Appunti di tutte le lezioni di Analisi di biomolecole

Dispensa di analisi di biomolecole

Corso di laurea magistrale in biotecnologie industriali

Prof.ssa Cristina Airoldi

A.A 2019/2020

6 CFU: 42 ore + Esercitazioni (interpretazione spettri, soprattutto NMR identiche a ciò che troveremo nell’esame)

Esame

Scritto:

• 1 esercizio (10 p): ci dà struttura composto e spettri NMR mono e bi dimensionali e dobbiamo assegnare i segnali negli spettri e dirle a che porzione di molecola (a che protoni) appartengono.
• 3 domande di teoria (7 p l’una) su tutte e tre le tecniche.

NB: Devi ricordare i gruppi funzionali delle molecole.

Obiettivo del corso

Di fronte ad uno spettro capire cosa abbiamo di fronte, riuscire ad interpretarlo e NMR riuscire a capire quali sono state le condizioni sperimentali a cui è stato acquisito.

Possibilità di vedere dal vivo spettrometri IR, NMR e di massa, se siamo interessati c’è la possibilità alla fine del corso di andare in questi lab. (non incide su valutazione all’esame).

Le principali metodiche

Le principali metodiche usate per l’identificazione di molecole organiche e la caratterizzazione di biomolecole sono:

• Spettroscopia infrarossa (spettri IR)
• Spettrometria di Massa
• Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (spettro NMR e MRI (Magnetic Resonance Imaging))

NMR e MRI

La spettroscopia NMR la vedremo per quanto concerne le sue applicazioni relative allo studio delle molecole, la teoria che studieremo è la stessa che sta alla base dell’immaging, cambiano solo i metodi tramite i quali vengono acquisiti gli spettri. Con l’NMR l’obbiettivo è quello di dare informazioni conformazionali e strutturali su molecole di grosse e piccole dimensioni; MRI obiettivo è ricreare immagini utilizzate a scopo diagnostico; i principi sono gli stessi. (non vedremo MRI).

Differenze tra spettroscopia e spettrometria

Spettrometria: di massa; in generale è la misura di uno spettro (anche IR e NMR sono spettrometrie), l’obbiettivo non è quello di valutare come le proprietà chimico-fisiche vengono modulate dall’interazione con la luce.

Spettroscopia: spettroscopia infrarossa (IR), spettroscopia NMR; si basano sull’osservazione di ciò che accade a seguito dell’interazione tra spettro elettromagnetico e materia. Utilizziamo una radiazione elettromagnetica (luce, in un range ben preciso), irraggiamo il nostro campione e osserviamo ciò che accade a seguito di questa interazione. Osservando ciò che succede a seguito di questa interazione possiamo derivare delle proprietà chimico-fisiche specifiche del campione.

Regioni dello spettro elettromagnetico

Le regioni dello spettro elettromagnetico che interessano le due spettroscopie sono:

• IR: raggi infrarossi
• NMR: onde radio

È importante considerare l’energia associata a queste radiazioni:

• Le onde radio hanno lunghezza d’onda maggiore rispetto alle altre
• Lunghezza d’onda più elevata = minore energia, tutte le altre tecniche utilizzando onde elettromagnetiche a molto più alta energia, questo è importante rispetto l’NMR per quanto riguarda le sue applicazioni a livello diagnostico.

Quando il campione sottoposto a radiazioni è il nostro organismo, è importante utilizzare delle radiazioni che lo sottopongono alle radiazioni meno energetiche possibili. Le conseguenze sulle molecole organiche del sottoporre il campione a onde radio sono minime, irrilevanti, dopo la misura NMR posso tranquillamente recuperare il campione e sarà intatto. (anche i raggi X sono utilizzati a scopo diagnostico ma sono onde a più alta energia, molto pericolose, non si possono fare tutti i giorni)

Raggi infrarossi e onde radio

I raggi infrarossi a contatto con un organismo danno una sensazione di calore, non producono danni a composti organici e alla materia ma sono più energetici rispetto alle onde radio.

La quantità di energia trasferita durante la misura influisce sulle caratteristiche di queste due tecniche spettroscopiche. Per quanto riguarda visibile e ultravioletto ricordiamo che sono più energetiche (in termini di energia trasferita alla materia), rispetto a infrarosso e onde radio, infatti UV possono provocare anche danni alla materia. Ci sono in gioco transizioni che riguardano gli elettroni (elettroni mobili, π).

