9 Crioconservazione: conservazione di gameti, gonadi ed embrioni tramite congelamento

Crioconservazione

La crioconservazione del seme e degli ovociti risulta necessaria in numerosi casi, come per esempio:

• Nel caso in cui il giorno della fecondazione assistita il partner maschile non può essere presente per un qualsiasi motivo;
• Oppure nel caso in cui la paziente, ad esempio, deve sottoporsi a terapie come chemio e radio-terapia. In questo caso, quindi, si conservano gli ovociti per dare speranza di avere una gravidanza successivamente, dato che questo tipo di terapie danneggiano anche gli ovociti, divenendo così causa di infertilità femminile.

La crioconservazione consente di mantenere cellule e tessuti in uno stato vitale, utilizzando temperature criogeniche (-196°C). Durante il congelamento delle cellule (in questo caso degli spermatozoi o delle cellule uovo), si formano cristalli di ghiaccio sia intra che extra citoplasmatici. La formazione di cristalli di ghiaccio nel mezzo di coltura determina un richiamo di acqua dall'interno delle cellule verso l'esterno, provocando una riduzione del volume cellulare; la formazione di cristalli di ghiaccio nell'ambiente cellulare non causa stress osmotici (cioè non provoca movimenti di acqua), ma al momento dello scongelamento, questi cristalli intra-citoplasmatici possono apportare danni alla membrana cellulare e agli organelli cellulari con conseguente morte della cellula stessa.

Essendo la cellula uovo di dimensioni più grandi rispetto allo spermatozoo, i cristalli di ghiaccio che si formano nel citoplasma della cellula uovo sono più grossi rispetto a quelli che si formano all'interno dello spermatozoo anche perché la cellula uovo è molto più ricca di acqua (e, quindi, di citoplasma) rispetto allo spermatozoo. Per evitare, quindi, che le cellule esposte a basse temperature subiscano danni irreversibili che ne possono provocare la morte, è necessario seguire specifiche procedure. Ad esempio, è bene utilizzare delle sostanze ad azione crio-protettrice.

Crio-protettori

I crio-protettori si distinguono in due classi in base alla loro capacità di attraversare le membrane cellulari: alcuni, come glicerolo, etilen-glicole, 1,2-propan-diolo, e DMSO (Di-Metil-SolfOssido), penetrano nella cellula, altri come il saccarosio, rimangono nell'ambiente extracellulare. Tutti i crio-protettori capaci di attraversare la membrana sono iperosmotici, deidratano la cellula, perché la loro presenza nel mezzo di coltura richiama acqua verso l'esterno, riducendo la massa d'acqua che potrebbe trasformarsi in ghiaccio; successivamente, quando penetrano nella cellula, si sostituiscono all'acqua, che è stata precedentemente persa, per evitare una perdita di turgore da parte della cellula, la quale perdita potrebbe essere dannosa per la cellula stessa.

Essendo la permeabilità all'acqua dell'oolemma più elevata rispetto alla permeabilità a qualsiasi ACP intracellulare, inizialmente l'efflusso di acqua non è bilanciato da un equivalente influsso di ACP. Ciò genera una rapida riduzione e un successivo più lento recupero del volume cellulare. Inoltre, la presenza di agenti crio-protettori determina la riduzione della temperatura di congelamento dell'acqua, evitando, quindi, la formazione di grossi cristalli di ghiaccio e favorendo, di conseguenza, la formazione di cristalli di ghiaccio più piccoli. In questo modo si riducono, ad esempio, i danni della membrana e degli organuli che potrebbero essere causati al momento dello scongelamento da parte di cristalli di ghiaccio troppo grandi.

Tipi di protocollo di crioconservazione

Si possono utilizzare due tipi fondamentali di protocollo di crioconservazione: un protocollo per il congelamento lento e uno per la vitrificazione.

Congelamento lento

In questo caso, le cellule o i tessuti sono inseriti in una soluzione acquosa contenente una concentrazione compresa tra 1,0 e 1,5 M di crio-protettore permeabile alla membrana, che determina una prima fase di deidratazione. Una seconda fase di deidratazione si verifica in seguito all'esposizione ad una miscela contenente lo stesso ACP (agente crio-protettore) intracellulare e un ACP extracellulare, quest'ultimo solitamente costituito dal saccarosio o un altro oligosaccaride. Per questo, successivamente al primo ACP, si aggiunge anche saccarosio in concentrazione pari a 0,1 M.

La miscela risultante viene inserita solitamente in provette, chiamate provette cryotube (o criovial), opportunamente etichettate, con tappo a vite esterno: sono provette fatte di un materiale resistente a basse temperature e sono dotate di un tappo a vite (come quello delle bottiglie di acqua) e non a pressione come le normali provette per evitare che, in seguito al congelamento, possano scoppiare. Le provette vengono, poi, avvolte con cotone e riposte in una scatola di polistirolo con pareti spesse 1 o 2 cm. A questo punto vengono poste in freezer, dove, per evitare un eccessivo shock termico, il raffreddamento avviene con relativa lentezza e la temperatura, quindi, viene fatta scendere lentamente di 0,3-0,5°C al minuto.

Raggiunta una temperatura compresa tra -6°C e -8°C viene indotta la nucleazione del ghiaccio, cioè la formazione di cristalli di ghiaccio extracellulari, toccando il mezzo.