Analisi di biomolecole

Analisi di biomolecole

Possibili domande raccolte fino a marzo 2016

• Descrizione delle info strutturali ricavabili spettro IR
• Modi vibrazionali
• MALDI ed i suoi utilizzi
• Analizzatori MS e risoluzione
• Differenze tra ESI e MALDI
• Principali caratteristiche della spettroscopia C NMR
• Chemical shift
• Accoppiamento di spin
• Disaccoppiamento di spin C
• Risoluzione spettrometria di massa
• BioNMR

Argomenti principali

• A. Spettroscopia infrarossa (IR)
• B. Spettrometria di massa
• C. Spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR, MRI)

Spettroscopia studia l'interazione fra la radiazione elettromagnetica (luce) e la materia, con assorbimento della radiazione da parte di quest'ultima, si realizza attraverso l'osservazione di uno spettro.

Spettrometria misura uno spettro anche dal punto di vista quantitativo.

Tre tipi di spettro

• Emissione continua -> La radiazione ottenuta sottoponendo ad essa un corpo che produce uno spettro continuo che conterrà tutte le lunghezze d'onda elettromagnetiche, poiché in esso non vivono interruzioni tra una radiazione e l'altra.
• Emissione a righe o bande -> Questo spettro viene ottenuto quando come sorgente ho un gas rarefatto, a bassa densità e ad alta temperatura. Si tratta di uno spettro discontinuo appunto a righe o a bande.
• Ad assorbimento -> Mostra la frazione di inradiazione elettromagnetica che viene assorbita dalla materia in un certo intervallo di frequenza. È il caso della spettroscopia IR.

Spettroscopia infrarossa

Lo spettrofotometro IR è costituito da tre elementi:

• La sorgente della radiazione
• Comparto celle
• Il monocromatore
• Il rilevatore
• Sistema di elaborazione dati

È la più semplice ma anche quella meno informativa. Possiamo identificare attraverso questa tecnica:

• Gruppi funzionali di un composto
• Unicità del composto (uno spettro è specifico per una determinata molecola)

Studia l'interazione quindi tra reazione elettromagnetica e la materia. La radiazione elettromagnetica è in grado di indurre rotazione e vibrazione dei legami (che sono transizioni energetiche); questo ci permetterà di dedurre che tipo di legami ci sono in una molecola.

La radiazione infrarossa cade tra il visibile e le microonde, e la regione che desta maggiore interesse per questa tecnica è quella compresa tra 4000 e 400 cm^-1.

Sottodivisione dello spettro IR

• Vicino IR (1400/4000 cm^-1)
• Medio IR (4000/500 cm^-1)
• Lontano IR (500-20 cm^-1)

Lo studio si basa su due differenti tipologie di energia:

• Energia rotazionale = ha radiazione con frequenze minore al 100 cm^-1 e assorbita dalle molecole organiche e convertita in energia rotazionale. L'assorbimento è quantizzato quindi costituito da linee separate.
• Energia vibrazionale = ha radiazione con frequenze tra 1000/100 cm^-1 viene assorbita da una molecola organica e convertita in energia vibrazionale. Assorbimento quantizzato ma lo spettro vibrazionale presenta delle bande perché da una singola vibrazione dell'energia sono associati un certo numero di livelli di energia rotazionale.

Nella vibrazione molecolare dobbiamo andare a considerare i gradi di libertà. Supponiamo che una molecola lineare privata di N atomi, in base all'orientamento lungo i tre assi cartesiani x,y e z sono possibili 3n-5 diversi modi vibrazionali, mentre nel caso di una molecola non lineare 3n-6. Ciò equivale a dire che ogni atomo ha 3 gradi di libertà di conseguenza il numero di gradi di libertà posseduto dall'intera molecola è uguale a 3n e all'interno di questi valori ci saranno tutti i possibili movimenti compiuti dalla molecola ovvero: traslazioni, rotazioni e vibrazioni.

I primi riguardano la molecola nel suo complesso, intesa come un corpo rigido che si muove lungo le 3 traiettorie (quindi saranno 3 i gradi di libertà translazionale). I secondi sono sempre 3 ma nel caso di molecole lineari sono 2 (perché abbiamo bidimensionalità).