Nell’IR le transizioni che facciamo avvenire riguardano legami chimici, non li rompiamo, ma li facciamo ruotare e vibrare. (vibro-rotazioni legami chimici)

Nell’NMR facciamo avvenire transizioni energetiche che riguardano i nuclei atomici, osserviamo delle transizioni che riguardano gli spin atomici.

Studiando l'interazione tra radiazione elettromagnetica e materia del campione, deriviamo informazioni chimico-fisiche sul nostro campione. In IR informazioni sulla natura dei legami chimici che ho all’interno della molecola e sui gruppi funzionali che ho nel campione. In NMR ricaverò dettagli di informazioni strutturali sul composto maggiori, osservo i nuclei per avere una fotografia di tutti i nuclei presenti nel campione.

Spettroscopia infrarossa (IR)

Utilizza i raggi infrarossi (4000-400 cm^-1). Quando sentiamo parlare di IR possiamo imbatterci in una suddivisione dello spettro elettromagnetico di questa regione in tre sotto-regioni:

• Vicino IR
• Medio IR
• Lontano IR

La regione che ci interessa per fare spettroscopia IR è quella compresa fra 10000 e 100 cm^-1. L’unità di misura cm^-1, non è una lunghezza d’onda che si misura in metri ma è il numero d’onda, è l’inverso della lunghezza d’onda, è una frequenza espressa in una unità di misura meno usuale.

Quando lavoro al di sotto dei 100 cm^-1 trasferisco alla materia una quantità di energia che consente che avvengano delle rotazioni degli atomi, e di conseguenza dei legami chimici, in queste condizioni faccio la spettroscopia rotazionale.

NB: l’assorbimento di qualsiasi tipo di radiazione magnetica da parte della materia è sempre quantizzato, la materia assorbe quel quanto di energia che gli consente di far avvenire una transizione energetica, se la radiazione non trasporta quella esatta quantità di energia, quella specifica transizione energetica non avviene, ne avverranno altre. Quindi lo spettro rotazionale rende conto dell’assorbimento di quanti di energia ed è costituito da righe separate.

Spettroscopia vibro-rotazionale

Se lavoro tra 100 e 10000 cm^-1 trasferisco alla materia una quantità maggiore di energia, quindi oltre a far ruotare i legami li faccio anche vibrare. Anche in questo caso la quantità di energia che la materia assorbe è sempre quantizzata ma mentre i legami vibrano ho anche rotazione. Ogni moto vibrazionale di un legame sottende n. moti rotazionali dello stesso legame. Quindi nonostante la quantità di energia che assorbo sia quantizzata, non avrò delle righe nello spettro vibro-rotazionale ma avrò delle bande di assorbimento.

Nello spettro IR avrò:

• In ascissa la misura della quantità di energia che sto utilizzando (espressa in numero d’onda, cm^-1).
• In ordinata avrò una misura della quantità di energia assorbita dal campione, in termini di trasmittanza o di assorbanza.

• Trasmittanza: I₀/I rapporto fra l’intensità della radiazione elettromagnetica assorbita dal campione e l’intensità della radiazione che ho usato (luce incidente che attraversa il campione)
• Assorbanza: log₁₀ (1/T) il logaritmo in base 10 dell’inverso della trasmittanza.

Per tradizione gli spettri delle molecole organiche di piccole dimensioni vengono rappresentati e riportati in termine di trasmittanza, i picchi di assorbimento vibro-rotazionale saranno quindi negativi (rivolti verso il basso).

Analisi qualitativa dei composti organici

Possiamo associare una determinata banda di assorbimento alla presenza di uno specifico legame all’interno della molecola. Motivo per cui la spettroscopia IR è l’analisi qualitativa dei composti organici e possiamo utilizzarla con lo scopo di scoprire la natura degli atomi all’interno di una molecola. Per identificare la natura dei legami in una molecola sfruttiamo il fatto che alcune specifiche proprietà nei moti di stretching e di bending delle molecole stesse vengono misurati a seconda della natura o dello stato nei quali di trova il campione, ad esempio una molecola coinvolta in legami idrogeno.

