Allestimento di un preparato istologico e microscopia

Processo di preparazione del campione per l'inclusione in microscopia

In seguito, il campione viene chiarificato per immersione in una soluzione di solventi organici (xilolo o toluolo), che prendono il posto degli alcol e allo stesso tempo sono buoni solventi per la paraffina (chiarificazione). Dopodiché, il tessuto, così processato, è pronto per essere infiltrato con un mezzo di inclusione che, dopo solidificazione, conferirà al tessuto la giusta consistenza per ottenere sezioni sottilissime. I mezzi di inclusione che si utilizzano in microscopia sono in genere mezzi di natura idrofoba, privi di affinità per l'acqua, come la paraffina. La paraffina è una miscela di idrocarburi saturi che diventa fluida se riscaldata (58°), mentre solidifica a temperatura ambiente. Il campione viene immerso dunque in paraffina fusa in un apposito contenitore e, completata la fase di infiltrazione, viene lasciato solidificare a temperatura ambiente. Il campione a questo punto presenta la consistenza idonea per essere tagliato.inclusione come la gelatina o la colla. Una volta che le sezioni sono state adagiate sul vetrino, vengono sottoposte a diverse fasi di colorazione e montate con un coprioggetto per proteggerle. Le sezioni ottenute con il microtomo sono fondamentali per l'analisi istologica, in quanto permettono di osservare al microscopio le diverse strutture dei tessuti. Grazie a questa tecnica, è possibile studiare le cellule, i vasi sanguigni, le fibre nervose e molti altri elementi che compongono i tessuti del nostro corpo. L'utilizzo del microtomo è quindi di fondamentale importanza per gli studi di istologia e patologia, consentendo di ottenere sezioni sottili e dettagliate dei tessuti da analizzare.

montaggioadesivo.La fissazione chimica non è l'unica che possiamo utilizzare: infatti in situazioni particolari, qualora ad esempio fosse necessarioanalizzare in breve tempo frammenti di tessuto espiantati nelle sale chirurgiche, non è possibile effettuare la lunga proceduraappena descritta, quindi il frammento verrà congelato immergendolo in una soluzione di azoto liquido, che raggiungetemperature di -194°. Questo congelamento rapido evita che i cristalli, formatisi durante il passaggio di stato dell'acqua,principale componente dei tessuti, danneggino la cellula e i vari componenti citologici, cosa che invece avverrebbe sesottoponessimo i tessuti a un congelamento a temperature superiori e con modalità non così veloci.Il tessuto viene poi sezionato tramite un microtomo, definito criostato, in cui la temperatura è mantenuta intorno ai -20°;pertanto il tessuto, pur non essendo infiltrato con la paraffina, assume la durezza

Necessaria per essere sezionato dalle lame inserite nella camera del criostato. Questo ci consentirà di allestire delle sezioni, mediante le quali potremo studiare le caratteristiche morfologiche dei diversi tessuti. Le sezioni sottoposte al taglio mediante criostato hanno generalmente un'ospessore maggiore.

La colorazione. Le sezioni di tessuto tagliate al microtomo sono così sottili da risultare praticamente trasparenti. Si rende perciò necessario colorare il preparato per poterne osservare i particolari al microscopio ottico, ma, poiché nella microscopia la maggior parte dei coloranti è idrosolubile, è necessario rimuovere dal campione il mezzo di inclusione, dunque la paraffina, e reidratarlo (reidratazione) per evitare che questo possa interferire con la colorazione. La sezione dunque viene deparaffinata, per immersione in xilolo, e reidratata per immersione in una serie di soluzioni acquose contenenti concentrazioni di alcol decrescenti. A questo

punto la sezione di tessuto viene posta su un vetrino, ed è pronta per essere immersa nel colorante scelto. Dopodiché, per rendere la colorazione permanente, stabile e duratura nel tempo, dovremo applicare uno specifico collante (una resina), che viene interposto tra il vetrino in cui è presente la sezione, definito vetrino porta-oggetto, e un vetrino che viene posto al di sopra, definito come vetrino copri-oggetto. Il collante solidifica col tempo e questo ci permette quindi di avere preparati duraturi che possono essere osservati anche con il passare del tempo.

Una tra le più comuni tecniche di colorazione utilizzata in anatomia è quella che prevede l'utilizzo di ematossilina e di eosina, due coloranti che hanno caratteristiche opposte. L'ematossilina è un colorante basico, che colora tutte le strutture acide della cellula in viola-blu, come il nucleo che contiene il DNA e l'RNA immerso nel citoplasma, qualora le cellule

Osservate sono coinvolte in un'intensa attività di sintesi proteica (assumono per questo motivo il nome di cellule basofile). Vengono definite cellule acidofile invece quelle cellule che non presentano un'intensa attività di sintesi proteica e per questo il loro citoplasma sarà colorato di rosa, a causa dell'eosina, un colorante acido che colora tutte le strutture basiche.

