8.Alberi filogenetici e metodi di costruzione di un albero

Alberi filogenetici

La filogenesi molecolare studia l’evoluzione delle specie a partire da dati molecolari. A partire dagli allineamenti multipli si possono costruire gli alberi filogenetici. Un albero filogenetico è un albero genealogico col quale si cerca di ricostruire la storia evolutiva delle sequenze che si stanno esaminando.

Un albero filogenetico, più propriamente, è un grafico formato da nodi e da rami. Un nodo può rappresentare un gene, una proteina, una popolazione, a seconda del tipo di analisi che si sta conducendo, e i rami rappresentano la connessione evolutiva tra i diversi nodi. Al ramo può anche essere associata una lunghezza proporzionale alla distanza evolutiva dei due nodi connessi. I nodi possono essere esterni, nel quale caso sono anche definiti OTU (Operational Tassonomic Units), oppure interni. I nodi esterni rappresentano le sequenze moderne, mentre i nodi interni rappresentano gli antenati che hanno dato origine alle sequenze moderne. Nel caso in cui da un nodo discendano più di due rami si parla di politomia. Un albero senza politomie si dice completamente risolto (o si parla semplicemente di dicotomia).

Da un punto di vista grafico, in un albero filogenetico, i rami sono le linee mentre i nodi sono i punti in cui le linee (i rami) si dividono a formare due o più rami (linee):

Nodi esterni e nodi interni

Gli alberi possono essere con o senza radice. Ad esempio, quello mostrato sopra è senza radice. La radice rappresenta l’organismo o il gene ancestrale da cui tutti gli altri organismi o geni discendono. Di seguito è riportato un esempio di albero filogenetico dotato di radice:

Un albero filogenetico in cui la lunghezza dei rami non è proporzionale alla distanza evolutiva è detto cladogramma; al contrario del cladogramma, un filogramma (o albero additivo) è dotato di rami la cui lunghezza è proporzionale alla distanza evolutiva tra i nodi. Un albero filogenetico che si rispetti è dotato di radice e per ogni ramo è specificato il valore della lunghezza del ramo stesso.

Nella filogenesi si evita di considerare geni codificanti proteine perché è facile scambiare ortologhi con paraloghi. Come geni di riferimento vengono prese alcune sequenze nucleotidiche conservate e molte sequenze mitocondriali non codificanti. Questi ultimi hanno più vantaggi perché:

• Sono presenti in più copie per cellula quindi sono più facili da studiare;
• Non vanno incontro a ricombinazione;
• Sono di solo origine materna.

Le sequenze mitocondriali usate per studi filogenetici sono:

• 12S e 16S, perché sono non codificanti e hanno zone in cui si accumulano mutazioni;
• Citocromo b;
• Citocromo c;
• D-loop: tratto molto variabile che può essere utilizzato per lo studio della genetica di popolazione.

Le sequenze nucleiche che vengono utilizzate per studi filogenetici sono:

• 18S, 28S e 5.8S;
• ITS1 e ITS2;
• Istione H1, perché è molto variabile.

Solitamente, per studi filogenetici sull’uomo si usano geni mitocondriali o geni del cromosoma Y, perché NON sono soggetti a meccanismi di riparazione, differentemente da quanto accade per il restante DNA. Perciò, i geni mitocondriali hanno un tasso di mutazione anche 10 volte maggiore rispetto a quello del restante DNA. Viene usato anche il citocromo perché, pur essendo un gene codificante, ha zone altamente variabili che accumulano mutazioni. Quando si prende in considerazione l’rRNA per studi filogenetici, bisogna tenere a mente che le mutazioni non sono importanti perché si accumulano nelle regioni a doppia elica delle anse senza modificare la struttura dell’rRNA stesso e senza modificare la sua funzione.

