Analisi di biomolecole

Analisi di biomolecole

Esame scritto

(Molecola + spettro da assegnare 10pt e 3 domande di teoria 7pt/ciascuna), teoria + esercitazioni (interpretazione spettri per esame), fine prima di Natale (21-11 no lezione). Possibilità di visionare strumenti e lavoro in lab un pomeriggio (facoltativa).

Introduzione alla spettroscopia e spettrometria

Spettroscopia vs spettrometria: la spettrometria è la misura di uno spettro, anche dal punto di vista quantitativo. La spettroscopia, invece, è l’indagine dell’interazione fra una radiazione elettromagnetica e un campione. Da questa osservazione si derivano delle proprietà chimico fisiche del campione stesso. Nella spettrometria di massa non si usa una radiazione elettromagnetica, per cui non è una spettroscopia. È importante considerare l'energia associata alla radiazione, onde radio (λ maggiore, E minore). L’NMR utilizza le onde radio. Queste sono innocue e lasciano il campione intatto post analisi. Gli IR, più energetici, danno sensazione di calore giocando su vibrorotazioni di legami chimici. Considerare l’energia trasferita al campione durante l’analisi, potrebbero danneggiarlo (x-ray).

Spettroscopia IR – spettroscopia vibrazionale

Gli infrarossi si trovano nella porzione di spettro elettromagnetico compreso fra il visibile e le onde radio. Questa regione può essere divisa in IR vicino (14000-4000 cm^-1), medio (4000-500 cm^-1) e lontano (500-20 cm^-1), essi vengono usati per osservare i diversi modi vibrazionali delle molecole. La radiazione IR con frequenza inferiore a 100 cm^-1 viene assorbita da una molecola organica e convertita in energia rotazionale (assorbimento quantizzato), lo spettro rotazionale è costituito da bande separate. La radiazione IR con frequenza compresa fra 10000 e 100 cm^-1 viene assorbita da una molecola e convertita in energia vibrazionale (anche in questo caso l’energia assorbita è quantizzata). In aggiunta, mentre i legami vibrano, c’è anche rotazione e ogni moto vibrazionale sottintende un movimento rotazionale. Lo spettro non avrà più delle bande separate di assorbimento, sarà una curva di assorbimento. Le regioni utilizzate nella spettroscopia IR sono proprio queste, in particolare quelle comprese fra 4000 e 400 cm^-1.

Le frequenze di assorbimento, inoltre, dipendono dalle masse relative degli atomi (diverse se C-C, C-O e C-N), dalla costante di forza del legame (C-C, C=C ecc.) e dalla geometria degli atomi (geometria degli angoli di legame, ovvero lineare, tetraedrica ecc.). Le posizioni delle bande sullo spettro sono indicate sull’asse delle ascisse attraverso il numero d’onda, definito come il reciproco della lunghezza d’onda e viene espresso in cm^-1 (in questo modo il numero d’onda è direttamente proporzionale all’energia e alla frequenza assorbita). L’intensità delle bande invece è espressa in trasmittanza (T) definita come la frazione di luce incidente che attraversa un campione a una data lunghezza d’onda (usato per molecole piccole), oppure in assorbanza (A) la quale rappresenta il logaritmo in base 10 dell'inverso della trasmittanza (usata per le proteine). I picchi degli spettri espressi in T sono rivolti verso il basso mentre, al contrario, quelli espressi in A sono rivolti verso l’alto. T=100% significa che il campione non assorbe quella frequenza.

Tipologie di vibrazione

• Stretching: movimento ritmico di due atomi lungo l’asse di legame, con conseguente aumento e diminuzione della lunghezza del legame e della distanza atomica.
• Bending: è un movimento causato da una variazione dell’angolo di legame con un atomo o da un movimento di un gruppo di atomi rispetto al resto della molecola. La deformazione può essere simmetrica o asimmetrica, nel piano o al di fuori di esso.

