8. Diagnosi preimpianto: analisi morfologica (time lapse) e genetica dell'embrione (rt-pcr; sequenziamento enzimatico; pirosequenziamento; minisequencing; fish; array-cgh

Diagnosi pre-impianto

Prima di impiantare l’embrione ottenuto è bene effettuare una diagnosi (detta, appunto, diagnosi pre-impianto). La diagnosi pre-impianto prende in considerazione sia le caratteristiche morfologiche che genetiche dell’embrione.

Morfologica dell’embrione

Gli ovociti normalmente fecondati devono essere sferici, avere due corpi polari e due pronuclei. I pronuclei devono essere approssimativamente delle stesse dimensioni e posizionati centralmente nel citoplasma. Normalmente i pronuclei sembrano essere di dimensioni simili, sebbene il pronucleo femminile può essere leggermente più piccolo. Se i due pronuclei differiscono significativamente in dimensioni o se appaiono frammenti potrebbero essere indice di anomalie cromosomiche. La presenza di pronuclei con un diametro inferiore rispetto al normale, in seguito a fecondazione assistita, potrebbe indicare che la fecondazione è avvenuta tardi a causa, eventualmente, della inadeguata maturazione dell’ovocita scelto.

Potrebbe succedere che l’uovo fecondato appaia caratterizzato da più di due pronuclei e questo potrebbe essere dovuto a errori durante l’estrusione del globulo polare secondario, che, appunto, non viene trascinato nello spazio perivitellino. Per quanto riguarda la morfologia del citoplasma dello zigote, sappiamo che un normale zigote, come un normale ovocita, deve presentare un citoplasma omogeneo. La presenza di una trans-lucenza citoplasmatica periferica nell’ovocita fecondato (noto come alone), o la presenza di detriti nello spazio perivitellino non hanno dimostrato di essere un valore prognostico per l’impianto, cioè non permettono di fare previsioni relative all’efficienza della fasi di impianto.

La presenza nel citoplasma di piccoli vacuoli (o meglio vescicole) apparentemente pieni di liquido e trasparenti non sono stati associati a conseguenze biologiche rilevabili, ma alcune preoccupazioni possono sorgere quando ci sono tanti vacuoli con anomalie morfologiche. Grandi vacuoli in cellule uovo fecondate possono interferire con i piani di clivaggio (cioè con la segmentazione).

Durante i processi di segmentazione dell’embrione si possono formare delle strutture anucleate, costituite cioè da citoplasma circondato da membrana plasmatica, ma prive di nucleo. Questo è un processo chiamato frammentazione. Il grado di frammentazione è più spesso espresso come la percentuale del volume citoplasmatico totale. Il grado relativo di frammentazione è definito lieve se questi corpi anucleati occupano un volume minore del 10% rispetto al volume dell’embrione totale; moderato se i corpi anucleati occupano un volume compreso tra il 10 e il 25% rispetto al volume totale dell’embrione; grave se i corpi anucleati occupano un volume maggiore del 25% rispetto al volume totale dell’embrione.

Tre visuali diverse di uno stesso embrione allo stadio di 4 cellule in cui è possibile osservare la presenza di piccoli corpi anucleati che occupano un volume di circa il 25% del volume totale. Quindi si ha una frammentazione moderata.

Un altro parametro da tener conto prima di procedere con l’impianto è rappresentato dalle dimensioni dei blastomeri. Le dimensioni dei blastomeri di una blastocisti a 2, 4 e 8 cellule devono essere uguali tra loro. Nel caso dei mammiferi la segmentazione avviene in modo asincrono. Significa che il primo piano di segmentazione che è un piano mediano (cioè parallelo all’asse animale vegetativo) divide lo zigote iniziale in due blastomeri uguali, ciascuno dei quali eredita la polarità animale-vegetativa dello zigote. Poi solo uno dei due blastomeri viene diviso, mentre l’altro salta un ciclo.

Un blastomero, quindi, viene diviso da un ulteriore piano mediano (quindi, ancora una volta parallelo all’asse animale-vegetativo) con conseguente formazione di due blastomeri che ereditano la polarità dal blastomero madre. Quindi si avrà per un breve arco di tempo uno stadio a 3 cellule. In questo caso i blastomeri avranno per forza dimensioni diverse: ci saranno, infatti, due blastomeri più piccoli e uno più grande. Sarà quest’ultimo a subire ora la divisione attuata da un piano equatoriale, cioè perpendicolare all’asse animale vegetativo. Da questa divisione, data la disposizione del piano di clivaggio, si formano due blastomeri aventi dimensioni uguali tra loro, ma uno erediterà dal blastomero di origine citoplasma per lo più animale e l’altro erediterà dal blastomero di origine citoplasma per lo più vegetativo. In questo stadio l’embrione è composto da 4 cellule che sono tutte uguali tra loro.