Gli ultimi li ricaviamo sottraendo i gradi di libertà totali 3n alla somma tra rotazionali e traslazionali quindi:

• Gradi di libertà vibrazionali (molecole non lineari) = 3n - (3+3) (ad esempio H₂O)
• Gradi di libertà vibrazionali (molecole lineari) = 3n - (3+2) (ad esempio CO₂)

Modi vibrazionali molecolari

Se irradio il mio campione con lo spettro possono passare 2 tipi di vibrazione:

• Stretching (stiramento) -> Movimento ritmico lungo l'asse di legame con conseguente aumento e diminuzione della distanza atomica
• Bending (piegamento) -> È dovuta a variazione dell'angolo di legame con un atomo di comune o ad un movimento di un gruppo di atomi. Le frequenze di stretching sono in generale più alte delle corrispondenti frequenze di bending.

Inoltre la deformazione può essere di varia natura:

• Simmetrica sul piano -> Scissoring (chiusura e apertura forbice)
• Asimmetrica sul piano -> Rocking (oscillazione)
• Simmetrica fuori dal piano -> Twisting (torsione)
• Asimmetrica fuori dal piano -> Wagging (agitamento)

Legge di Hooke

È la legge dell'oscillazione armonica, che ci permette di prevedere la frequenza alla quale un certo gruppo funzionale presente nella molecola assorbirà.

Dove M_x e M_y rappresentano la massa della molecola x e y. Se [()*] aumenta all'aumentare della massa dei due atomi, e in questo caso la v (frequenza di vibrazione) diminuisce. Se invece f (costanza di forza del legame può essere indicata anche con k) aumenta V aumenta, e aumenta con la differenza di elettronegatività degli atomi di legame. Quindi maggiore è la massa ridotto minore è la frequenza di assorbimento perché minore è la costante di forza che ne risulta. Passando dal legame C-H al legame C-C la frequenza diminuirà. Il legame ad H da info in più perché altera la costante di forza e gli equilibri -> perché quando ho questo legame ho 1 H che sarà legato ad un atomo molto più elettronegativo di lui.

Se ad esempio ho: X-H ***O=C, le bande di assorbimento quindi di X-H e OH shiftano e possiamo dedurre la presenza di questo legame. Il legame infatti ad un H hanno frequenze maggiori che se legati ad atomi più pesanti. Carboni con tripli legami hanno frequenze maggiori di quelli con doppi legami, i quali hanno frequenze maggiori di quelli con legami semplici.

Le frequenze di assorbimento dipendono da:

• Masse relative degli atomi
• K di forza dei legami
• Geometria degli atomi

Dipendono poi legami:

• C-C
• C-H
• O-H

Il grafico che ne viene fuori da questa analisi è un grafico che ha 2 dimensioni:

• Ascissa = numero di onda U, di cui l'unità di misura è cm^-1: U= 1x10⁴ su lunghezza d'onda.
• Ordinate= possono esserci 2 grandezze trasmittanza (porzione di luce incidente che utilizzo per raggiungere il mio campione) T=I₀/I₀, assorbanza (luce trattenuta del campione) A=Log (1/T).

Cosa influenza la frequenza di assorbimento

1. Legame ad H: perché questo modifica la costante di forza di entrambi i gruppi perciò vengono alterate le frequenze di vibrazione sia dello stretching che del bending più precisamente si osserva un generale spostamento delle frequenze verso valori più bassi, cosa che porta a bande più intense e allargate.
2. Effetto induttivo dei gruppi: quelli elettronattrattori spostano gli assorbimenti delle frequenze a frequenze minori (cosa che si verifica per lo più in sistemi con doppi e tripli legami, questo perché a causa del depauperamento elettronico il doppio legame perde parte del carattere dell'orbitale p greco e acquista caratteristiche del singolo legame. E quelli elettrondonatori spostano gli assorbimenti a frequenze maggiori.
3. Coniugazione: produce una delocalizzazione degli elettroni p greco riducendo il carattere di doppio legame e spostando le frequenze a valori più bassi di circa 10-15 cm^-1.
4. Effetti sterici e di tensione d'anello: in composti con isomeri ramificati o ciclici la tensione dell'angolo di legame è variabile e questo si ripercuote sulla forza di legame. Al crescere della tensione, la frequenza di assorbimento si sposta verso valori maggiori. Quindi l'aumento della tensione dell'anello è direttamente proporzionale all'aumento della frequenza di assorbimento.