I gruppi funzionali e gli atomi in gioco diversi danno risultati diversi, differenza di assorbimento. L’IR ci permette di osservare quei moti vibrazionali che portano una variazione ritmica del momento dipolare di una molecola. Le frequenze di stretching delle molecole possono essere calcolate usando la legge di Hooke di un oscillatore armonico, dove v è la frequenza di vibrazione, c la velocità della luce, la costante di forza del legame e M_x e M_y è la massa degli atomi x e y. Da questa relazione deriva che:

• Il denominatore aumenta all’aumentare della massa degli atomi, di conseguenza la frequenza è, in prima approssimazione, inversamente proporzionale alla massa degli atomi (diminuisce passando da C-H a C-C e da H-O a C-O).
• La frequenza aumenta all’aumentare della differenza di elettronegatività degli atomi coinvolti, F-H ha una frequenza di assorbimento maggiore di C-H pur essendo F più pesante di C, perché l’effetto dell’elettronegatività è prevalente. Sempre dovuto all’effetto di elettronegatività, abbiamo che le frequenze aumentano passando da C-C a C=C.

Effetti dei legami idrogeno

Il legame a idrogeno modifica la frequenza di assorbimento di entrambi i gruppi di atomi coinvolti, in conseguenza a ciò le bande di stretching di X-H e O=C si spostano a frequenze più basse (come se le masse oscillanti aumentassero). Oltre a questo, l’effetto dei legami idrogeno scompare con le diluizioni se questi si instaurano fra due molecole diverse; al contrario, in caso di interazioni intramolecolari, questo non avviene.

Interpretazione di spettri IR

Alcune considerazioni generali:

• Le frequenze di stretching sono generalmente più alte delle corrispondenti frequenze di bending.
• Gli atomi legati all’idrogeno hanno frequenze maggiori rispetto a quando legati ad atomi più pesanti.
• I carboni con tripli legami hanno frequenze maggiori di quelli con doppi legami, i quali hanno frequenze maggiori di quelli con legami singoli.

Dagli spettri IR possiamo ottenere informazioni in merito alla presenza di gruppi funzionali specifici, date le regioni di assorbimento caratteristiche di alcuni di essi. È presente inoltre una regione dello spettro caratteristica della molecola in esame, la regione del fingerprint. Questa regione non dà informazioni sulla natura dei gruppi funzionali presenti, è compresa fra i 1500 cm^-1 e i 500 cm^-1, qui abbiamo la sovrapposizione di tutti i movimenti vibrazionali dello scheletro della molecola (principalmente dovuti a legami singoli C-X). Data la complessità del segnale, è quasi impossibile ricavare informazioni da questa regione, tuttavia proprio grazie alla sua complessità è estremamente improbabile che due molecole diverse diano origine a uno spettro identico. È possibile utilizzare questa regione per l’identificazione univoca delle molecole o per determinare la purezza di un campione in seguito a una reazione, a patto che in banca dati sia presente uno spettro tipico della molecola.

Frequenze di assorbimento tipiche dei principali gruppi funzionali

Alcoli e fenoli

Stretching dei gruppi O-H e C-O. La banda caratteristica degli OH generalmente cade fra i 3650 e i 3580 cm^-1, si può spostare fino a 3200 cm^-1 nel caso si formino legami idrogeno intermolecolari. Anche la forma è caratteristica, abbiamo un picco molto ampio. Se consideriamo il ciclobutanolo vediamo che il gruppo OH genera un segnale molto evidente e dalla forma caratteristica rispetto al CO. Considerando il numero d’onda del segnale possiamo anche dedurre che il composto forma legami idrogeno in quanto che la banda cade a 3330 cm^-1. Confrontandolo con lo spettro del cicloesanolo, se non avessimo la regione del fingerprint potremmo anche pensare che stiamo analizzando lo stesso composto.

Aldeidi e chetoni

Stretching del C=O carbonilico, nel caso delle aldeidi abbiamo anche lo stretching del legame C-H a sinistra della regione dei C-H alifatici (fra 2850 cm^-1 e 2750 cm^-1). Hanno bande di assorbimento molto simili 1740-1720 cm^-1 per le aldeidi e 1725-1705 cm^-1 per i chetoni. La natura degli atomi che il carbonio carbonilico lega cambia le proprietà di stretching del legame C=O. Come vediamo confrontando gli spettri del 2-butanone e del 2-metilpropanale, si riesce a distinguere bene il picco del C-H del gruppo aldeidico dai picchi dei C-H delle catene alifatiche.

Ammine

Stretching di NH banda caratteristica fra 3400 e 3500 cm^-1 e di C-N a 1200-1350 cm^-1. Banda singola per le ammine primarie, doppia a 3420 per le secondarie e nessuna per le terziarie dato che non ci sono legami N-H. Confrontando lo spettro della fenilammina, della dietilammina e dell’N,N-dimetilanilina questo è molto evidente.

