Allestimento di un preparato istologico e microscopia

Allestimento di un preparato istologico

Per poter osservare un campione al microscopio, è necessario che il preparato venga opportunamente allestito attraverso alcune procedure standard. I preparati che vengono dati agli studenti affinché li osservino al microscopio ottico sono per la maggior parte rappresentati da sezioni di tessuti fissati in formalina, inclusi in paraffina e colorati con EE.

La fissazione

È il primo processo che viene attuato per conservare a tempo indeterminato un tessuto e preservare la sua morfologia, la sua struttura e la sua situazione biochimica. È un trattamento fisico o chimico che permette di preservare la struttura del tessuto per i successivi trattamenti. Il campione dovrebbe essere immerso nel fissativo immediatamente dopo esser stato rimosso dal corpo. La fissazione ha il ruolo di bloccare il metabolismo cellulare; prevenire la degradazione delle cellule o dei tessuti a opera di enzimi litici presenti nei tessuti stessi (autolisi); uccidere eventuali microrganismi patogeni, come batteri, funghi o virus, che potrebbero degradare il campione; rendere duro il tessuto attraverso il cross-linking (formazione di legami crociati tra molecole) o la denaturazione delle proteine.

Tra i vari mezzi di fissazione, possiamo annoverare mezzi fisici, tra cui il congelamento, e mezzi chimici, tra cui gli alcoli (alcol metilico o alcol etilico, usati in modo inferiore) e gli aldeidi (gliceraldeide e formaldeide, in particolare il fissativo più comune è la formalina, una soluzione acquosa di formaldeide che viene impiegata a varie diluizioni), che impediscono i processi di degradazione cellulare e assicurano la conservazione. Per poter fissare un campione, è necessario che questo sia ridotto in piccoli frammenti affinché i mezzi di fissazione possano penetrare nel preparato con una maggiore velocità.

L'inclusione

Una volta ridotto e fissato, il campione necessita di essere permeato da un mezzo di inclusione, che, una volta indurito, gli consenta di essere ridotto ancora in frammenti più piccoli dell’ordine dei micrometri (μm). Il tessuto fissato però è, di per sé, troppo soffice per permettere un taglio netto e preciso, dunque l'inclusione viene preceduta da altre pratiche.

In particolare, prima di poter includere il tessuto nel mezzo, essendo questo di natura idrofoba, è necessario rimuovere tutta l’acqua con un processo di disidratazione. Inizialmente il campione fissato viene quindi lavato e disidratato mediante immersione in una serie di soluzioni acquose contenenti concentrazioni crescenti di alcol fino ad arrivare al 100% per rimuovere l’acqua, in cui la paraffina (mezzo di inclusione) non è solubile.

In seguito, il campione viene chiarificato per immersione in una soluzione di solventi organici (xilolo o toluolo), che prendono il posto degli alcol e allo stesso tempo sono buoni solventi per la paraffina (chiarificazione). Dopodiché, il tessuto, così processato, è pronto per essere infiltrato con un mezzo di inclusione che, dopo solidificazione, conferirà al tessuto la giusta consistenza per ottenere sezioni sottilissime. I mezzi di inclusione che si utilizzano in microscopìa sono in genere mezzi di natura idrofoba, privi di affinità per l’acqua, come la paraffina. La paraffina è una miscela di idrocarburi saturi che diventa fluida se riscaldata (58°), mentre solidifica a temperatura ambiente. Il campione viene immerso dunque in paraffina fusa in un apposito contenitore e, completata la fase di infiltrazione, viene lasciato solidificare a temperatura ambiente.

Il campione a questo punto presenta la consistenza idonea per essere tagliato in sezioni che hanno uno spessore di circa 3-10 μm (taglio). Per eseguire il taglio, si può utilizzare un microtomo, e tra questi, il meno comune, presente nei vecchi laboratori di istologia, è il cosiddetto microtomo a slitta: questo strumento è costituito da una lama mobile e da un compartimento nel quale viene posto il blocchetto di paraffina, il quale sarà poi soggetto al taglio man mano che l’operatore muove la lama su di esso. Dal punto di vista della sicurezza questa tipologia non era il massimo, dunque venne pian piano sostituita da un’altra più sicura, il microtomo rotativo, in cui il blocchetto di paraffina, contenuto in un braccio mobile, viene mosso dall’operatore mediante una manovella che consente di farlo avanzare verso la lama fissa consentendo così di ottenere sezioni sottili. Le sezioni del blocchetto vengono via vai adagiate su un supporto di vetro (il vetrino), a cui aderiscono grazie a un mezzo di montaggio adesivo.

La fissazione chimica non è l’unica che possiamo utilizzare: infatti in situazioni particolari, qualora ad esempio fosse necessario analizzare in breve tempo frammenti di tessuto espiantati nelle sale chirurgiche, non è possibile effettuare la lunga procedura appena descritta, quindi il frammento verrà congelato immergendolo in una soluzione di azoto liquido, che raggiunge temperature di -194°. Questo congelamento rapido evita che i cristalli, formatisi durante il passaggio di stato dell’acqua, principale componente dei tessuti, danneggino la cellula e i vari componenti citologici, cosa che invece avverrebbe se sottoponessimo i tessuti a un congelamento a temperature superiori e con modalità non così veloci. Il tessuto viene poi sezionato tramite un microtomo, definito criostato, in cui la temperatura è mantenuta intorno ai -20°; pertanto il tessuto, pur non essendo infiltrato con la paraffina, assume la durezza necessaria per eseguire le sezioni.