8. Diagnosi preimpianto: analisi morfologica (time lapse) e genetica dell'embrione (rt-pcr; sequenziamento enzimatico; pirosequenziamento; minisequencing; fish; array-cgh

STRUTTURA TETRAEDRICA

Raggiunto lo stadio di 16 cellule (morula), bisogna valutare se è realmente avvenuto il processo di compattazione (che inizia allo stadio di 8 cellule). Se è avvenuto non sarà più possibile distinguere in modo netto ogni singola cellula; se non è avvenuto saranno visibili perfettamente le singole cellule.

EMBRIONE A 8 CELLULE EMBRIONE ALLO STADIO DI COMPATTAZIONE NON MOSTRA SEGNALI 16 CELLULE (MORULA) IN CUI DELL'AVVENUTA E' AVVENUTA LA COMPATTAZIONE COMPATTAZIONE

Sarà molto importante, una volta raggiunto lo stadio di morula, monitorare anche la formazione della cavità blastocelica. Durante la formazione di questa cavità si possono distinguere i seguenti stadi:

1. Blastocisti cavitaria: quando la cavità blastocelica è superiore al 50% del volume totale;
2. Blastocisti espansa: quando la cavità blastocelica si allarga, definendo l'embrione vero e proprio, costituito dalla massa cellulare.

interna e uno stratosingolo di cellule disposto esternamente, noto come trofoblasto (o anche cometrofectoderma);

Hatchin blastocist: cioè quando viene rotta la membrana di fecondazione;

Hatched blastocist: la blastocisti si è liberata completamente della membranadi fecondazione.

La massa cellulare interna deve avere un aspetto denso e compatto. Dal punto di vistamorfologico, la massa cellulare interna può variare dall’essere molto grande concellule strettamente impacchettate a quasi inesistente con cellule legate in modolasso. La massa cellulare interna è stata suddivisa in 3 categorie in base all’aspettomorfologico: la migliore categoria (ICM1) contiene molte cellule strettamenteraggruppate; la categoria ICM2 è quella intermedia, che è composta da diverse celluleche sono connesse in modo approssimativo; la peggiore categoria (ICM 3) descriveuna massa cellulare interna che contiene pochissime cellule che sono vagamenteunite.

Diversi studi hanno evidenziato una correlazione positiva tra l'aspetto morfologico dell'ICM e l'esito clinico, con l'ipotesi che maggiore è l'ICM, maggiori sono le possibilità di successo dell'impianto. Il trofoblasto è valutato e classificato con lo stesso criterio della massa cellulare interna.

La valutazione morfologica dell'embrione rappresenta il criterio di selezione maggiormente utilizzato per identificare l'embrione con più possibilità di impianto, anche se per effettuare tale valutazione è necessario osservare gli embrioni a tempi stabiliti (solitamente una volta al giorno), ma soprattutto esporli, al di fuori dell'incubatore, a condizioni non ideali per il loro sviluppo. Questo tipo di osservazione, però, fornisce informazioni riguardanti lo stadio dello sviluppo in cui l'embrione si trova nel momento dell'osservazione. Quindi, non si è in grado di sapere se le

modifiche di transizione, avvenute durante il passaggio da uno stadio precedentemente osservato e il successivo, siano avvenute in modo corretto. Per avere delle informazioni più dettagliate, minuto per minuto, e per evitare di estrarre gli embrioni dall'incubatore, è stata sviluppata una tecnica, nota come time-lapse. La coltura embrionale in time-lapse (in italiano, "intervallo di tempo") permette mediante l'utilizzo di apposite telecamere, incorporate direttamente nell'incubatore, un'osservazione continua del tempo di divisione delle cellule che costituiscono l'embrione, dalla fecondazione dell'uovo fino allo stadio di blastocisti (giorno 5° o 6° di sviluppo). La tecnologia time-lapse possiede il grande vantaggio dunque di consentire l'osservazione di tutte le fasi della replicazione delle cellule di ogni singolo embrione e di scattare fotografie a intervalli di tempo regolari. Le immagini raccolte vengono immediatamente