Continuando con queste divisioni asincrone si formerà un embrione allo stadio di 5 cellule, in cui due sono più piccole e 3 più grandi e così via. Quindi, i blastomeri devono avere stesse dimensioni quando l’embrione si trova negli stadi in cui è composto da un numero pari di cellule; mentre si potrebbero osservare blastomeri con dimensioni diverse negli stadi intermedi. Inoltre bisogna anche specificare che i piani di segmentazione devono essere disposti come appena descritto. Se non sono disposti in questo modo si formeranno embrioni detti “trifogli” (o non tetraedrici).

A proposito della disposizione dei piani di segmentazione è bene ricordare anche che la loro disposizione dipende molto dalla disposizione del fuso mitotico: infatti il solco di clivaggio deve essere sempre perpendicolare al fuso mitotico.

Raggiunto lo stadio di 16 cellule (morula), bisogna valutare se è realmente avvenuto il processo di compattazione (che inizia allo stadio di 8 cellule). Se è avvenuto non sarà più possibile distinguere in modo netto ogni singola cellula; se non è avvenuto saranno visibili perfettamente le singole cellule.

Sarà molto importante, una volta raggiunto lo stadio di morula, monitorare anche la formazione della cavità blastocelica. Durante la formazione di questa cavità si possono distinguere i seguenti stadi:

• Blastocisti cavitaria: quando la cavità blastocelica è superiore al 50% del volume totale;
• Blastocisti espansa: quando la cavità blastocelica si allarga, definendo l’embrione vero e proprio, costituito dalla massa cellulare interna e uno strato singolo di cellule disposto esternamente, noto come trofoblasto (o anche come trofectoderma);
• Hatching blastocist: cioè quando viene rotta la membrana di fecondazione;
• Hatched blastocist: la blastocisti si è liberata completamente della membrana di fecondazione.

La massa cellulare interna deve avere un aspetto denso e compatto. Dal punto di vista morfologico, la massa cellulare interna può variare dall’essere molto grande con cellule strettamente impacchettate a quasi inesistente con cellule legate in modo lasso. La massa cellulare interna è stata suddivisa in 3 categorie in base all’aspetto morfologico: la migliore categoria (ICM1) contiene molte cellule strettamente raggruppate; la categoria ICM2 è quella intermedia, che è composta da diverse cellule che sono connesse in modo approssimativo; la peggiore categoria (ICM3) descrive una massa cellulare interna che contiene pochissime cellule che sono vagamente unite. Diversi studi hanno evidenziato una correlazione positiva tra l’aspetto morfologico dell’ICM e l’esito clinico, con l’ipotesi che maggiore è l’ICM, maggiori sono le possibilità di successo dell’impianto.

Il trofoblasto è valutato e classificato con lo stesso criterio della massa cellulare interna. La valutazione morfologica dell'embrione rappresenta il criterio di selezione maggiormente utilizzato per identificare l'embrione con più possibilità di impianto, anche se per effettuare tale valutazione è necessario osservare gli embrioni a tempi stabiliti (solitamente una volta al giorno), ma soprattutto esporli, al di fuori dell’incubatore, a condizioni non ideali per il loro sviluppo. Questo tipo di osservazione, però, fornisce informazioni riguardanti lo stadio dello sviluppo in cui l’embrione si trova nel momento dell’osservazione.

Quindi, non si è in grado di sapere se le modifiche di transizione, avvenute durante il passaggio da uno stadio precedentemente osservato e il successivo, siano avvenute in modo corretto. Per avere delle informazioni più dettagliate, minuto per minuto, e per evitare di estrarre gli embrioni dall’incubatore, è stata sviluppata una tecnica, nota come time-lapse. La coltura embrionale in time-lapse (in italiano, "intervallo di tempo") permette mediante l’utilizzo di apposite telecamere, incorporate direttamente nell’incubatore, un'osservazione continua del tempo di divisione delle cellule che costituiscono l'embrione, dalla fecondazione dell’uovo fino allo stadio di blastocisti (giorno 5^o o 6^o di sviluppo).

La tecnologia time-lapse possiede il grande vantaggio dunque di consentire l’osservazione di tutte le fasi della replicazione delle cellule di ogni singolo embrione e di scattare fotografie a intervalli di tempo regolari. Le immagini raccolte vengono immediatamente elaborate da un software in modo da permettere sia la costruzione di un filmato, che non è altro che la storia dello sviluppo di ciascun embrione, sia una classificazione automatica degli embrioni, sulla base di elementi di cinetica di sviluppo e non di morfologia, evidenziando quelli con una più alta probabilità di impianto. Infine questo sistema ha la grande peculiarità di essere non invasivo, di evitare cioè la rimozione degli embrioni dall’incubatore e quindi di non sottoporli a cambiamenti di temperatura o fluttuazioni di pH. Un esempio di microscopio invertito digitale compatto e progettato per essere collocato all’interno di incubatori tradizionali piccoli o grandi prende il nome di Prime Vision.

Genetica pre-impianto (PGD)

La PGD è una tecnica in evoluzione che fornisce un’alternativa pratica alla diagnosi prenatale e alla cessazione della gravidanza per le coppie che sono a rischio sostanziale di trasmettere una grave malattia genetica alla loro prole.