Analisi di biomolecole

PRINCIPALI GRUPPI FUNZIONALI: Alcoli e fenoli

Stretching dei gruppi O-H e C-O. La banda caratteristica degli OH generalmente cade fra i 3650 e i 3580 cm, si può spostare fino a 3200 cm nel caso si formino legami idrogeno intermolecolari. Anche la forma è caratteristica, abbiamo un picco molto ampio. Se consideriamo il ciclobutanolo (in alto) vediamo che il gruppo OH genera un segnale molto evidente e dalla forma caratteristica rispetto al CO. Considerando il numero d'onda del segnale possiamo anche dedurre che il composto forma legami idrogeno in quanto che la banda cade a 3330cm. Confrontandolo con lo spettro del cicloesanolo (in basso), se non avessimo la regione del fingerprint potremmo anche pensare che stiamo analizzando lo stesso composto.

Aldeidi e chetoni

Stretching del C=O carbonilico, nel caso delle aldeidi abbiamo anche lo stretching del legame C-H a sinistra della regione dei C-H alifatici (fra 2850 e 2750cm). Hanno bande di assorbimento molto.

simili 1740-1720 cm per le aldeidi e-11725-1705cm per i chetoni. La natura degli atomi che il carbonio carbonilico legacambia le proprietà di stretching del legame C=O. come vediamo confrontando glispettri del 2-butanone (a sinistra) e del 2-metilpropanale (a destra), si riesce adistinguere bene il picco del C-H del gruppo aldeidico dai picchi dei C-H delle catenealifatiche).Ammine- : stretching di NH banda-1caratteristica fra 3400 e 3500 cm e-1di C-N a 1200-1350 cm . Bandasingola per le ammine primarie,doppia a 3420 per le secondarie enessuna per le terziarie dato che nonci sono legami N-H. Confrontando lospettro della fenilammina, delladietilammina e dell’N,N-dimetilanilinaquesto è molto evidente.Acidi carbossilici e- - derivati -1: stretching di C=O a 1710 cm eO-H fra 2500 e 3300 (range molto ampio)l’effetto del legame idrogeno è moltodeterminate perché a concentrazionisufficienti le molecole dimerizzano. Inoltre,la tendenza a dimerizzaredeterminare la presenza di gruppi funzionali specifici in un composto.interpretare gli spetri NMR che da solo possono essere troppo complicati e mi lasciano dubbi sulla natura dei legami. Diverso è il caso se ho un'idea della natura del mio composto e devo analizzare la qualità del mio campione in termini di purezza ecc.. A volte la combinazione si IR MS e NMR è indispensabile. SPETTRI IR DI PROTEINE La spettroscopia IR ci può fornire informazioni strutturali molto importanti di macromolecole, in particolare possiamo ricavare informazioni sulla struttura secondaria delle proteine. La spettroscopia IR da molte informazioni che, unite a quelle ottenute da altre tecniche, aiutano nella risoluzione della struttura 3D delle proteine. Inoltre, fornisce indirettamente informazioni su quelle che saranno la struttura terziaria e quaternaria. Questo tipo di analisi è basato sull'analisi di movimenti di stretching e bending che coinvolgono i legami H, in particolare stretching dei CO e bending degli NH. I segnali che ciinteressanomaggiormente sono le bande di amide I e amide II rispettivamente collegati a CO e NH,chiaramente le bande si riferiscono a tutti i CO e gli NH della proteina. Nel caso di glicosilazioniavremo anche delle bande caratteristiche.Quando si fa l'analisi IR di una proteina in acqua bisogna acquisireanche lo spettro dell'acqua e sottrarlo a quello del campionecontenente acqua + proteina. Guardando solo la sottrazione non siderivatariescono a ricavare molte informazioni, facendo però laseconda dello spettro ottengo delle componenti altrimenti invisibili.Emergono così componenti dalle quali posso ricavare inormazionespecifiche relative alle strutture presenti, ci sono regioni specifiche perα-eliche e random coil (hanno contributi sovrapposti, se voglio4distinguere le une dalle altre devo usare acqua deuterata), β-sheets intramolecolari e β-sheetsintermolecolari nel caso di aggregati proteici.denaturazione della mia proteinaPosso anche

Studiare la proteina. Andando ad aumentare gradualmente la temperatura si viene a perdere la struttura secondaria della proteina e si accumulano aggregati proteici. Acquisendo segnali ad intervalli di tempo stabiliti, posso andare a studiare in che modo la proteina in esame si denatura.