Acidi carbossilici e derivati

Stretching di C=O a 1710 cm^-1 e O-H fra 2500 e 3300 (range molto ampio). L’effetto del legame idrogeno è molto determinante perché a concentrazioni sufficienti le molecole dimerizzano. Inoltre, la tendenza a dimerizzare dipende anche dal solvente in cui svolgiamo l’analisi. Si può evitare questo analizzando la forma gassosa, quando possibile, o in solventi organici aprotici. Nel caso di derivati, la banda dell’O-H scompare e al suo posto vediamo le bande caratteristiche dei sostituenti che legano l’ossigeno. Ad esempio, nel caso dell’etilbutirrato, vediamo i picchi caratteristici delle catene alifatiche, mentre nel caso della butirrammide vediamo gli stretching tipici delle ammine monosostituite. Le tecniche IR possono essere usate su campioni in diversi stati della materia, sia che essi siano dispersi in soluzione, in fase gassosa e anche allo stato solido. Questo rende la tecnica molto versatile a differenza di altre.

Importante, la spec IR non è usata per determinare la struttura di un composto ignoto, per questi scopi è meglio l’NMR. L’IR mi dà informazioni aggiuntive per interpretare gli spettri NMR che da solo possono essere troppo complicati e mi lasciano dubbi sulla natura dei legami. Diverso è il caso se ho un’idea della natura del mio composto e devo analizzare la qualità del mio campione in termini di purezza ecc. A volte la combinazione di IR, MS e NMR è indispensabile.

Spettri IR di proteine

La spettroscopia IR ci può fornire informazioni strutturali molto importanti di macromolecole, in particolare possiamo ricavare informazioni sulla struttura secondaria delle proteine. La spettroscopia IR dà molte informazioni che, unite a quelle ottenute da altre tecniche, aiutano nella risoluzione della struttura 3D delle proteine. Inoltre, fornisce indirettamente informazioni su quelle che saranno la struttura terziaria e quaternaria. Questo tipo di analisi è basato sull’analisi di movimenti di stretching e bending che coinvolgono i legami H, in particolare stretching dei CO e bending degli NH. I segnali che ci interessano maggiormente sono le bande di amide I e amide II rispettivamente collegati a CO e NH, chiaramente le bande si riferiscono a tutti i CO e gli NH della proteina. Nel caso di glicosilazioni avremo anche delle bande caratteristiche.

Quando si fa l’analisi IR di una proteina in acqua bisogna acquisire anche lo spettro dell’acqua e sottrarlo a quello del campione contenente acqua + proteina. Guardando solo la sottrazione non si riescono a ricavare molte informazioni, ma facendo la derivata seconda dello spettro ottengo delle componenti altrimenti invisibili. Emergono così componenti dalle quali posso ricavare informazioni specifiche relative alle strutture presenti. Ci sono regioni specifiche per α-eliche e random coil (hanno contributi sovrapposti, se voglio distinguere le une dalle altre devo usare acqua deuterata), β-sheets intramolecolari e β-sheets intermolecolari nel caso di aggregati proteici.

Posso anche studiare la denaturazione della mia proteina. Andando ad aumentare gradualmente la temperatura si viene a perdere la struttura secondaria della proteina e si accumulano aggregati proteici. Acquisendo segnali ad intervalli di tempo stabiliti, posso andare a studiare in che modo la proteina in esame si denatura.

Spettrometria di massa

La spettrometria di massa è una tecnica analitica (normalmente qualitativa) molto sensibile e informativa, tuttavia una delle sue limitazioni principali è che le analisi si fanno su composti gassosi o dopo averli volatilizzati, in alcuni casi questo non è semplice. È una tecnica utile per ricavare informazioni su:

• Massa del composto: in particolare l’MS misura il rapporto massa-carica di un composto in seguito alla sua ionizzazione. Questo implica che le molecole in analisi devono avere una carica, altrimenti non verranno rilevate dalla strumentazione, tuttavia attraverso alcuni accorgimenti possiamo ionizzare i campioni in esame (non tutte le molecole sono facilmente ionizzabili).
• Struttura molecolare: nel processo di ionizzazione, a seconda del tipo di sorgente utilizzata, le molecole vanno incontro a frammentazione. La frammentazione delle molecole avviene in meccanismi precisi, conoscendo le caratteristiche degli ioni originati, posso dedurre quali legami si sono rotti all’interno del composto in esame.
• Formula bruta: utilizzando strumentazioni ad alta risoluzione è possibile ricavare quali e quanti atomi sono presenti nel composto analizzato, da questo è possibile ricavare una misura della sua purezza ma anche una misura del suo grado di saturazione (utile se combinato con le informazioni derivanti da NMR).