Elaborate da un software in modo da permettere sia la costruzione di un filmato, che non è altro che la storia dello sviluppo di ciascun embrione, sia una classificazione automatica degli embrioni, sulla base di elementi di cinetica di sviluppo e non di morfologia, evidenziando quelli con una più alta probabilità di impianto. Infine questo sistema ha la grande peculiarità di essere non invasivo, di evitare cioè la rimozione degli embrioni dall'incubatore e quindi di non sottoporli a cambiamenti di temperatura o fluttuazioni di pH. Un esempio di microscopio invertito digitale compatto e progettato per essere collocato all'interno di incubatori tradizionali piccoli o grandi prende il nome di Prime Vision.

GENETICA PRE-IMPIANTO (PGD) -> DIAGNOSI

La PGD è una tecnica in evoluzione che fornisce un'alternativa pratica alla diagnosi prenatale e alla cessazione della gravidanza per le coppie che sono a rischio sostanziale di trasmettere una grave

malattia genetica alla loro prole. Questo approccio è accompagnato da numerosi vantaggi: riduce la morte dell'embrione dovuta, ad esempio, ad aneuploidie; riduce la possibilità di avere un figlio con malattie genetiche; riduce l'interruzione di gravidanza qualora si accerti un'anomalia genetica o cromosomica con la diagnosi prenatale, ed evita quindi l'aborto. La diagnosi genetica pre-impianto può essere effettuata sul globulo polare, ottenendo informazioni solo per quanto riguarda il DNA materno; oppure questa diagnosi può essere eseguita su un blastomero prelevato dall'embrione, il quale prelievo è effettuato solitamente su embrioni fino allo stadio di 8 cellule (più difficile è il prelievo di blastomeri da embrioni con più cellule). Questa biopsia, però, può causare danni all'embrione. Di conseguenza, questi danni potrebbero influire sull'impianto embrionale. Un altro svantaggio

Il vantaggio della PGD è rappresentato dal fatto che questa diagnosi può rilevare solo malattie genetiche relative all'embrione esaminato. Un recente studio ha messo in evidenza come ovociti appartenenti a donne giovani siano ancora in grado di recuperare un certo grado di DNA paterno danneggiato. La cromatina può essere, infatti, rimodellata da fattori citoplasmatici materni durante la fase del differenziamento, in modo tale da silenziare ed attivare zone specifiche del DNA.

La biopsia di un blastomero è estremamente difficile se si utilizzano embrioni compatti, quindi, embrioni con più di otto cellule. Per questo motivo la biopsia di un blastomero si effettua al terzo giorno. Talvolta è preferibile prelevare due blastomeri anziché uno a causa della eventuale presenza di mosaicismi, cioè potrebbe succedere che alcune delle cellule presentano un'anomalia cromosomica o genetica, mentre nelle altre cellule questo non è accaduto; oppure

Potrebbe avvenire una nondisgiunzione di una coppia di cromosomi omologhi durante gli eventi mitotici e quindi prenderanno vita cellule con un cromosoma in più e cellule prive di quel cromosoma. Quindi, ad esempio, prelevando una sola cellula potrebbe non riscontrarsi alcuna alterazione genetica dal momento che questa non è stata interessata da mutazioni; prelevando, quindi, due cellule la probabilità di incorrere in un falso negativo è di gran lunga ridotta. A proposito di mosaicismo, inoltre, è bene ricordare che tutte le femmine, sebbene non presentino alcuna mutazione genetica, sono dei mosaici dal momento che alcune cellule hanno il cromosoma X paterno inattivo, mentre altre disattivano il cromosoma X di origine materna.