Spettrometria di massa

La spettrometria di massa è una tecnica analitica (normalmente qualitativa) molto sensibile e informativa, tuttavia una delle sue limitazioni principali è che le analisi si fanno su composti gassosi o dopo averli volatilizzati, in alcuni casi questo non è semplice. È una tecnica utile per ricavare informazioni su:

• Massa del composto: in particolare l'MS misura il rapporto massa-carica di un composto in seguito alla sua ionizzazione. Questo implica che le molecole in analisi devono avere una carica, altrimenti non verranno rilevate dalla strumentazione, tuttavia attraverso alcuni accorgimenti possiamo ionizzare i campioni in esame (non tutte le molecole sono facilmente

Ionizzazione: nel processo di ionizzazione, a seconda del tipo di sorgente utilizzata, le molecole vanno incontro a frammentazione. La frammentazione delle molecole avviene in meccanismi precisi, conoscendo le caratteristiche degli ioni originati, posso dedurre quali legami si sono rotti all'interno del composto in esame.

Formula bruta: utilizzando strumentazioni ad alta risoluzione è possibile ricavare quali e quanti atomi sono presenti nel composto analizzato. Da questo è possibile ricavare una misura della sua purezza ma anche una misura del suo grado di saturazione (utile se combinato con le informazioni derivanti da NMR).

La strumentazione è relativamente semplice, generalmente uno spettrometro di massa è composto da tre elementi principali:

Sorgente di ioni: è la componente nella quale il campione viene introdotto, ionizzato e volatilizzato. A seconda della natura del campione sono disponibili diverse tipologie di sorgenti che

si prestano meglio alla ionizzazione e volatilizzazione di determinati composti piuttosto che altri. Strumentazioni più costose e complesse possono montare diverse tipologie di sorgenti per essere adattate a diverse analisi;

Analizzatore di massa- : il compito dell'analizzatore è quello di separare e "ordinare" gli ioni in base al loro rapporto massa-carica mediante l'uso di campi elettromagnetici;

Rilevatore- : misura il valore di un indicatore in modo quantitativo e fornisce i dati per calcolare l'abbondanza di ciascun ione. L'analisi, nel suo complesso, non è quantitativa perché la ionizzazione del campione non avviene con un'efficienza del 100%. Inoltre, se il campione è una miscela di due molecole, una più facilmente ionizzabile dell'altra, questa origina un segnale più forte ma non è detto che sia presente in maggior quantità.

Quello che si ottiene è un grafico contenente

barre verticali in cui ogni banda rappresenta uno ione con un determinato rapporto massa-carica e la sua abbondanza relativa. Si parla di abbondanza relativa in quanto allo ione maggiormente presente si assegna il valore picco base "100" sul grafico, chiamato picco base, mentre gli altri segnali vengono scalati in funzione di esso.

Qui sopra è riportato lo spettro di massa della CO₂. La ionizzazione causa la frammentazione della molecola originando tre picchi, i quali rappresentano tre ioni molecolari diversi, con m/z=16, con m/z=44 e con m/z=28. In questo caso la frammentazione avviene raramente, come mostrano le abbondanze relative degli ioni CO⁺ e O⁺. In questo caso, essendo z=1, il valore registrato dallo spettrometro è il valore diretto di massa (nel caso di ioni multicarica non è così). Ioni multicarica si formano in presenza di diversi atomi facilmente ionizzabili all'interno della molecola (come nel caso delle proteine), ma anche in

La funzione del tipo di sorgente utilizzata.

Risoluzione vs sensibilità

Il concetto di risoluzione e di sensibilità quando si parla di tecniche analitiche è fondamentale. La sensibilità è data dalla quantità di campione necessaria per ottenere un segnale apprezzabile (all'interno di una tecnica uno strumento è più sensibile di un altro quando permette di effettuare un'analisi con una quantità di campione inferiore, ordine del picomolare per la massa, segue NMR e infine l'IR). Nel caso della spettrometria di massa, la sensibilità aumenta all'aumentare dell'efficienza di ionizzazione della sorgente. La risoluzione è maggiore quanto più si è in grado di distinguere due picchi A e B, ed è data dalla formula: MR= ∆M Dove M indica il valore di m/z del picco A e ΔM indica il potere risolvente, ovvero la differenza fra i valori di m/z di due picchi B e A. Due picchi adiacenti

si dicono separati quando l'altezza della valle tra i due picchi è inferiore al 10% dell'altezza dei picchi. Uno dei problemi principali è dato dal fatto che all'aumentare della massa, diminuisce la percentuale di differenza (distinguere due picchi con massa 100 e 101 è più facile di distinguere due picchi di massa 1000 e 1001 nonostante entrambi differiscono per un'unità di massa). Altra complicazione deriva dal fatto che non tutti gli ioni con lo stesso m/z possiedono la stessa energia cinetica dopo l'accelerazione perché potrebbero avere già una certa quantità di energia cinetica iniziale in uscita da