Il legame a idrogeno

Possono essere legami idrogeno intermolecolari o intra-molecolari. Due molecole appartenenti alla stessa specie che formano legami idrogeno tra di loro (es. gli acidi carbossilici, COOH, legame con OH, possono fungere da accettori o donatori di un idrogeno, quando metti un acido carbossilico in soluzione ad una concentrazione sufficiente per cui due molecole hanno un’alta probabilità di formare legami a idrogeno, gli acidi si troveranno in forma dimerica, non monomerica). Avere un legame C=O libero, piuttosto che l’O del doppio legame impegnato in ponti idrogeno, a sua volta legato ad un altro eteroatomo (x), dà un effetto analogo a quello che c’è quando si ha una variazione delle masse relative degli atomi coinvolti nel legame (azoto, ossigeno, carbonio) a idrogeno stesso, quindi la formazione di legami a idrogeno ha come effetto quello di far variare la costante di forza di questi due legami. L’effetto complessivo è quello di cambiare le frequenze (numero d'onda) alle quali risuonano, abbiamo assorbimento, sia del legame H-eteroatomo, sia C=O. Il cambiamento del numero d’onda di questi legami può essere caratteristico è diagnostico della formazione di legami idrogeno, ci dà una informazione aggiuntiva non solo sulla natura dei legami ma ci dice anche se la nostra molecola è in soluzione o se impegnata nella formazione di strutture dimeriche, o la formazione di strutture secondarie nelle proteine.

Applicazione dell'IR

La prima applicazione dell’IR è l’identificazione della presenza di specifici gruppi funzionali all’interno di un composto organico, ma esistono applicazioni più avanzate che ci consentono di studiare anche le proteine.

Che informazioni possiamo trarre analizzando lo spettro IR?

• Possiamo derivare la presenza di specifici gruppi funzionali sulla base della presenza di specifiche bande di assorbimento sullo spettro, le quali per forma e numero d’onda alle quali cadono sono molto caratteristiche dei diversi gruppi funzionali.
• Altra informazione che si può dedurre è l’impronta digitale (finger print) di un determinato composto, questa regione difficilmente ci dà informazioni sul composto, non è la regione da guardare se vogliamo sapere quali gruppi funzionali abbiamo, perché c’è un’elevata sovrapposizione. Inoltre, ci cadono stretch di bending che non sono così caratteristici ed è difficile distinguere i diversi legami. È una regione di impronta digitale perché la combinazione dei modi di bending dei vari legami presenti nella molecola porta lo spettro IR in questa regione ad avere un aspetto estremamente conservato per ogni composto indipendentemente dalle condizioni sperimentali a cui viene effettuata la misura. Ad esempio, se variassi la concentrazione potrebbe esserci uno spostamento delle bande di assorbimento pur essendo lo stesso campione, invece in quella regione dello spettro c’è una elevata conservazione e posso utilizzarla per identificare univocamente un composto. (importante quando si utilizza l’IR con scopo di controllo di qualità). L’altra regione varia tanto perché è più soggetta alle condizioni sperimentali alle quali viene fatta la misura.

Questi diagrammi ci riportano quali sono le principali regioni in cui abbiamo stretching e bending nelle varie tipologie di legami. Sulla base di questi legami posso riconoscere bande di assorbimento caratteristiche.

Alcoli e fenoli

Caratterizzati dal legame O-H e C-O.

• È lo stretching del legame OH quello più caratteristico. Non possiamo riconoscere un alcol piuttosto che un fenolo sulla base di questa banda, questa ci dice solo che c’è un legame OH.
• Stretching O-H: 3650 a 3580 cm^-1 ma può variare sempre con la presenza di legami ad idrogeno, che si possono formare tra due molecole di analita di soluto o tra soluto e solvente. Questo tipo di assorbimento è quindi soggetto a variazioni anche in base a che tipo di solvente stiamo utilizzando.

Ciclobutanolo (alcol): bande panciute, allargate=legame OH in quel range di numero d’onda.

Cicloesanolo (analizzato in forma di film liquido): ci indica la presenza di gruppi OH coinvolti nella formazione di legami a idrogeno, perché altrimenti la banda di assorbimento sarebbe stata a numeri d’onda molto più alti. Guardando gli spettri IR di questi due campioni potrei dire che, data la forma della banda allargata, del numero d’onda, potrei dire che questi composti hanno gruppi OH. Potrei identificarli sulla base del fingerprint, ma non sulla base di questa banda.