Le sezioni dovranno essere analizzate mediante strumenti specifici che sono i microscopi, i più comuni nei laboratori istologici sono i microscopi ottici di cui naturalmente abbiamo diverse tipologie. Infatti, oltre al microscopio ottico tradizionale in campo chiaro, esistono anche altri tipi di microscopio ottico, come il microscopio a contrasto di fase, il microscopio a contrasto di interferenza differenziale, il microscopio in campo scuro, il microscopio a fluorescenza, ecc. Questi microscopi si servono di sistemi di luci particolari per mettere in evidenza particolari.

strutture.
Le sezioni di tessuto non sottoposte a ulteriore processazione e non colorate potranno essere osservate con microscopi in campo chiaro e, come vedete nella prima immagine, le caratteristiche citologiche più fini saranno lungi dall'essere osservate.
Possiamo identificare nell'immagine un compartimento più interno che va a definire il nucleo e il protoplasma cellulare sarà costituito da tutto ciò che sta al di fuori del nucleo e che viene circondato da strutture che delimitano il citoplasma.
L'osservazione della stessa cellula, se svolta con microscopi ottici con contrasto di fase o con contrasto di interferenza differenziale in campo scuro, non risulta arricchita da ulteriori informazioni rispetto a prima. Questo pone il problema dello studio delle componenti citologiche più fini, stesso problema che possiamo avere nell'ambito di colture cellulari osservate in vivo. L'unico modo per superare il problema è sottoporrei tessuti a colorazione.

Le colorazioni che utilizziamo si avvalgono di coloranti che possiamo classificare in base alla composizione chimica:
- coloranti basici: tra i più importanti vi sono il blu di toluidina, blu di metilene, ematossilina e azzurro B; essi colorano le strutture cellulari acide, e per questa ragione, l'affinità di tali componenti cellulari per il colorante basico viene detta basofilia.
- coloranti acidi: tra i più importanti vi sono eosina, alizarina, trypan blu e blu pirrolo; essi colorano le strutture cellulari basiche, le quali sono appunto affini ai coloranti acidi. Questa affinità prende il nome di acidofilia.
- coloranti neutri: i più importanti sono rosso neutro e verde janus; hanno caratteristiche intermedie tra i coloranti basici e quelli acidi.

Nel momento in cui sottoponiamo i tessuti a colorazione, si è soliti considerare le colorazioni semplici, definite come tecniche che fanno uso di un solo colorante. Talvoltainvece è necessario utilizzare coloranti in combinazione tra loro, e si parla per questo di colorazione tricromica. Se il colorante reagisce con un solo tipo di struttura allora la colorazione sarà ortocromatica, se invece un colorante reagisce con più tipi di strutture virando il proprio colore allora si parla di colorazione metacromatica. A tal riguardo infatti, è necessario ricordare che alcuni coloranti basici, quando interagiscono con particolari strutture nei tessuti, cambiano il loro colore normale da blu a rosso o porpora. Tipico esempio è fornito dalla colorazione col blu di toluidina, che in soluzione è blu-violetto, mentre quando entra in contatto con particolari strutture le colorerà in porpora/rosso. La metacromasia è dovuta alla presenza all'interno dei tessuti di polianioni, che causano l'aggregazione delle molecole di colorante, le quali, organizzate così in dimeri o polimeri, modificano le proprie.di lenti oculari, attraverso le quali l'osservatore può guardare l'immagine ingrandita del campione. Il braccio esterno può essere regolato in altezza per adattarsi alla posizione dell'osservatore. Il microscopio ottico può essere dotato di obiettivi di diversi ingrandimenti, che permettono di ottenere immagini più dettagliate del campione. Gli obiettivi sono montati su un revolver, che consente di selezionare l'obiettivo desiderato semplicemente ruotando il revolver. Un'altra tipologia di microscopio molto utilizzata è il microscopio elettronico. Questo tipo di microscopio utilizza un fascio di elettroni al posto della luce per illuminare il campione. Grazie alla minore lunghezza d'onda degli elettroni rispetto alla luce, il microscopio elettronico permette di ottenere immagini ad altissima risoluzione. In conclusione, l'utilizzo dei microscopi è fondamentale per l'osservazione dei tessuti. Il microscopio ottico è il più comune e semplice da utilizzare, mentre il microscopio elettronico permette di ottenere immagini ad altissima risoluzione.

di lenti (nel caso di microscopi binoculari), che permettono l'ingrandimento e l'osservazione del campione riposto nel vetrino fino ad un massimo di 10x. Dopodiché vi sono gli obiettivi, i quali sono montati su un revolver, un supporto girevole, che consente di cambiare facilmente l'obiettivo scelto. Gli obiettivi che utilizzeremo durante le esercitazioni sono 4x, 10x, 20x e 40x. In realtà l'ingrandimento totale è dato dal prodotto tra l'ingrandimento della lente oculare e quello dell'obiettivo (con l'obiettivo da 10x, si avrà un ingrandimento complessivo di 100 volte).

Esistono diversi tipi di microscopi ottici, quelli più evoluti prevedono che l'immagine possa essere raccolta per l'osservazione da parte dell'operatore ma, nel frattempo, possa anche essere rilevata da una videocamera che poi andrà a trasferire l'immagine su uno schermo digitale in modo tale da essere visualizzata.

eventualmente possa essere salvata e, magari, manipolata successivamente migliorandola attraverso tecniche specifiche.

Il potere risolutivo è la distanza minima al di sotto della quale non siamo più in grado di vedere due punti come distanti tra