Parametri che caratterizzano uno spettro di assorbimento

• Posizione: legata all'energia della vibrazione, la posizione di una banda viene indicata in numero d'onda v (cm^-1). La v dipende dalla costante di forza del legame interessato: più rigido è il legame dello stato fondamentale, quanto maggiore è l'energia necessaria per amplificare le vibrazioni.
• Intensità: è legata all'efficienza nel trasferimento di energia, cioè all'altezza del picco, esprimendo la probabilità che avvenga la transizione energetica dallo stato fondamentale a quello eccitato (da parte del gruppo funzionale) che provoca l'assorbimento. Questa dipenderà strettamente dal momento dipolare (ad esempio il carbonile che ha un forte momento dipolare varia in modo sensibile, fornisce di solito bande molto intense). Ricordiamo che infatti le bande sono classificate in forti medie e deboli a seconda dell'intensità.
• Forma: è legata all'interazione del gruppo funzionale con l'intorno:
  • Gruppo funzionale isolato = banda stretta
  • Gruppo funzionale con forti interazioni= banda larga

Questa potrà risentire dell'unità scelta per la registrazione: lunghezza d'onda o numero d'onda.

Leggere uno spettro IR

Ci sarà una ragione dello spettro dove avvengono transizioni che non possono essere direttamente correlati ma sono univoche per ogni composto -> dandoci univocità della molecola. È molto utile per identificare un composto vero e proprio, ma non per identificare 2 gruppi funzionali. Una molecola molto semplice può avere uno spettro IR molto complesso composto da bande di assorbimento. L'analista considera lo spettro IR come un'impronta digitale di un composto. È molto improbabile che composti diversi diano spettri uguali. Tuttavia ci sono delle bande caratteristiche che denotano la presenza di un certo gruppo funzionale. Potrò però fare una prima divisione grossolana dello spettro IR separando in 2 zone ovvero:

• Una zona dei gruppi funzionali compresa tra i 4400-1700 cm^-1
• Una zona dell'impronta digitale minore di 1400 cm^-1

Successivamente vado a considerare invece le singole zone nello specifico, analizzandole come descritto sotto:

• Zona verde sono solitamente zone di stretching del legame X-H (x atomo generico)
• Zona celeste frequenze di stretching e tripli legami
• Zona gialla frequenze di stretching e doppi legami
• Zona fucsia tra 1300 e 900 cm^-1 stretching dei legami singoli X-Y o zona dell'impronta digitale della molecola, che deriva dal fatto che le varie deformazioni, interagendo tra loro si combinano dando luogo ad una serie di bande che determinano appunto l'impronta digitale della molecola
• Zona fucsia < 1000 cm^-1 bending fuori dal piano H-X

Cosa non posso analizzare con questa tecnica?

• Non posso ricavare la struttura del composto che sto analizzando
• Non mi permette di determinare quali gruppi funzionali si trovano all'interno dell'analita
• La probabilità che due composti abbiano lo stesso spettro IR è pari a 0.

Cosa posso analizzare con questa tecnica?

• Tutte le classi molecolari, ed in particolare studiare le proteine, identificare strumenti di struttura secondaria e seguire le macromolecole e le fluttuazioni che possono avvenire per folding e unfolding proteico.
• Riusciamo ad identificare attraverso gli spettri IR (ass/u) delle proteine, e anche i legami di stretching (CO) e bending (NH) che sono coinvolti nella struttura secondaria e la loro frequenza di vibrazione dipende dalla struttura secondaria.
• Facendo poi la derivata seconda, posso avere maggiori informazioni, nella regione dell'amide I si distinguono contributi dei diversi tipi di struttura secondaria (alfa e beta) e degli aggregati (beta molecolari). Inoltre elica e random coil hanno contributi sovrapposti (per poterli distinguere dovrò utilizzare acqua deuterata).
• Inoltre posso anche rilevare la denaturazione termica di una proteina.