Aldeidi e chetoni

Legame caratteristico C=O

• Aldeidi: stretching C=O: 1740-1720 cm^-1
• Hanno anche legame C-H, stretching del legame C-H dovuto alla natura degli atomi legati al carbonio carbonilico, due bandine a 2850-2750 cm^-1 a destra della regione dei C-H alifatici.
• Chetoni: stretching C=O: 1725-1705 cm^-1 Assenza di bandine C-H aldeidico.

Poi anche il legame C=O può essere coinvolto nella formazione di legami idrogeno, possono esserci quindi variazioni legate a questi legami.

2-butanone (chetone)

Questa è un’aldeide. In generale le bande C=O sono molto più sottili rispetto alla banda allargata degli OH, e cambia la regione di stretching. Se una molecola ha tanti C=O la banda potrebbe essere più larga.

Amine

-NH, CN

• Stretching N-H: 3400-3500 cm^-1 (molto vicina a OH ma non è perfettamente sovrapponibile, OH in assenza di legami a idrogeno è più spostata verso i 3600, inoltre le bande NH sono meno pronunciate, più strette, a punta; quindi di solito è semplice distinguere questi due tipi di legami in caso di ammine primarie 2 bande, secondarie 1 banda, terziarie nessuna perché non ho legami N-H.
• Stretching C-N: 1200-1350 cm^-1

Guardiamo quello che c’è in blu, si riferisce ai moti di stretching: ci saranno dei legami a idrogeno perché le bande sono più basse. Visto che è un’ammina primaria avrò due bande di stretching. I legami che fa l’azoto non sono planari, c’è un doppietto libero sull’atomo di azoto. Ammina secondaria, ho una banda sola e non molto pronunciata. Ammina terziaria mai stretching caratteristico.

Acidi carbossilici e derivati

Legame COOH, quindi:

• Stretching O-H: 2500-3300 cm^-1 ricordiamo il contributo del legame a idrogeno è determinante rispetto allo stretching del legame OH degli acidi carbossilici, che cade in una regione diversa rispetto a quella degli alcoli.
• Stretching C=O: 1710 cm^-1 sovrapposizione con chetoni.

Quando la concentrazione è sufficiente gli acidi carbossilici sono in forma dimerica. Sia C=O che OH sono coinvolti in legame a idrogeno, che in questo caso è doppio: il C=O di una molecola fa legame a idrogeno con l’OH dell’altra; è un legame debole, non covalente e quindi reversibile ma cooperativo, quindi la somma di più legami dello stesso tipo ne aumenta la forza di legame, che però non cresce in un numero proporzionale al numero di legami idrogeno che ho, ma il legame cooperativo rende il legame molto più stabile.

IR misurato in un solvente organico: non può fare legami a idrogeno, quindi se esistono sono solo intramolecolari. Stretching dell’OH diverso da quello degli alcoli (la banda non è più panciuta, ma è molto sottile e a punta) e a numeri d’onda molto più bassi.

Spettro della sostanza precedente in forma di film liquido (non c’è diluzione, c’è solo il composto). Spettro diverso nella regione degli OH.

Spettro stessa molecola in fase gassosa: stretching OH spostato verso frequenze più alte, che non fa legami idrogeno. Forma più simile al segnale di un’ammina piuttosto che a quello di un OH. La variazione delle condizioni sperimentali varia l’aspetto che lo spettro può assumere. In questo caso non ci aspettiamo di vedere l’OH.

Questa è un’ammide quindi ci aspettiamo di vedere anche gli stretching del NH. Le misure IR possono essere fatte con il campione che si trova in diversi stadi della materia (composto disciolto in soluzione, in fase gassosa, in film liquido), tecnica molto versatile, costa molto meno e possono essere studiati tutti i campioni. Non dà però informazioni precise e approfondite come le altre tecniche. L’IR non è la tecnica che utilizziamo dato un composto ignoto per determinarne la funzione, a questo scopo la prima tecnica da utilizzare è l’NMR, l’IR mi può dare informazioni a supporto di quelle che ottengo dalle altre. Se lo spettro NMR non è esaustivo, posso fare altre analisi per ottenere più informazioni. Se invece so cosa sto maneggiando, ho una idea su quale sia la natura del campione, oppure devo controllare l’identità, posso farlo tramite l’IR.

IR di proteine

L’IR ci può fornire informazioni conformazionali e strutturali sulle proteine. Studiare la struttura secondaria delle proteine non ci dà direttamente accesso alla struttura terziaria delle proteine, ma ci permette di...