La strumentazione è relativamente semplice, generalmente uno spettrometro di massa è composto da tre elementi principali:

• Sorgente di ioni: è la componente nella quale il campione viene introdotto, ionizzato e volatilizzato. A seconda della natura del campione sono disponibili diverse tipologie di sorgenti che si prestano meglio alla ionizzazione e volatilizzazione di determinati composti piuttosto che altri. Strumentazioni più costose e complesse possono montare diverse tipologie di sorgenti per essere adattate a diverse analisi.
• Analizzatore di massa: il compito dell’analizzatore è quello di separare e “ordinare” gli ioni in base al loro rapporto massa-carica mediante l’uso di campi elettromagnetici.
• Rilevatore: misura il valore di un indicatore in modo quantitativo e fornisce i dati per calcolare l’abbondanza di ciascun ione. L’analisi, nel suo complesso, non è quantitativa perché la ionizzazione del campione non avviene con un’efficienza del 100%. Inoltre, se il campione è una miscela di due molecole, una più facilmente ionizzabile dell’altra, questa origina un segnale più forte ma non è detto che sia presente in maggior quantità. Quello che si ottiene è un grafico contenente barre verticali in cui ogni banda rappresenta uno ione con un determinato rapporto massa-carica e la sua abbondanza relativa. Si parla di abbondanza relativa in quanto allo ione maggiormente presente si assegna il valore “100” sul grafico, chiamato picco base, mentre gli altri segnali vengono scalati in funzione di esso.

Qui sopra è riportato lo spettro di massa della CO₂. La ionizzazione causa la frammentazione della molecola originando tre picchi, i quali rappresentano tre ioni molecolari diversi, con CO₂⁺ con m/z=44, O⁺ con m/z=16 e CO⁺ con m/z=28. In questo caso la frammentazione avviene raramente, come mostrano le abbondanze relative degli ioni. In questo caso, essendo z=1, il valore registrato dallo spettrometro è il valore diretto di massa (nel caso di ioni multicarica non è così). Ioni multicarica si formano in presenza di diversi atomi facilmente ionizzabili all’interno della molecola (come nel caso delle proteine), ma anche in funzione del tipo di sorgente utilizzata.

Risoluzione vs sensibilità

Il concetto di risoluzione e di sensibilità quando si parla di tecniche analitiche è fondamentale. La sensibilità è data dalla quantità di campione necessaria per ottenere un segnale apprezzabile (all’interno di una tecnica uno strumento è più sensibile di un altro quando permette di effettuare un’analisi con una quantità di campione inferiore, ordine del picomolare per la massa, segue NMR e infine l’IR). Nel caso della spettrometria di massa, la sensibilità aumenta all’aumentare dell’efficienza di ionizzazione della sorgente. La risoluzione è maggiore quanto più si è in grado di distinguere due picchi A e B, ed è data dalla formula: MR = M/ΔM. Dove M indica il valore di m/z del picco A e ΔM indica il potere risolvente, ovvero la differenza fra i valori di m/z di due picchi B e A. Due picchi adiacenti si dicono separati quando l’altezza della valle tra i due picchi è inferiore al 10% dell’altezza dei picchi. Uno dei problemi principali è dato dal fatto che all’aumentare della massa, diminuisce la percentuale di differenza (distinguere due picchi con massa 100 e 101 è più facile di distinguere due picchi di massa 1000 e 1001 nonostante entrambi differiscono per un’unità di massa). Altra complicazione deriva dal fatto che non tutti gli ioni con lo stesso m/z possiedono la stessa energia cinetica dopo l’accelerazione perché potrebbero avere già una certa quantità di energia cinetica iniziale in uscita dalla sorgente. Se questa differenza è sufficientemente grande si potrebbero considerare i due ioni come se avessero m/z diverse, introducendo un errore sperimentale.