Assorbimento e classi molecolari

• Stiramenti dei legami C-H: che avranno sicuramente un valore più alto negli alchini poiché avendo un triplo legame i 2 C ci sarà ibridazione sp che ha geometria sferica ed è più corto rispetto al p che è bilobato ed è più forte (ciò darà al legame C-H un valore in termini di numero d'onda più elevato tra i 3200-3000 cm^-1).
• Nelle aldeidi risuona a valori più bassi di circa 2720 cm^-1.
• Nitrili: nel caso di questi hanno bande più elevate rispetto agli alchini per la presenza di azoto.
• Zona dell'aromatico: è una zona sgombra quella in cui ricadono (2000/1800-1650 cm^-1) e sono facilmente identificabili le cosiddette dita dell'aromatico, costituite da 2,3 bande. Ogni sostanza che ha al suo interno un nucleo benzenico dà luogo a tali bande non permesse per simmetria con DV superiore ad 1 piuttosto intense. Queste sono bande multiple di altre presenti a 1000 o a 500 e sono relative a vibrazioni di scheletro C-C.
• Banda dei carbonili (1850-1700): è molto evidente poiché questo gruppo funzionale è caratteristico di molte molecole per determinare l'esatta natura del composto è necessario considerare delle bande d'appoggio. Di solito infatti la forza di legame del carbonile è influenzata dal sostituente legato al C infatti esso può avere un effetto induttivo, che ne riduce la lunghezza aumentando così la sua k e la frequenza di assorbimento e un effetto coniugativo o di risonanza che aumenta la lunghezza del legame e ne riduce la frequenza di assorbimento. Lo stiramento del gruppo C-O dà luogo ad una banda di assorbimento nella zona 1300-1000 cm^-1. Queste bande posso osservarle sia con eteri che con gli alcoli. Nel primo caso si osserva una banda se l'etere è simmetrico due se è asimmetrico; nel caso degli alcoli la posizione della banda se unica ci aiuta a dire se l'alcol è primario secondario o terziario (primario 1000-1080; secondario 1080-1130; terziario 1130-1200).

Spettrometria di massa

È una tecnica analitica applicata all'identificazione di composti sconosciuti. Solitamente viene usata in combinazione con tecniche di tipo separativa quali la gas-cromatografia e l'HPLC. Possiamo grazie a questa tecnica distinguere tra diverse formule brute possibili (e in particolare i picchi isotopici ad esempio di cloro e bromo).

Il principio su cui si basa è la possibilità di separare una miscela di ioni in funzione del loro rapporto M/Z generalmente mediante l'uso di campi magnetici statici o oscillanti.

Spettrometro di massa con risoluzione maggiore = riesce a distinguere le masse fino al 4° grado decimale, così determinano la formula bruta (ogni formula bruta -> composto diverso).

Con questa tecnica posso avere informazioni su:

• Massa del composto (le molecole dell'analita vengono ionizzate e gli ioni analizzati, cioè separati, in base al rapporto m/z)
• Informazioni sulla struttura molecolare (attraverso la caratterizzazione dei meccanismi di frammentazione delle molecole)
• Formula bruta degli analiti (misurando lo spettro di massa ad alta risoluzione) analisi elementare non più necessaria.

Strumentazione

• Sorgente di ioni: che può convertire molecole di campione in fase gassosa in ioni (o nel caso di ionizzazione via elettro-spray, spostare ioni presenti in soluzione nella fase gassosa).
• Analizzatore di massa: che separa e ordina gli ioni in base alle loro masse mediante l'applicazione di campi elettromagnetici, in funzione del rapporto m/z.
• Detector o rilevatore: che si occupa di misurare il valore di un indicatore in modo quantitativo e quindi fornisce i dati per calcolare le abbondanze di ciascuna specie di ioni.

Procedimento

1. Si introduce il campione e subisce vaporizzazione.
2. Le componenti del campione vengono ionizzate attraverso una varietà di metodi (per esempio, da un impatto con un fascio di elettroni) e si determina la formazione di particelle cariche, o ioni (ionizzazione).
3. Gli ioni vengono separati in base al loro rapporto m/z all'interno dell'analizzatore, attraverso l'applicazione di opportuni campi elettromagnetici. La separazione può essere di due tipi:
   • O fanno arrivare gli ioni con una determinata m/z
   • O fanno cadere gli ioni con m/z diversa in tempi diversi, e dedurrò la massa a seconda del tempo che impiega ad arrivare sul detector.
4. Gli ioni vengono rilevati, solitamente con un metodo quantitativo da un detector. Nel detector c'è un amplificatore di segnale che lo converte da analogico->digitale. Ogni picco è uno specifico rapporto m/z. Da un composto si possono generare uno o più ioni molecolari entrambi sono rappresentati oltre al picco dello ione molecolare atteso per CO₂.
5. Il segnale viene trasformato in uno spettro di massa degli ioni.

Lo spettro di massa -> è un grafico contenente barre verticali, in cui ogni barra rappresenta uno ione avente un determinato rapporto massa-carica (m/z) e la lunghezza della barra indica la relativa abbondanza dello ione. Quello più abbondante ha come assegnazione un'abbondanza di 100 e la sua barra è indicata come il picco di base. La maggior parte degli ioni prodotti in uno spettrometro di massa sono mono-carica e in questo caso il rapporto m/z ovviamente sarà pari alla massa.