Metodi per la costruzione degli alberi basati sulle matrici di distanze

UPGMA metodo

Uno dei primi metodi che venne sviluppato per la costruzione di alberi filogenetici fu il metodo UPGMA. Questo si basa sull’utilizzo delle matrici di distanza. Per descrivere l’algoritmo, esaminiamo il caso di sei sequenze, A, B, C, D, E ed F, la cui matrice delle distanze è stata già calcolata:

Supponiamo di avere i seguenti valori all’interno della matrice delle distanze:

In pratica, il programma cerca due sequenze che hanno la più bassa distanza tra tutte le sequenze della matrice. In questo caso, le due sequenze che hanno la più piccola distanza sono le sequenze A e B. Quindi queste vengono raggruppate come di seguito:

A nodo B

Quindi ora vengono ricalcolate le distanze e in particolare vengono ricalcolate le seguenti distanze: D_A,B-C (cioè la distanza di A,B da C), D_A,B-D (cioè la distanza di A,B da D), D_A,B-E (cioè la distanza di A,B da E) e D_A,B-F (cioè la distanza di A,B da F). Quindi si procederà in questo modo:

• D_A,B-C = (D_A-C + D_B-C)/2 = (4+4)/2 = 4
• D_A,B-D = (D_A-D + D_B-D)/2 = (6+6)/2 = 6
• D_A,B-E = (D_A-E + D_B-E)/2 = (6+6)/2 = 6
• D_A,B-F = (D_A-F + D_B-F)/2 = (8+8)/2 = 8

Quindi la matrice di distanza diventa:

Ora si continua con la costruzione dell’albero: si cercano altre due sequenze nella matrice di distanza ricalcolata che abbiano la minore distanza. Dalla matrice esemplificativa sopra riportata si nota che la sequenza D e la sequenza E hanno una distanza con valore pari a 4, cioè un valore più piccolo rispetto a tutte le altre distanze. Quindi le due sequenze dette vengono unite in modo analogo alle sequenze A e B:

D nodo E

La matrice delle distanza diventa:

Se guardiamo la matrice riportata sopra, la distanza minima ora intercorre tra A,B e C. Quindi consideriamo che la sequenza C si diparte da un nodo dal quale si diparte il nodo che a sua volta si divide per dare le sequenze A e B:

A nodo B nodo C

Ricalcolando la matrice si avrà:

La distanza più piccola è 6, quindi sono più somiglianti le sequenze D,E con le sequenze A,B,C. Quindi l’albero diventerà:

Rimane solo la sequenza F. Aggiungendola all’albero, considerando sempre la matrice delle distanze, si avrà:

Neighbor joining metodo

Il metodo detto neighbor joining è quello utilizzato da Clustal ed è basato anch’esso sulla matrice di distanza. Questo metodo produce, a partire da un insieme di sequenze, l’albero che risponde al principio della minima evoluzione (o massima parimonia), cioè l’albero che ipotizza il percorso evolutivo più breve tra le OTU che stiamo analizzando. Il metodo è euristico e non esaustivo. All’inizio del procedimento si dispongono le sequenze in un albero a stella, in cui si assume che non ci sia alcun raggruppamento: tutte le sequenze sono equidistanti ed equivalenti. Supponiamo di avere cinque sequenze, A, B, C, D ed E; l’albero a stella risulta come quello riportato di seguito:

L’albero a stella iniziale ha uno score S₀. Questo punteggio è calcolato come la somma di tutti i rami: S₀ = L_a + L_b + L_c + L_d + L_e

Abbiamo detto che anche questo, come il metodo UPGMA, si basa sull’utilizzo della matrice delle distanze. Supponiamo di avere quindi una matrice come quella riportata di seguito:

Il punteggio S₀ che viene assegnato all’albero a stella relativo a questa matrice è: S₀ = (10 + 39 + 39 + 41 + 41 + 41 + 43 + 18 + 20 + 22) / 4 = 78,50

Il programma, poi, sceglie due sequenze più simili tra loro (cioè quelle con la distanza più piccola).