’appoggio. Di solito infatti la forza di legame del carbonile è influenzata dal sostituente

legato al C infatti esso può avere un effetto induttivo, che ne riduce la lunghezza aumentando così

la sua k e la frequenza di assorbimento e un effetto coniugativo o di risonanza che aumenta la

lunghezza del legame e ne riduce la frequenza di assorbimento. Lo stiramento del gruppo C-O da

-1

luogo ad una banda di assorbimento nella zona 1300-1000 cm . Queste bande posso osservale sia

con eteri che con gli alcoli. Nel primo caso si osserva una banda se l’etere è simmetrico due se è

asimmetrico; nel caso degli alcoli la posizione della banda se unica ci aiuta a dire se l’alcol è

primario secondario o terziario ( primario 1000-1080; secondario 1080-1130; terziasio 1130-1200).

2)Spettrometria di massa

È una tecnica analitica applicata all’identificazione di composti sconosciuti. Solitamente viene usata in

combinazione con tecniche di tipo separativa quali la GAS-CROMATOGRAFIA e l’HPLC. Possiamo grazie

a questa tecnica distinguere tra diverse formule brute possibili ( e in particolare i picchi isotopici ad

esempio di cloro e bromo).

Il principio su cui si basa è la possibilità di separare una miscela di ioni in funzione del loro rapporto

M/Z generalmente mediante l’uso di CAMPI MAGNETICI STATICI o OSCILLANTI.

Spettrometro di massa con risoluzione maggiore= riesce a distinguere le masse fino al 4° grado

decimale, cosi determinano la formula bruta (ogni formula bruta -> composto diverso).

Con questa tecnica posso avere informazioni su:

- Massa del composto (le molecole dell’analita vengono ionizzate e gli ioni Analizzati, cioè separati, in

base al rapporto m/z)

- Informazioni sulla struttura molecolare (attraverso la caratterizzazione dei meccanismi di

frammentazione delle molecole)

- Formula bruta degli analiti (misurando lo spettro di massa ad alta risoluzione) analisi elementare

non più necessaria.

Strumentazione:

a) Sorgente di ioni: che può convertire molecole di campione in fase gassosa in ioni (o nel caso di

ionizzazione via elettro-spray, spostare ioni presenti in soluzione nella fase gassosa).

b) Analizzatore di massa: che separa e ordina gli ioni in base alle loro masse mediante l’applicazione di

campi elettromagnetici, in funzione del rapporto m/z.

c) Detector o rilevatore: che si occupa di misurare il valore di un indicatore in modo quantitativo e

quindi fornisce i dati per calcolare le abbondanze di ciascuna specie di ioni.

Procedimento:

1) Si introduce il campione e subisce vaporizzazione

2) Le componenti del campione vengono ionizzate attraverso una varietà di metodi (per esempio, da

un impatto con un fascio di elettroni) e si determina la formazione di particelle cariche, o ioni

(ionizzazione).

3) Gli ioni vengono separati in base al loro rapporto m/z all’interno dell’analizzatore, attraverso

l’applicazione di opportuni campi elettromagnetici. La separazione può essere di due tipi:

- O fanno arrivare gli ioni con una determinata m/z

- O fanno cadere gli ioni con m/z diversa in tempi diversi, e dedurrò la massa a seconda del tempo

che impiega ad arrivare sul Detector.

4) Gli ioni vengono rilevati, solitamente con un metodo quantitativo da un Detector. Nel detector c’è

un amplificatore di segnale che lo converte da ANALOGICO->DIGITALE. Ogni picco è uno specifico

rapporto m/z. Da un composto si possono generare uno o più ioni molecolari entrambi sono

rappresentati oltre al picco dello ione molecolare atteso per CO .

2

5) Il segnale viene trasformato in uno spettro di massa degli ioni

Lo spettro di massa -> è un grafico contenente barre verticali, in cui ogni barra rappresenta uno ione

avente un determinato rapporto massa-carica (m/z) e la lunghezza della barra indica la relativa

abbondanza dello ione.

Quello più abbondante ha come assegnazione un’abbondanza di 100 e la sua barra è indicata come il

picco di base. La maggior parte degli ioni prodotti in uno spettrometro di massa sono mono-carica e in

questo caso il rapporto m/z ovviamente sarà pari alla massa.

Risoluzione: è necessaria a separare due picchi