La tecnica di prelievo dei blastomeri consiste nel praticare un foro nella zona pellucida, parete che avvolge l'ovocita e l'embrione fino allo stadio di blastocisti, mediante agenti chimici (come l'acido Tyrode) o

mediante l'azione di un raggio laser, mantenendo l'embrione fermo con una pipetta di fissaggio (holding). Il terzo giorno dopo la fecondazione, l'embrione è solitamente allo stadio di 6-8 cellule (cleavage stage embryo). Il prelievo eseguito allo stadio di 2 o 4 cellule è stato abbandonato, perché la riduzione della massa totale dell'embrione in modo così drastico comprometteva lo sviluppo successivo. Attraverso l'apertura creata nella zona pellucida si introduce una micro-pipetta di vetro da biopsia, e si aspirano delicatamente uno o due cellule (blastomeri) che vengono poi rilasciati nel terreno di coltura. Per evitare la contaminazione con spermatozoi che potrebbero essere attaccati alla zona pellucida, si preferisce utilizzare embrioni derivanti dalla fecondazione tramite ICSI. Recentemente è stata spostata l'attenzione sulla blastocisti come fonte per il prelievo dei blastomeri da utilizzare nella PGD. Esistono

Tuttavia, pochissimi dati sulle analisi dablastocisti e, sebbene siano state riportate nascite dopo biopsia allo stadio diblastocisti, attualmente la procedura è da ritenersi sperimentale.

La blastocisti, che si forma a partire dal sesto giorno dopo la fecondazione, contiene da 100 a 300 cellule. Il prelievo di cellule in questa fase è potenzialmente molto utile alla diagnostica, in quanto è possibile prelevare un discreto numero di cellule (da 5 a 6) senza creare problemi allo sviluppo successivo dell'embrione. Inoltre, dato che con la biopsia si prelevano cellule del trofoectoderma (o detto trofoblasto), la massa delle cellule interne, che darà origine al feto nelle fasi successive, non è danneggiata, con indiscussi vantaggi biologici ed etici.

La biopsia viene effettuata praticando un foro, con la tecnica precedentemente descritta, ed aspirando le cellule con una pipetta di biopsia. La perforazione della ZP, in questo caso, avviene esclusivamente mediante laser.

Un metodo di maggior precisione, perché nella blastocisti lo spessore della ZP è diminuito a causa dei processi di espansione e altri metodi potrebbero danneggiare l'embrione riducendo le probabilità di sviluppo.

Con la diagnosi genetica pre-impianto si possono evidenziare difetti di un singolo gene su cromosomi autosomici o sessuali (come per esempio, il difetto del gene CF che causa la fibrosi cistica). Queste mutazioni possono essere ereditate con modalità autosomica dominante, autosomica recessiva e X-linked.

La PGD può evidenziare ripetizioni di triplette (come, ad esempio, nel caso della sindrome dell'X fragile causata proprio da una ripetizione di circa 200 volte della tripletta CGG nel gene FMR1 localizzato sul cromosoma X, mentre normalmente il numero delle triplette CGG dovrebbe essere intorno a 50; una presenza di triplette CGG sopra i 200 causa ritardo mentale, iperattività, aggressività, ritardo nel linguaggio, macrorchidismo.

viso lungo e stretto è quello che presenta una forma allungata e sottile. In questo caso, è possibile utilizzare alcuni trucchi di make-up per bilanciare le proporzioni del viso. Ad esempio, è consigliabile evitare di allungare ulteriormente il viso con acconciature o tagli di capelli troppo lunghi. È preferibile optare per tagli più corti o medi, che creino volume ai lati del viso. Inoltre, è possibile utilizzare il trucco per creare l'illusione di un viso più largo. Ad esempio, si può applicare un blush o un bronzer sulle guance, sfumando verso le tempie, per creare un effetto di profondità e larghezza. Inoltre, si può utilizzare un rossetto o un gloss di colore intenso sulle labbra, per attirare l'attenzione verso il centro del viso. Infine, è possibile utilizzare accessori come occhiali da sole o cerchietti, che creino un effetto di larghezza e bilancino le proporzioni del viso.